作为细胞周期阻断剂和抗肿瘤活性药物的化合物

摘要

本发明公开一种如式所示的化合物6，8-二甲基-7，4′-二甲氧基-5-羟基黄烷(HDF)，

说明书

技术领域

本发明涉及一种化合物，特别是一种对天然黄酮类化合物鹃花醇进行结构 改造得到的新化合物，以及这种化合物的制备方法及其用途。

背景技术

植物天然产物是抗肿瘤药物的重要来源。已成功应用于临床的著名抗肿瘤 药物如紫杉醇、长春新碱、喜树碱等均来自植物天然产物及其衍生物。对植物 天然产物进行结构改造，探索和开发植物天然产物及其衍生物的抗肿瘤活性， 仍然是抗肿瘤药物研发的重要途径。

发明内容

本发明提供一种对天然黄酮类化合物鹃花醇进行结构改造得到的新化合 物，以及这种化合物的制备方法及其用途。

本发明所述的化合物为6，8-二甲基-7，4′-二甲氧基-5-羟基黄烷(HDF)，其 结构式如式I所示。

本发明所述的化合物6，8-二甲基-7，4′-二甲氧基-5-羟基黄烷的制备方法是 以鹃花醇1为原料，用两倍量的硫酸二甲酯在碱性条件下甲基化制得化合物2， 然后在冰浴的条件下乙酰化，得到化合物3；用硼氢化钠和THF/H₂O体积比(2∶1) 将化合物3脱掉5位的乙酰基，并还原4位的酮羰基为亚甲基得到目标产物， 其反应如式II示。

本发明的化合物6，8-二甲基-7，4′-二甲氧基-5-羟基黄烷可在制备细胞周期 阻断剂药物或试剂中应用，或者在制备抗肿瘤药物中的应用。

本发明的化合物制备方法简便，经相关实验表示本发明的化合物6，8-二甲基 -7，4′-二甲氧基-5-羟基黄烷对细胞有明显的阻滞作用，提示其可在制备细胞周 期阻断剂药物或者试剂中应用，也可在制备抗肿瘤药物中的应用。目前临床上 常用的G₂期细胞周期特异性药物数量较少，仅有博来霉素和平阳霉素两种较为 常见，二者均属抗生素类。本发明的化合物来源于植物天然产物的衍生物，其 阻断细胞周期作用明显，并能诱导细胞凋亡，将提供新的、具有完全自主知识 产权的候选药物，为肿瘤治疗的联合用药提供更多的选择。

附图说明

图1为本发明的化合物HDF对细胞形态的影响。其中：A图为对照组HL-60 细胞，B图为经本发明的化合物12.5μg/ml处理后的HL-60细胞；C图为对照组 SMMC-7721细胞，D图为经本发明的化合物12.5μg/ml处理后的SMMC-7721 细胞组。处理时间均为48小时。

图2至图5为经本发明化合物HDF处理24小时后，用流式细胞分析术测 得的细胞周期分布直方图。各图中横坐标为DNA含量(DNA content)；纵坐标 为细胞数(cell number)。其中图2为对照组HL-60细胞；图3为用本发明的化 合物(HDF)30μg/ml处理后的HL-60细胞；图5为对照组SMMC-7721细胞； 图4为用本发明的化合物(HDF)30μg/ml处理组SMMC-7721细胞。

图6至图9经化合物HDF处理24小时后，流式细胞分析术测得的细胞凋 亡分布直方图，其中横坐标为FITC荧光；纵坐标为PI荧光。图6为对照组HL-60 细胞；图7为30μg/ml处理组HL-60细胞；图8为对照组SMMC-7721细胞； 图9为30μg/ml处理组SMMC-7721细胞。

