HPV6型L2N120E7E6融合蛋白基因、表达载体、方法、菌株和用途

摘要

本发明提供一种编码HPV 6型L2N120E7E6融合蛋白的基因、表达载体、方法、菌株和用途。本发明利用原核表达载体，将人乳头瘤病毒(HPV)6型L2N端120个氨基酸、E7蛋白、E6蛋白融合，并根据融合蛋白的氨基酸序列构建出其编码基因。本发明成功设计了HPV6型L2N120E7E6融合蛋白编码基因，并成功构建了高表达HPV6型L2N120E7E6融合蛋白的表达载体和转化菌株，该融合蛋白具有强的免疫源性，可诱发特异性T细胞免疫反应，能明显推迟小鼠成瘤时间，并有20％的小鼠肿瘤生长受到完全抑制。本发明可用于预防和治疗HPV6型感染及相关疾病，如生殖器疣。

说明书

技术领域

本发明属于医学生物技术领域。具体地，本发明涉及一种表达人乳头瘤病毒(HPV)6型L2N120E7E6融合蛋白的基因、表达载体、方法和免疫治疗及预防用途。 

背景技术

生殖器疣(Genital Wart，GW)是目前世界上发病率很高的性传播疾病之一。虽然GW一般不会导致死亡，但是会使患者产生心理阴影，并带来昂贵的治疗费用。目前治疗GW的方法主要有：抗增殖药物、冷冻疗法、损毁性疗法、免疫调节剂等，这些方法引起的不适应症和疣复发很常见，没有从根本上使疾病治愈，这就需要寻找更为有效的免疫预防和治疗GW的方法。 

GW与人乳头瘤病毒(Human Papillomavirus，HPV)感染的密切关系早已明确，HPV感染是其主要的致病因子。HPV是一组嗜上皮组织的小双链DNA病毒，目前已发现100多个型别，其中50种与生殖器感染有关，可通过性接触传播。HPV具有严格的种属特异性和组织特异性，仅感染人的皮肤和粘膜上皮，引起上皮的增生性改变。临床上根据其致病性分为高危型和低危型，前者能诱发宫颈上皮组织的不良性增生甚至宫颈癌变，后者可引起生殖器周尖锐湿疣和喉部的乳头瘤，其中引起生殖器疣的以HPV-6、HPV-11型为主。 

有证据表明，宿主的免疫应答，尤其是细胞免疫应答水平，是影响HPV相关疾病形成的主要因素。体液免疫应答产生的中和抗体能够抑制HPV的感染和进一步扩散，细胞免疫应答能够清除HPV感染的细胞以及相关的肿瘤细胞。 

HPV的生活周期决定其最小程度将病毒抗原暴露于免疫系统的特性，故与其他病毒相比，HPV感染激发的人体免疫应答很弱。在GW治疗中发 现，在大多数免疫功能健全的患者中，自然或医源性因素导致病灶免疫原暴露于免疫系统后，邻近的疣体能够消退。这提示能够利用疫苗来激发机体的免疫系统，以达到预防和治疗GW的目的。 

HPV预防性和治疗性疫苗早在九十年代初就已经在开始研制。目前预防性疫苗已取得了重要进展，其免疫策略主要集中在如何诱发出针对HPV相关表位的高滴度中和抗体来预防感染。在这方面，以HPV衣壳蛋白L1，L2为靶抗原的病毒样颗粒(virus-like particles，VLPs)，在动物实验和临床试验中均表现出良好的预防HPV感染的效果。其中较为成功的有Merck公司的HPV16/18/6/11四价疫苗Gardasil和GSK公司的HPV16/18二价疫苗Cervarix.，二者已分别于2006年和2008年被美国FDA批准进入市场。 

治疗性疫苗，特别是低危型治疗性疫苗的研究较少，进展也相对缓慢，治疗性疫苗主要通过诱发机体产生针对病毒抗原的细胞免疫，从而清除被病毒感染的细胞及相关病灶。由于HPV早期蛋白E6，E7在病毒生活周期及相关肿瘤组织中持续存在，已经成为了多数治疗性疫苗选择的靶抗原。各种以E6、E7蛋白为靶抗原的治疗性疫苗在动物实验上均表现出良好的细胞免疫反应。 

GSK研制的HPV6型L2E7治疗性疫苗在Ⅱ期临床中证实对感染HPV6型的生殖器疣(GW)有一定的治疗效果。该HPV6型L2E7蛋白为HPV6型L2全长基因与E7基因融合，L2全长蛋白只能诱导较弱的体液免疫和细胞免疫反应，全长的L2蛋白(459个氨基酸)与E7蛋白融合形成的结构可能影响了E7蛋白(98个氨基酸)在细胞内的水解，从而影响到E7蛋白的T细胞表位的有效呈递。 

因此，还需要开发新的有强的免疫效果的治疗及预防生殖器疣的疫苗。 

发明内容

下面详细讨论本发明各种技术方案的制备和使用，但应该理解，本发明提供了许多适用的发明构思，其可以体现在各种各样的具体方面上。 

为有助于理解本发明，下面定义了一些术语。本文定义的术语具有本发明相关领域的普通技术人员通常理解的含义。术语可用于说明的具体实例的一般类别，但它们的使用不限制本发明，权利要求中所概括的除外。 

除非另外指出，本文所述的“HPV”是指人乳头瘤病毒(Human papillomavirus)； 

除非另外指出，本文所述的“bp”是指碱基对(base pair)； 

除非另外指出，本文所述的“ELISPOT”是指酶联免疫斑点(Enzyme-linked immunospot)； 

除非另外指出，本文所述的“ICS”是指胞内细胞因子染色(Intracellular Cytokine Staining)； 

除非另外指出，本文所述的“IPTG”是指异丙基硫代-β-D半乳糖苷(Isopropylthio-β-D-galactoside)； 

除非另外指出，本文所述的“SDS-PAGE”是指十二烷基磺酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(Sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis)； 

除非另外指出，本文所述的“HRP”是指辣根过氧化物酶(Horseradishperoxidase)； 

除非另外指出，本文所述的“IFN-γ”是指γ-干扰素(Interferon gamma)； 

除非另外指出，本文所述的“PBS”是指磷酸盐缓冲液(Phosphatebuffered saline)； 

近期发表的临床研究资料表明人体内E6蛋白的T细胞免疫原性强于E7蛋白。对HPV6型而言，由于其转化活性较低，病毒基因不会发生整合，其L1、L2在肿瘤(疣)形成期亦能持续表达；且L2与L1相比，前者诱发中和抗体的空间结构依赖性较小，因而其作为前导蛋白具有更大的基因容量。另外，对多种其他型别HPV的研究发现，L2的线性中和表位主要集中在前120个氨基酸区段。故在本发明中，为了获得高的蛋白表达量及强的免疫原性，选择将HPV6型的L2N(1-360bp)、E7、E6三个基因片段融合并在原核表达系统中进行表达，纯化后的融合蛋白能诱发强的体液免疫反应和E7与E6特异性T细胞免疫反应，并且在C57BL/6小鼠动物试验中观察到了融合蛋白对肿瘤生长的抑制作用。预期在未来用于人体临床试验中亦能表现出强的免疫原性。 

本发明旨在提供一种能简单、经济、有效的制备人乳头瘤病毒HPV6L2N120E7E6融合蛋白的基因核苷酸序列，该基因能在大肠杆菌中获得高效表达，表达蛋白能用于HPV6型感染和相关疾病(如生殖器疣)的预防和治疗。 

具体而言，本发明的一个目的在于，提供一种人乳头瘤病毒(HPV)6型L2N120E7E6融合蛋白。本发明的另一个目的在于，提供一种用于编 码前述的人乳头瘤病毒(HPV)6型L2N120E7E6融合蛋白的DNA序列。本发明的再一个目的在于，提供一种大肠杆菌表达质粒载体。本发明的又一个目的在于，提供一种用于生产前述的人乳头瘤病毒(HPV)6型L2N120E7E6融合蛋白的大肠杆菌菌株。本发明的还一个目的在于，提供一种制备前述的人乳头瘤病毒(HPV)6型L2N120E7E6融合蛋白的方法。 

针对上述发明目的，本发明提供以下技术方案： 

一方面，本发明提供一种人乳头瘤病毒(HPV)6型L2N端120个氨基酸、E7蛋白、E6蛋白的融合蛋白，其氨基酸序列为SQE.ID.NO.1所示的序列。本申请中，以“HPV6L2N120E7E6”或“L2N120E7E6”表示该融合蛋白。 

另一方面，本发明提供一种用于前述的人乳头瘤病毒(HPV)6型L2N120E7E6融合蛋白的DNA序列，所述DNA序列的核苷酸序列为SQE.ID.NO.2所示的序列。 

再一方面，本发明提供一种用于表达前述融合蛋白的表达载体，所述表达载体包含前述的DNA序列；优选地，所述表达载体为原核或真核表达载体；更优选地，所述表达载体为大肠杆菌质粒载体。 

优选地，所述大肠杆菌质粒载体是由前述HPV6型的L2N120E7E6融合蛋白基因DNA序列插入至质粒pQE30的BamHⅠ位点间来构建的。 

优选地，所述大肠杆菌表达质粒载体中，所述的大肠杆菌选自JM109和M15等适宜表达pQE30的菌株。 

又一方面，本发明提供一种用于生产前述的人乳头瘤病毒(HPV)6型的L2N120E7E6融合蛋白的菌株，所述菌株含有前述的表达载体；优选地，所述菌株为大肠杆菌；更优选地，所述大肠杆菌选自JM109和M15等适宜表达pQE30的菌株。 

还一方面，本发明提供一种制备前述的人乳头瘤病毒(HPV)6型L2N120E7E6融合蛋白的方法，所述方法包括以下步骤： 

1)将前述的HPV6L2N120E7E6融合蛋白基因DNA序列插入大肠杆菌表达载体pQE30的BamHⅠ位点，构建出重组表达载体pQE30-HPV6L2N120E7E6； 

2)用步骤1)所构建的重组表达载体转化大肠杆菌，获得含有该重组表达载体的菌株，接种培养，IPTG诱导表达； 

3)将步骤2)所得到的大肠杆菌离心裂解后，收获包涵体，用8M尿 素悬起，离心，取上清用镍离子亲和层析柱纯化表达蛋白。 

优选地，在本发明制备前述的人乳头瘤病毒(HPV)6型L2N120E7E6融合蛋白的方法中，所述的大肠杆菌选自JM109和M15等适宜表达pQE30的菌株。 

另一方面，本发明提供一种制备用于治疗及预防人乳头瘤病毒6型感染及其相关疾病(如生殖器疣)药物的方法。 

此外，本发明还提供了前述的人乳头瘤病毒(HPV)6型L2N120E7E6融合蛋白、前述的人乳头瘤病毒(HPV)6型L2N120E7E6融合蛋白的DNA序列、前述的原核表达载体或前述的大肠杆菌菌株在制备用于预防和治疗人乳头瘤病毒6型感染及其相关疾病(如生殖器疣)的药物中的应用；优选地，所述的药物为疫苗。 

本发明还提供了一种用于预防和治疗生殖器疣的疫苗，所述疫苗包括前述的人乳头瘤病毒(HPV)6型L2N120E7E6融合蛋白、前述的人乳头瘤病毒(HPV)6型L2N120E7E6融合蛋白的DNA序列、前述的原核表达载体或前述的大肠杆菌菌株。 

下面根据本发明的一个优选的实施方式，结合说明书附图对本发明的技术方案进行进一步的详细说明： 

本实验采用基因工程技术，首先以提取的HPV6型基因阳性的尖锐湿疣组织DNA为模板，分别PCR扩增出HPV6 L2(1-360bp)、E7、E6基因，再以重叠PCR方法扩增出含1107bp的HPV6L2N120E7E6融合蛋白基因。将目的片段插入原核表达载体pQE30，经限制性内切酶酶切鉴定正确后，送北京擎科生物科技有限公司测序。获得了与设计基因序列相符的pQE30-HPV6L2N120E7E6重组表达质粒。融合蛋白基因在原核表达系统获得高效表达，表达水平约占全菌的40％，表达蛋白经纯化后免疫C57BL/6小鼠，用动物免疫实验评价目的蛋白的免疫原性。 