具体实施方式

以下结合实施例解说。

1.本发明化合物的制备

本发明的制备反应参见式II。取鹃花醇，即式II中的(1)用两倍量的硫酸 二甲酯在碱性条件下甲基化制得化合物(2)，然后用醋酸酐和硫酸在冰浴的条 件下乙酰化，得到化合物(3)；用硼氢化钠，THF/H₂O(2∶1)条件下，化合物3 脱掉5位的乙酰基，并还原4位的酮羰基为亚甲基得到黄烷类化合物6，8-二甲基 -7，4′-二甲氧基-5-羟基黄烷(HDF)。

具体工艺如下：鹃花醇(100mg，0.318mmol)溶解到丙酮中，在加入过量的 K₂CO₃，然后滴加重蒸的(CH₃)₂SO₄溶液，回流搅拌10h，冷却至室温，抽滤， 用丙酮多次洗涤，混合丙酮溶液抽干得到黄色晶体2(102mg)。化合物2(102mg) 加入1mL醋酸酐溶液中，冰浴冷却下同时滴加催化量的浓硫酸，反应45min， 用冰水淬灭，二乙萃取，NaHCO₃溶液洗涤，无水MgSO₄干燥，过滤，浓缩， 得白色晶体3(90mg)。化合物3(60mg)溶解THF/H₂O(2∶1)的溶液中，冰浴冷却下 加入NaBH₄(20mg)，冰浴条件下搅拌30min，用饱和NH₄Cl溶液淬灭，二乙萃 取，无水MgSO₄干燥，过滤，浓缩。得白色晶体HDF。

结构鉴定：(核磁共振)¹H NMR(CDCl₃，300MHz)δ1.9-2.1(1H，m)，2.2-2.3 (1H，m)，2.29(3H，s，OAc)，2.6-2.7(2H，m)，3.71(3H，s，OCH₃)，4.78(1H，s，OH)， 4.98(1H，dd，J＝10.3，2.4Hz)，6.00(1H，d，J＝2.3Hz)，6.10(1H，d，J＝2.3Hz)，7.09 (2H，d，J＝8.6Hz)，7.41(2H，d，J＝8.6Hz)；¹³C NMR(CDCl₃，75MHz)δ19.0，21.2， 29.5，55.3，77.1，94.2，94.8，101.8，121.5，127.1，139.0，150.1，154.4，156.4，159.1， 169.4.

2.化合物HDF具有细胞周期阻滞作用实验

经显微镜观察和流式细胞分析术研究发现，化合物HDF具有细胞周期阻滞 作用，阻滞细胞于G₂期。

2.1显微镜观察发现化合物HDF作用可使细胞形态变圆、变大 经本发明化合物HDF处理后，人原髓细胞白血病细胞HL-60细胞和人肝癌细胞 SMMC-7721细胞形态变得肥大，明显出现了细胞周期阻滞现象。关于这一点参 见附图1，图1显示经12.5μg/ml药物处理48小时后，细胞形态变得肥大，明 显处于周期阻滞状态。

2.2流式细胞分析术研究发现化合物HDF可使细胞周期阻滞在G₂期

实验方法：收集并检查单细胞悬浮液，移入10ml离心管，1000g离心5min， 弃上清。用不含Ca和Mg的PBS洗2遍，然后计数细胞并将结果记录在管上。 重悬细胞于500μl PBS中，加入5ml冷乙醇(4℃预冷)，4℃固定过夜。取5×10⁶细胞于10ml离心管中，1000g离心，5min，弃乙醇。用含1％BSA或小牛血 清的5ml PBS洗2遍。将细胞沉淀重悬于800μl含1％BSA或小牛血清的PBS 中。加入10×PI溶液和RNA酶A各100μl，37℃避光孵育30分钟，流式细胞 仪分析。

实验结果表明，本发明的化合物HDF有阻滞细胞周期的作用。参见附图2 至附图5，图中结果显示，经30μg/ml化合物HDF处理24小时后，两株肿瘤细 胞的细胞周期均被阻滞在G₂期。关于上述实验的统计结果参见表1和表2给出 的数据。