本发明生产人乳头瘤病毒6型L2N120E7E6融合蛋白的方法包括以下步骤： 

将设计的HPV6L2N120E7E6融合蛋白基因片段插入大肠杆菌表达载体pQE30的BamHⅠ位点，将该质粒转化大肠杆菌获得含有pQE30-HPV6L2N120E7E6的菌株，接种培养，IPTG诱导表达； 

表达菌体经离心裂解后，收获包涵体，用8M尿素悬起，离心，取上清用镍离子亲和层析柱纯化表达蛋白。 

优选地，在本发明生产HPV6L2N120E7E6融合蛋白的方法中，所述的大肠杆菌是JM109(JM109是常用的大肠杆菌表达菌株，一般配合以强表达载体来进行目的基因的强表达)。 

本发明的含有重组质粒pQE30-HPV6L2N120E7E6的大肠杆菌菌株能用于研制治疗及预防人乳头瘤病毒6型感染和与此感染相关疾病(如生殖器疣)的药物。 

由此可见，本发明人从增强疫苗的免疫原性，并能在大肠杆菌中高表达两方面，进行设计研制HPV6L2N120E7E6融合蛋白疫苗。考虑到L2的主要目的是诱导体液免疫即中和抗体，同时作为前导蛋白提高E7蛋白的表达，因此将L2蛋白截短仅保留含有中和抗体表位的N端120个氨基酸，以便于在E7蛋白后再融合加入在人体中免疫原性强于E7蛋白的E6蛋白，使三个靶抗原融合后能得以高效表达(一般分子量太大，表达水平会低)，此外L2的截短会改变融合蛋白的结构也有可能提高融合蛋白的免疫原性。加入E6抗原后融合蛋白疫苗囊括了更多的T细胞表位，更能满足于治疗性疫苗受HLA多态性影响的需要，从而达到增强疫苗免疫效果的作用。在我们的实验中已证实全长L2基因与E7、E6基因融合的蛋白表达水平很低(SDS-PAGE胶上无明显表达带)，而截短的L2与E7、E6基因融合的蛋白表达水平明显提高，经扫描分析，目的蛋白表达量占全菌的约40％。 

综上所述，本发明人选择将HPV6型早期蛋白E7和E6白与晚期蛋白L2N端的120个氨基酸多肽序列融合形成相应的HPV6L2N120E7E6融合蛋白的核苷酸序列，利用PCR获得三个蛋白的基因，应用重叠PCR方法将3个基因片段融合，构建出HPV6L2N120E7E6融合基因，将其插入原核表达载体pQE30，融合基因获得较高表达，表达水平约占全菌的40％，并进行了该蛋白的纯化，免疫C57BL/6小鼠后，经ELISA抗体检测，表明诱发了强的体液免疫反应(包括高的中和抗体和交叉中和抗体滴度)。ELISPOT检测免疫后的小鼠可产生针对HPV6型E7肽库和E6肽库强的特异性T细胞免疫反应。在肿瘤动物模型中可观察到一定的肿瘤生长抑制效果。本发明可用于研发预防和治疗性生殖器疣疫苗。 

与现有技术相比，本发明具有如下的明显优点： 

本发明中含有可诱发产生中和抗体和交叉中和抗体的HPV6型L2N端120个氨基酸，且同时含有能够引起细胞免疫反应的E7和E6蛋白，使用本发明的基因能够获得高的表达，表达水平约占全菌的40％，表达蛋白经 纯化免疫C57BL/6小鼠，表明该蛋白具有很好的免疫原性，可产生强的针对HPV6型E7和E6蛋白特异性T细胞免疫反应，肿瘤生长动物实验表明蛋白免疫对肿瘤的生长具有一定的抑制作用。由此可见，该融合基因建立的HPV6L2N120E7E6融合蛋白原核表达系统能用于HPV6型感染和相关疾病，尤其是生殖器疣的预防和治疗性疫苗的新药研发。 

附图说明

以下，结合附图来详细说明本发明的实施方案，其中： 

图1为本发明实施例3中所使用的pQE30质粒载体结构图谱； 

图2为根据本发明实施例3的方法构建的重组原核表达质粒pQE30-HPV6L2N120E7E6的结构简图； 

图3为HPV6L2N120E7E6融合蛋白原核表达高SDS-PAGE，电泳结果具体为根据本发明实施例4进行的在大肠杆菌中表达的SDS-PAGE凝胶分析的结果；其中，M为低分子量蛋白质Marker，1为空载体对照，2为诱导后基因表达产物； 

图4为HPV6L2N120E7E6融合蛋白的Western blot鉴定结果，具体为根据本发明实施例5进行的在大肠杆菌中表达蛋白的Western-blot鉴定结果；其中，M为低分子量蛋白质Marker，1为空载体对照，2为诱导后基因表达产物； 

图5为纯化后的HPV6L2N120E7E6融合蛋白SDS-PAGE纯度分析，具体为根据本发明实施例6进行的在原核系统表达经镍离子亲和层析纯化后的SDS-PAGE凝胶分析的结果，其中，M为低分子量蛋白质Marker，1为纯化后的HPV6L2N120E7E6蛋白； 

图6为HPV6L2N120E7E6融合蛋白在C57BL/6小鼠体内诱发的体液免疫反应，具体为根据本发明实施例7进行的表达蛋白经纯化，免疫小鼠后的总抗体滴度检测的结果； 

图7为HPV6L2N120E7E6融合蛋白在C57BL/6小鼠体内诱发的体液免疫反应，具体为根据本发明实施例7进行的表达蛋白经纯化，免疫小鼠后的中和抗体及交叉中和抗体滴度检测的结果； 

图8为HPV6L2N120E7E6融合蛋白在C57BL/6小鼠体内诱发的细胞免疫反应，具体为根据本发明实施例7进行的表达蛋白经纯化，免疫小鼠后的酶联免疫斑点(ELISPOT)检测结果； 

图9为HPV6L2N120E7E6融合蛋白在C57BL/6小鼠体内诱发的效应T细胞CD4+/CD8+亚型的确定，具体为根据本发明实施例7进行的表达蛋白经纯化，免疫小鼠后取脾细胞经过胞内细胞因子染色(ICS)的方法，使用流式细胞术检测分析确定； 

图10为HPV6L2N120E7E6融合蛋白在C57BL/6小鼠体内诱发的肿瘤生长抑制反应，具体为根据本发明实施例7进行的表达蛋白经纯化，对免疫后第二天移植肿瘤细胞的小鼠观察肿瘤生长情况。 

具体实施方式

以下参照具体的实施例来说明本发明。本领域技术人员能够理解，这些实施例仅用于说明本发明，其不以任何方式限制本发明的范围。 

下列实施例中未注明具体实验条件的实验方法，通常按照常规条件，或按照厂商所建议的条件。 

实施例1：设计表达HPV6L2N120E7E6融合蛋白的基因序列 

根据NCBI GenBank HPV6基因序列(序列号NC 001355)对应的氨基酸序列，将HPV6型病毒的次要衣壳蛋白序列L2N端120个氨基酸与早期蛋白E7和E6蛋白全长氨基酸序列融合，设计得到具体如SEQ ID NO：1所示的融合蛋白(融合蛋白从N→C端依次为L2N120、E7、E6，共368个氨基酸)。 

为了防止同源序列基因重组的可能，将E7蛋白基因中与E6蛋白基因重叠部分的核苷酸序列改造，根据基因简并性，在其编码的产物蛋白氨基酸序列保持不变的前提下将E7基因5’端25bp序列(此E7蛋白基因5’端25bp基因与E6蛋白基因3’端重叠)ATGCATGGAAGACATGTTACCCTAA替换为ATGCACGGTCGTCACGTGACACTGA，以扩大这部分重叠序列的差异，同时去除E7基因的终止密码子，发明人将该序列命名为HPV6L2N120E7E6，其序列具体如下SEQ ID NO：2所示。 

实施例2：PCR扩增制备L2N120E7E6目的基因片段 

本实施例为PCR扩增制备L2N120E7E6目的基因片段，具体过程详述如下。 

根据所设计的融合蛋白对应的相关核苷酸序列设计PCR及重叠PCR所需引物P1/P2(L2N120)、P3/P4(E7)和P5/P6(E6)，以供扩增L2N120E7E6 融合基因使用。设计的引物详细如表1所示。引物合成由北京擎科生物技术有限公司完成。 

HPV6型基因阳性的尖锐性湿疣组织DNA的筛选方法如下：将取自医院妇科患者的尖锐湿疣组织依据DNA提取试剂盒(购自北京诺克奥基因工程技术有限公司)说明书操作提取总DNA。依据HPV PCR检测试剂盒(购自北京基因工程技术有限诺克奥公司)说明书，以提取的尖锐湿疣组织DNA为模板，PCR扩增HPV DNA片段。将HPV DNA片段克隆至pMD18-T载体，将质粒DNA用SmaⅠ酶切鉴定，阳性克隆送大连宝生物公司测序，序列与NCBI GenBank HPV6基因序列(序列号NC_001355)比对，有相同序列者，对应的尖锐湿疣组织DNA提取物为HPV6阳性DNA。以该含有HPV6型基因的尖锐性湿疣组织DNA为模板，分别以PCR引物P1/P2(L2N120)、P3/P4(E7)和P5/P6(E6)，扩增出含HPV6L2N120(360bp)、HPV6E7(294bp)和HPV6E6(453bp)三个目的基因片段，扩增条件如下：94℃5分钟预变性，循环体为94℃30秒，58℃30秒，72℃1分钟，30个循环，然后72℃10分钟。 

将L2N120、E7和E6基因PCR扩增片段进行凝胶回收；以回收后的E7和E6基因PCR产物混合后为模板，E7的正向克隆引物(P3)和E6反向克隆引物(P6)进行重叠PCR扩增，扩增条件如下：94℃5分钟预变性，循环体为94℃30秒，58℃30秒，72℃1分钟，30个循环，然后72℃10分钟。 

扩增出含E7E6目的基因的片段，将E7E6基因重叠PCR扩增片段进行凝胶回收；再以回收后的L2N120基因PCR产物和E7E6基因重叠PCR产物混合后为模板，L2N120的正向克隆引物(P1)和E6反向克隆引物(P6)进行二次重叠PCR扩增，扩增条件如下：94℃5分钟预变性，循环体为94℃30秒，58℃30秒，72℃1分钟，30个循环，然后72℃10分钟，扩增出含1107bp的L2N120E7E6目的基因片段。 

表1  PCR扩增融和L2N120E7E6目的基因的引物序列 

  编号   名称   序列   P1   L2N12   0F   5’-GAAGATCTGCACATAGTAGGGCCCGACGACGC-3’   (SEQ ID NO：3)   P2   L2N12   0R 5’-GTCACGTGACGACCGTGCATTTCAGGCGCCCCTG CGT-3’(SEQ ID NO：4)  P3   E7F   5’-ATGCACGGTCGTCACGTGACACTGAAGGATATTG

[0074] 

    TAT3’(SEQ ID NO：5)   P4   E7R 5’-GAGGCATTTGCACTTTCCATGGTCTTCGGTGCGCA GATGG-3’(SEQ ID NO：6)  P5   E6F 5’-CCATCTGCGCACCGAAGACCATGGAAAGTGCAA ATGCCTC-3’(SEQ ID NO：7)  P6   E6R   5’-GAAGATCTTCTTAGGGTAACATGTCTTCCATG-3’   (SEQ ID NO：8)