表1化合物HDF对白血病细胞系HL-60细胞周期的影响

表2化合物HDF对肝癌细胞系SMMC-7721细胞周期的影响

表1和表2示流式细胞分析术的统计结果，这些结果均揭示，化合物HDF 对细胞周期的阻滞作用主要发生在G₂期。

3.抗肿瘤实验

相关实验表明化合物HDF具有细胞毒性，并能诱导肿瘤细胞凋亡，具有抗 肿瘤药物研发潜力。

SRB法研究发现，本发明的化合物HDF具有细胞毒性，流式细胞分析术研 究发现化合物HDF具有诱导细胞凋亡的能力，因此，化合物HDF具有深入开 展抗肿瘤药物研发的价值。

3.1SRB法研究发现化合物HDF具有较强的细胞毒性

实验方法：选用对数生长期的肿瘤细胞(贴壁细胞用胰酶消化)，用含10 ％小牛血清的RPMI 1640培养基配成4×10⁴个/ml的细胞悬液，接种在96孔培养 板中，每孔接种100μl，37℃，5％CO₂培养24h。对照孔加入100μl新鲜培养 基，实验孔加入100μl所需浓度的待测药物，每组设3个平行孔，37℃，5％CO₂培养2d。除了设定对照组(C)及加药组(T)细胞的OD值外，铺设单独的对 照平板用来测定加药时细胞的OD值(To)，在加药前即刻将平板中接种的细胞 用三氯乙酸(TCA)固定。细胞在加药培养结束后用TCA固定。每个小孔加预 冷的50％TCA液50μl(TCA最终浓度为10％)固定。加TCA时必须轻轻地 加在培养液表面，静止5min之后再将平板移至4℃放置1h，这样可使悬浮细胞 固定在培养孔的底部。倒掉固定液，小孔用去离子水洗5遍.甩干，空气干燥。 SRB用1％醋酸配成0.4％溶液。每孔加入100μl SRB液，在室温放置染色10min。 未与蛋白结合的SRB用1％醋酸洗5遍，空气干燥。结合的SRB用150μl 10 mmol/L非缓冲Tris碱液(pH 10.5)溶解。用酶标仪在570nm波长处测定每个小 孔的OD值。以同一样品的不同浓度对肿瘤细胞生长抑制率(％T/C)作图得到 剂量反应曲线，可从中求出样品的半数抑制浓度IC₅₀。

实验结果参见表3.

表3化合物HDF的细胞毒作用

表3结果显示化合物HDF对人白血病细胞系HL-60细胞毒性要强于对人肝 癌细胞系SMMC-7721细胞的毒性。

3.2流式细胞分析术研究发现化合物HDF可诱导细胞发生凋亡

实验方法：应用Annexin V-FITC凋亡检测试剂盒，按照说明书要求操作。 简述如下。悬浮细胞或贴壁细胞经胰蛋白酶消化成单个细胞后，1000rpm，10 分钟，离心收集细胞。用冷PBS洗涤细胞两次。用400μl 1×Binding Buffer悬 浮细胞，浓度大约为1×10⁶cells/ml。在细胞悬浮液中加入5μl Annexin V-FITC， 轻轻混匀后于2-8℃避光条件下孵育15分钟。加入10μl PI，轻轻混匀，于2-8℃ 避光条件下孵育5分钟。在1小时内用流式细胞仪检测。

实验结果参见附图6至附图9

图6至图9中已分别标出早期凋亡细胞和晚期凋亡细胞分布情况。可见， 经化合物HDF处理后，18.2％的HL-60细胞和82.9％的SMMC-7721细胞出现了 早期凋亡。

表4化合物HDF(30μg/ml)处理细胞24小时后诱导细胞发生凋亡情况。

表4化合物HDF能显著促进细胞发生凋亡。

4.结论

综上所述，化合物HDF能特异性地阻断肿瘤细胞周期于G₂期，抑制细胞 增殖，诱导细胞凋亡。因此，本发明提供了细胞周期研究的新工具，为抗肿瘤 药物研发提供了新的化合物。