实施例3：原核表达重组质粒pQE30-HPV6L2N120E7E6的构建 

本实施例为构建原核表达重组质粒pQE30-HPV6L2N120E7E6，具体详述如下。 

将实施例2中重叠PCR扩增出的含1107bp的HPV6L2N120E7E6目的基因片段用限制性内切酶酶切消化，所述酶切消化的操作如下：用BglⅡ酶(Biolabs公司产品，购自北京北方仪涛商贸有限公司)于37℃水浴作用3小时，然后用琼脂糖凝胶回收试剂盒(购自北京天根生化科技有限公司)回收片段。 

然后将用限制性内切酶酶切消化的HPV6L2N120E7E6目的基因插入大肠杆菌表达质粒载体pQE30(为Qiagen公司产品，购自华美生物工程公司北京分公司，其具体结构图谱见图1)的BamHⅠ位点，经BamHⅠ+HindⅢ双酶切鉴定筛选有正确插入的原核表达重组质粒pQE30-HPV6L2N120E7E6，并经测序证实核苷酸序列与设计完全一致。pQE30-HPV6L2N120E7E6结构简图如图2所示。 

实施例4：原核表达重组质粒的大肠杆菌表达 

本实施例使用实施例3获得的含有重组质粒pQE30-HPV6L2N120E7E6转化大肠杆菌JM109(购自Invitrogen公司)。采用重组质粒转化CaCl₂法制备JM109大肠杆菌感受态细胞，具体操作见参考文献：萨姆布鲁克J，弗里奇EF，和曼尼阿蒂斯T，分子克隆实验指南.1992.第二版(北京)：科学出版社：第56页。 

将所得到的转化大肠杆菌JM109，涂平皿后，37℃过夜培养。挑单斑在LB培养基(配方见参考文献：萨姆布鲁克J，弗里奇EF，和曼尼阿蒂斯T，分子克隆实验指南.1992.第二版(北京)：科学出版社：第908页)中37℃振荡培养， 当OD600＝0.8时，加入终浓度为0.8mM的IPTG(Promega公司产品，购自北京博大泰克生物基因技术有限责任公司)，20℃诱导表达12小时，取适量菌体进行SDS-PAGE凝胶电泳分析。 

电泳凝胶经扫描后，使用Gel-Pro软件分析。结果如图3所示，在分子量约41KD处有一新增蛋白带，蛋白分子量大小与设计理论推测值一致，该蛋白带约占全菌蛋白总量的40％。 

实施例5：HPV6L2N120E7E6基因原核表达的Western-blot检测 

本实施例采用Western-blot检测HPV6L2N120E7E6基因在原核表达系统中的表达，具体详述如下。 

取实施例4获得的诱导表达菌液200μl，离心收获菌体，重悬于100μl的SDS-PAGE加样缓冲液(具体配方及配制方法见萨姆布鲁克J，弗里奇EF，和曼尼阿蒂斯T，分子克隆实验指南.1992.第二版(北京)：科学出版社：第935页)混匀，煮沸加热5分钟。离心后取5-10μl上样于10％的SDS-PAGE胶，进行电泳，然后电转硝酸纤维素膜。 

使用抗HPV6E6自制小鼠多抗作为第一抗体，辣根过氧化物酶标记的蛋白A/G作为第二抗体(购自北京北方同正生物技术发展公司)，进行目的蛋白表达的Western-Blot特异性鉴定(具体操作见参考文献：萨姆布鲁克J，弗里奇EF，和曼尼阿蒂斯T，分子克隆实验指南.1992.第二版(北京)：科学出版社：第888-898页)。其中所使用的第一抗体的制备方法如下：用pGEX2T-HPV6E6原核表达质粒(将HPV6E6蛋白全长表达基因插入pGEX-2T原核表达质粒载体的BamHⅠ和EcoRⅠ位点之间)转入JM109菌株中，获得的含有pGEX2T-HPV6E6质粒的表达菌种以1∶100接种于300ml 2×YT培养基，37℃振荡培养至OD600＝0.8，加入IPTG至终浓度为0.8mM，20℃诱导表达12小时，收集菌体沉淀；用介质Glutathione Sepharose(Amersham Biosciences(安玛西亚)公司产品，购自北京中原合聚经贸有限公司)进行表达蛋白的纯化(具体纯化方法参考所用介质说明书)，纯化的GST-HPV6E6融合蛋白加弗氏佐剂(Sigma公司产品，购自北京欣经科生物技术有限公司)，皮下多点及腹腔注射免疫BALB/C小鼠，免疫三次后摘眼球采血，离心取血清，即得HPV6型E6蛋白抗血清。 

Western-Blot结果表明，在分子量约41KD处有一特异性反应条带，为目的基因表达的HPV6L2N120E7E6融合蛋白，结果参见图4。 

实施例6：HPV6L2N120E7E6融合基因在大肠杆菌中的表达和蛋白的纯化 

本实施例为HPV6L2N120E7E6融合基因在大肠杆菌中的表达和蛋白的纯化，具体参见以下步骤： 

a)将实施例4获得的菌种以1∶100接种于300ml 2×YT培养基(其配方见参考文献：萨姆布鲁克J，弗里奇EF和曼尼阿蒂斯T，分子克隆实验指南.1992.第二版(北京)：科学出版社：第909页)，35℃振荡培养至OD600＝0.8时，加入IPTG(为Promega公司产品，购自北京博大泰克生物基因技术有限责任公司)至终浓度为0.8mM，20℃诱导表达12小时，离心(5000rpm，15分钟，4℃)收集菌体沉淀； 

b)将前述步骤a)中获得的表达菌体沉淀重悬于30ml裂解缓冲液(50mMTris，PH9.0)，在冰浴中超声处理(400W，25次)8秒，间隔16秒，离心(12,000rpm，20分钟，4℃)收集沉淀； 

c)将前述步骤b)中获得的沉淀重悬于30ml含4M尿素的缓冲液(50mMTris，4M尿素，PH9.0)，在冰浴中超声处理(400瓦，20次)8秒，间隔16秒。离心(12000rmp，20分钟，4℃)收集沉淀； 

d)将前述步骤c)中获得的沉淀重悬于30ml含8M尿素的缓冲液(50mMTris，8M尿素，PH9.0)，在冰浴中超声处理(400瓦，10次)8秒，间隔16秒。离心(12000rmp，20分钟，4℃)，收集上清液备用； 

e)将前述步骤d)中获得的上清液经镍离子亲和层析柱(AmershamBiosciences(安玛西亚)公司产品，购自北京中原合聚经贸有限公司)纯化目的蛋白，方法详见奥斯伯FM，金斯顿RE，塞德曼JG等，精编分子生物学实验指南.2005.第四版(北京)：科学出版社：第442-447页； 

f)将前述步骤e)中获得的层析纯化后的蛋白经透析袋(购自华美生物工程公司北京分公司，规格DM-49，孔径为12-14KD)进行尿素梯度浓度透析，最后透析至Tris缓冲液(50mM Tris，PH9.0)中，超滤离心浓缩，纯度达90％，储存于-20℃供免疫动物使用，所得纯化蛋白的SDS-PAGE凝胶电泳分析结果见图5。 

实施例7：HPV6L2N120E7E6融合蛋白动物免疫实验 

本实施例为使用HPV6L2N120E7E6融合蛋白进行动物免疫实验，包括检 测免疫小鼠后血清特异性抗体和细胞免疫反应，以及对肿瘤生长的抑制作用。 

(1)HPV6L2N120E7E6融合蛋白免疫小鼠后血清特异性抗体和细胞免疫反应检测 

使用由前述实施例6制备得到的HPV6L2N120E7E6融合蛋白50μg，加入10ugCpG1826佐剂(CpG1826序列为：5TCCATGACGTTCCTGACGTT3，由上海生工生物技术公司合成，全链硫代修饰，聚丙烯酰胺凝胶电泳纯化，溶于生理盐水)，肌肉注射免疫C57BL/6小鼠(C57BL/6小鼠，6-8周龄，雌性，购自中国医学科学院实验动物繁育中心，在SPF2级动物房饲养)，二周和四周后以同样免疫剂量加强，免疫结束后10-14天进行血清特异性抗体检测和细胞免疫检测。 

1)特异性抗体检测： 

检测用的HPV6型L2、E7、E6包被抗原的具体制备方法如下：将HPV6L2蛋白表达基因插入pQE30原核表达质粒载体(购自Qiagen公司)的BamHⅠ和SmaⅠ位点之间，将HPV6E7、E6蛋白表达基因分别插入pGEX2T原核表达质粒载体(购自Pharmacia公司)的BamHⅠ和EcoRⅠ位点之间，3个重组质粒分别转入JM109菌株中，获得的含有pQE30-HPV6L2、pGEX2T-HPV6E7、pGEX2T-HPV6E6质粒的表达菌种。以1∶100接种于300ml2×YT培养基，37℃振荡培养至OD600＝0.8，加入IPTG至终浓度为0.8mM，含pGEX2T-HPV6E7、pGEX2T-HPV6E6的菌株20℃诱导表达12小时，收集菌体沉淀，用介质Glutathione Sepharose(Amersham Biosciences(安玛西亚)公司产品，购自北京中原合聚经贸有限公司)进行蛋白的纯化(具体纯化方法参考所用介质说明书)；含pQE30-HPV6L2的菌株37℃诱导表达3小时，收集菌体沉淀，参考实施例6中蛋白纯化的方法，使用镍离子亲和层析柱(Amersham Biosciences(安玛西亚)公司产品，购自北京中原合聚经贸有限公司)纯化蛋白，具体的方法详见参考文献：奥斯伯FM，金斯顿RE，塞德曼JG等，精编分子生物学实验指南.2005.第四版(北京)：科学出版社：第442-447页。 

取血清，用酶联免疫法(ELISA)进行L2抗体、E7抗体和E6抗体的检测。制备的HPV6型L2、E7、E6包被抗原的包被量分别为200ng/孔、150ng/孔、200ng/孔，血清起始稀释度为1∶800(ELISA具体操作步骤参见：奥斯伯FM，金斯顿RE，塞德曼JG等，精编分子生物学实验指南.2005.第四版 (北京)：科学出版社：第476-477页)，以试剂组PBS为阴性对照，检测的总抗体滴度结果如图6所示。从图6中可看出，HPV6L2N120E7E6融合蛋白在C57BL/6小鼠体内能诱导产生高滴度的抗体，具体如下：L2抗体平均滴度1∶688862、E7抗体平均滴度1∶289630和E6抗体平均滴度1∶121774。 

取血清，用假病毒中和实验进行HPV L2中和抗体及交叉中和抗体的检测。具体方法为：接种适量293FT细胞于96孔细胞培养板，37℃、5％CO₂孵箱中培养，第二天将用细胞培养基(含10％胎牛血清的DMEM，购自Hyclone)稀释的血清经0.2μm滤器过滤除菌后与200-300个TCID50的HPV假病毒(HPV假病毒由实验室自制，具体方法如下：将含有HPV L1、L2衣壳蛋白基因的真核表达质粒瞬时转染293FT细胞后，表达HPV L1、L2衣壳蛋白，衣壳蛋白自动包装形成病毒样颗粒，并将带有绿色荧光蛋白报告基因的质粒包裹进内部，裂解细胞后收获纯化假病毒。详细方法参考文献：Christopher B.Buck，Diana V.Pastrana，Douglas R.Lowy and John T.Schiller.Production of Papillomaviral Vectors(Pseudoviruses).2009.)混合均匀，置4℃放置1小时后，加入细胞中，37℃、5％CO₂孵箱中培养，2天后置倒置荧光显微镜下观察，计算绿色荧光点数，统计数据，分析中和抗体滴度，实验结果如图7所示。从图7中可以看出，HPV6L2N120E7E6融合蛋白在C57BL/6小鼠体内诱导产生的针对HPV6、11、16、18、58、45型假病毒的中和抗体滴度分别为1∶3200、1∶1600、1∶800、1∶800、1∶200、1∶800。 

2)细胞免疫反应检测： 

取脾细胞，用酶联免疫斑点(ELISPOT)方法进行E7肽库和E6肽库(肽库设计方案为：参照蛋白序列，以N’→C’的方向，每15个氨基酸为一条肽段，相邻肽段有11个氨基酸的重叠，设计E7和E6肽库，送交北京中科亚光公司合成)刺激产生的特异性分泌IFN-γ的效应T细胞的数目检测(具体方法参见Miyahira Y，Murata K，Rodriguez D，et al.，Quantification of antigen specificCD8⁺T cell using an ELISPOT assay.J Immunol Methods，1995，181(1)：45-54.Murali-Krishna K，Altman JD，Suresh M，et al.Counting antigen-speific CD8 Tcells：a reevaluation of bystander activation during viral infection.Immunity，1998，8(2)：1771-87.)，具体操作参见BD公司产品ELISPOT试剂盒说明书)。同时用胞内染色(ICS)方法进行E71-15肽和E637-51肽刺激产生的特异性分泌IFN-γ的效应T细胞的CD4⁺/CD8⁺亚型的确定(具体方法参见Arora SK.Analysis of intracellular cytokines using flowcytometry.Methods Cell Sci，2002，24(1-3)：37-40.Laurel Nomura，Vernon C.Maino，Holden T.Maecker.Standardization and Optimization of Multiparameter Intracellular CytokineStaining Cytometry 2008，73A：984-991.)，具体操作参见BD公司产品ICS试剂盒说明书。 

用HPV6E7肽库和HPV6E6肽库刺激免疫HPV6L2N120E7E6融合蛋白的C57BL/6小鼠脾细胞后产生分泌IFN-γ的效应T细胞的斑点数分别为：446和1094，而PBS对照组则没有检测到相应的斑点数。两者统计学上具有显著差异，说明HPV6L2N120E7E6融合蛋白能够诱发C57BL/6小鼠产生强的针对HPV6E7和E6蛋白的特异性T细胞免疫应答，实验结果如图8所示。用肽池分别刺激免疫HPV6L2N120E7E6融合蛋白的C57BL/6小鼠脾细胞筛选到HPV6E71-15肽(氨基酸序列：N’-MHGRHVTLKDIVLDL-3’)与HPV6E637-51肽(氨基酸序列：N’-ALTTAEIYSYAYKHL-3’)刺激后反应最强，细胞斑点数分别为：302和826。 

免疫的小鼠两周后取脾细胞分别用HPV6E71-15肽与HPV6E637-51肽刺激后经胞内细胞因子染色(ICS)，使用流式细胞术检测分析结果显示HPV6E71-15肽(氨基酸序列：N’-MHGRHVTLKDIVLDL-3’)与HPV6E637-51肽(氨基酸序列：N’-ALTTAEIYSYAYKHL-3’)均为CD8⁺T细胞表位。结果如图9所示。 

(2)HPV6L2N120E7E6对C57小鼠肿瘤生长的抑制作用： 

先用1.2x10³个B16/HPV6E7肿瘤细胞(B16/HPV6E7肿瘤细胞系pcDNA3.1-HPV6E7质粒转染C57BL/6小鼠黑色素瘤细胞B16，经G418传代筛选后可稳定表达和递呈E7蛋白，由浙江大学医学院附属邵逸夫医院程浩教授馈赠，见参考文献：表达人乳头瘤病毒6b和11型E6/E7基因的小鼠肿瘤细胞株的建立，中华皮肤科杂志2004.Vol37.No2：91～93)腹股沟皮下注射(注射剂量为100μl)C57BL/6小鼠(C57BL/6小鼠，6-8周龄，雌性，购自中国医学科学院实验动物繁育中心，在SPF2级动物房饲养)，第二天肌肉注射50μg的HPV6L2N120E7E6融合蛋白(由前述实施例6制备得到的HPV6L2N120E7E6融合蛋白)+10ugCpG(1826)佐剂，10天后以同样免疫剂量加强，观察肿瘤生长情况(每周2次)。 

实验结果如图10所示，表明经蛋白免疫后对肿瘤的生长具有一定的抑制作用，小鼠成瘤时间明显推迟，并且有20％的小鼠能完全抑制肿瘤的生长。 

由以上结果可知，HPV6L2N120E7E6融合蛋白具有强的免疫原性，在C57BL/6小鼠体内能诱发较强的免疫反应。ELISA实验显示该蛋白能诱导高滴度的针对HPV6型L2、E7、E6的抗体，且HPV假病毒中和实验表明，其针对HPV6型的中和抗体滴度高达1∶3200，同时，对其他型别的HPV假病毒也具有一定程度的交叉中和作用；ELISPOT实验证实，HPV6型E6蛋白比E7蛋白能诱发更强的细胞免疫反应，结合ICS实验和小鼠肿瘤生长抑制实验结果，说明该蛋白能诱发强的特异性CD8+T细胞反应，特异性杀伤或清除相关肿瘤细胞，此外由于加上了免疫原性强的E6蛋白，使得疫苗具有更好的抗肿瘤效果。 

综前所述，该融合蛋白能诱发强的体液及细胞免疫反应，能产生高滴度的中和抗体及异型交叉中和抗体，能诱发C57BL/6小鼠产生针对HPV6E7和E6蛋白的特异性T细胞免疫应答，因此能作为预防和治疗HPV6型感染及相关疾病(如生殖器疣)的疫苗。 

序列表

<110>中国疾病预防控制中心病毒病预防控制所

 

<120>HPV6型L2N120E7E6融合蛋白基因、表达载体、方法、菌株和用途

 

<130>DIC10110037

 

<160>8

 

<170>PatentIn version 3.3

 

<210>1

<211>368

<212>PRT

<213>HPV6L2N120E7E6融合蛋白

 

<400>1

 

Met Ala His Ser Arg Ala Arg Arg Arg Lys Arg Ala Ser Ala Thr Gln

1               5                  10                    15

Leu Tyr Gln Thr Cys Lys Leu Thr Gly Thr Cys Pro Pro Asp Val Ile

            20                  25                  30

Pro Lys Val Glu His Asn Thr Ile Ala Asp Gln Ile Leu Lys Trp Gly

        35                  40                  45

Ser Leu Gly Val Phe Phe Gly Gly Leu Gly Ile Gly Thr Gly Ser Gly

    50                  55                  60

Thr Gly Gly Arg Thr Gly Tyr Val Pro Leu Gln Thr Ser Ala Lys Pro

65                  70                  75                  80

Ser Ile Thr Ser Gly Pro Met Ala Arg Pro Pro Val Val Val Glu Pro

                85                  90                  95

Val Ala Pro Ser Asp Pro Ser Ile Val Ser Leu Ile Glu Glu Ser Ala

            100                 105                 110

Ile Ile Asn Ala Gly Ala Pro Glu Met His Gly Arg His Val Thr Leu

        115                 120                 125

Lys Asp Ile Val Leu Asp Leu Gln Pro Pro Asp Pro Val Gly Leu His

    130                 135                 140

Cys Tyr Glu Gln Leu Val Asp Ser Ser Glu Asp Glu Val Asp Glu Val

145                 150                 155                 160

Asp Gly Gln Asp Ser Gln Pro Leu Lys Gln His Phe Gln Ile Val Thr

                165                 170                 175

Cys Cys Cys Gly Cys Asp Ser Asn Val Arg Leu Val Val Gln Cys Thr

            180                 185                 190

Glu Thr Asp Ile Arg Glu Val Gln Gln Leu Leu Leu Gly Thr Leu Asn

        195                 200                 205

Ile Val Cys Pro Ile Cys Ala Pro Lys Thr Met Glu Ser Ala Asn Ala

    210                 215                 220

Ser Thr Ser Ala Thr Thr Ile Asp Gln Leu Cys Lys Thr Phe Asn Leu

225                 230                 235                 240

Ser Met His Thr Leu Gln Ile Asn Cys Val Phe Cys Lys Asn Ala Leu

                245                 250                 255

Thr Thr Ala Glu Ile Tyr Ser Tyr Ala Tyr Lys His Leu Lys Val Leu

            260                 265                 270

Phe Arg Gly Gly Tyr Pro Tyr Ala Ala Cys Ala Cys Cys Leu Glu Phe

        275                 280                 285

His Gly Lys Ile Asn Gln Tyr Arg His Phe Asp Tyr Ala Gly Tyr Ala

    290                 295                 300

Thr Thr Val Glu Glu Glu Thr Lys Gln Asp Ile Leu Asp Val Leu Ile

305                 310                 315                 320

Arg Cys Tyr Leu Cys His Lys Pro Leu Cys Glu Val Glu Lys Val Lys

                325                 330                 335

His Ile Leu Thr Lys Ala Arg Phe Ile Lys Leu Asn Cys Thr Trp Lys

            340                 345                 350

Gly Arg Cys Leu His Cys Trp Thr Thr Cys Met Glu Asp Met Leu Pro

        355                 360                 365

 

<210>2

<211>1107

<212>DNA

<213>人工序列

 

<400>2

atggcacata gtagggcccg acgacgcaag cgtgcgtcag ctacacagct atatcaaaca    60

tgtaaactca ctggaacatg ccccccagat gtaattccta aggtggagca caacaccatt    120

gcagatcaaa tattaaaatg gggaagtttg ggggtgtttt ttggagggtt gggtataggc    180

acgggttccg gcactggggg tcgtactggc tatgttccct tacaaacttc tgcaaaacct    240

tctattacta gtgggcctat ggctcgtcct cctgtggtgg tggagcctgt ggccccttcg    300

gatccatcta ttgtgtcttt aattgaagaa tcggcaatca ttaacgcagg ggcgcctgaa    360

atgcacggtc gtcacgtgac actgaaggat attgtattag acctgcaacc tccagaccct    420

gtagggttac attgctatga gcaattagta gacagctcag aagatgaggt ggacgaagtg    480

gacggacaag attcacaacc tttaaaacaa catttccaaa tagtgacctg ttgctgtgga    540

tgtgacagca acgttcgact ggttgtgcag tgtacagaaa cagacatcag agaagtgcaa    600

cagcttctgt tgggaacact aaacatagtg tgtcccatct gcgcaccgaa gaccatggaa    660

agtgcaaatg cctccacgtc tgcaacgacc atagaccagt tgtgcaagac gtttaatcta    720

tctatgcata cgttgcaaat taattgtgtg ttttgcaaga atgcactgac cacagcagag    780

atttattcat atgcatataa acacctaaag gtcctgtttc gaggcggcta tccatatgca    840

gcctgcgcgt gctgcctaga atttcatgga aaaataaacc aatatagaca ctttgattat    900

gctggatatg caacaacagt tgaagaagaa actaaacaag acatcttaga cgtgctaatt    960

cggtgctacc tgtgtcacaa accgctgtgt gaagtagaaa aggtaaaaca tatactaacc   1020

aaggcgcggt tcataaagct aaattgtacg tggaagggtc gctgcctaca ctgctggaca    1080

acatgcatgg aagacatgtt accctaa                                        1107

 

<210>3

<211>32

<212>DNA

<213>人工序列

 

<400>3

gaagatctgc acatagtagg gcccgacgac gc                                   32

 

<210>4

<211>37

<212>DNA

<213>人工序列

 

<400>4

gtcacgtgac gaccgtgcat ttcaggcgcc cctgcgt                              37

 

<210>5

<211>37

<212>DNA

<213>人工序列

 

<400>5

atgcacggtc gtcacgtgac actgaaggat attgtat                              37

<210>6

<211>40

<212>DNA

<213>人工序列

 

<400>6

gaggcatttg cactttccat ggtcttcggt gcgcagatgg                          40

 

<210>7

<211>40

<212>DNA

<213>人工序列

 

<400>7

ccatctgcgc accgaagacc atggaaagtg caaatgcctc                          40

 

<210>8

<211>32

<212>DNA

<213>人工序列

 

<400>8

gaagatcttc ttagggtaac atgtcttcca tg                                  32