登革热病毒III型/IV型双重荧光PCR检测试剂盒

摘要

本发明公开了登革热病毒III型/IV型双重荧光PCR检测试剂盒，属于登革热病毒的检测领域。本发明试剂盒包括以下各组分：RT-PCR反应液、酶混合液、登革热病毒III型/IV型双重反应液和去RNA酶水。本发明登革热病毒III型/IV型双重荧光PCR检测试剂盒解决了现有的体外检测试剂盒无法在同一反应管中同时检测出登革热病毒不同亚型的问题，能够在同一反应管中同时检测出登革热病毒III型和IV型，具有特异性强、灵敏性高，还具有操作简便、可重复性强、检测结果快速客观等优点。

说明书

技术领域

本发明涉及一种登革热病毒体外检测试剂盒，尤其涉及登革热病毒III型 /IV型双重荧光PCR检测试剂盒，本发明属于登革热病毒血清型的体外检测 领域。

背景技术

登革热(Classical dengue fever，DF)是由登革热病毒(dengue virus) 的4个血清型引起的一种急性传染病，主要通过埃及伊蚊和白纹伊蚊传播， 临床上以高热、出血、全身肌肉和关节痛等为主要症状，可伴有皮疹、淋巴 腺肿和白细胞减少。登革热病毒感染除引起登革热外，严重的还可导致登革 出血热(denguehemorrhagic fever，DHF)或登革休克综合症(dengue  shocksyndrome，DSS)等症状。

DHF以高热、出血、休克和高病死率为特征，是较为严重的一种临床类 型。由于全球气候变暖、国际旅游频繁和对蚊虫缺乏有效的控制，登革热在 世界范围内发生过多次大流行，全球有100多个国家出现流行，据WHO统 计，每年登革热感染人数有5000万，全世界有25亿人正受到感染登革病毒 的威胁，每年均出现几百万病例，是较为严重的公共卫生问题。

登革病毒是黄病毒科(flaviviridae)黄病毒属(flavivirus)登革 亚组的重要成员，自然界中存在的登革病毒可分为4个血清型。登革热的传 染源主要是处于病毒血症期的显性和隐性的感染者，在城市型疫源地区患者 和隐性感染者是主要的传染来源。在新疫区普遍易感。但以青壮年发病率最 高。在地方性流行区，20岁以下的居民，100％在血清中能检出抗登革热病 毒的中和抗体，因而发病者多为儿童。

登革热的发现已有200多年的历史，早期记载的报道是1779年埃及开 罗、印度尼西亚雅加达及美国费城，并根据症状命名为关节热和骨折热。 1869年由英国伦敦皇家内科学会命名为登革热。中国于1978年在广东流行， 并分离出IV型登革热病毒。此后，1979、1980、1985年小流行中分离出I 型、II、III型病毒。目前各地区主要以散在暴发或散发为主，并且以输入型 病例引发的流行居多。

实时荧光定量PCR技术(Real-time quantitative Polymerase Chain  Reaction简称Real Time PCR)是在定性PCR技术基础上发展起来的核酸定 量技术。实时荧光定量PCR技术于1996年由美国Applied biosystems公司 推出，在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号积累实时监测整个 PCR进程，使每一个循环变得“可见”，最后通过Ct值和标准曲线对样品中 的DNA(cDNA)的起始浓度进行定量的方法。如果用于RNA检测，这被称为逆 转录实时PCR即(Real-time RT-PCR)是实时PCR法，它是指对DNA或经过 反转录(RT-PCR)的RNA通过聚合酶链式反应并实时监测DNA的放大过程， 在扩增的指数增长期就测量扩增产物，因为扩增指数增长期测量值与特异 DNA(RNA)起始量存在相关性，从而实现定量检测。RealTime PCR的基本目 标是精确测量和鉴别非常微量的特异性核酸，从而可通过监测CT值而实现 对原始目标基因的含量定量。实时荧光定量PCR法最大的优点是克服了终点 PCR法进入平台期或叫饱和期后定量的较大误差，实现DNA/RNA的精确定 量。该技术不仅实现了对DNA/RNA模板的定量，而且具有灵敏性和特异性 高、能实现多重反应、自动化程度高、无污染、实时和准确等特点。此外， 通过在该体系中加入两条或者两条以上引物及对应的探针，便可实现对多种 病原体的同时检测。

现有的登革热病毒体外诊断试剂盒大多不能够同时在一个反应管中分别 检测出登革热病毒III型和IV型，且存在特异性和灵敏性较低、检测步骤繁琐 等缺陷，有待改进。

发明内容

本发明的主要目的提供是一种能够同时在一个反应管中分别检测出登革 热病毒III型、IV型的双重荧光PCR检测试剂盒，具有特异性强、灵敏性高等 优点。

为了达到上述目的，本发明采用了这样的技术方案：

一种登革热病毒III型/IV型双重荧光PCR检测试剂盒，包括以下各组 分：RT-PCR反应液、酶混合液、登革热病毒III型/IV双重反应液和去RNA酶 水。

其中，所述的登革热病毒III型/IV型双重反应液由以下2组组分组成：

组分(1)：由一对检测登革热病毒III型的引物和一条检测登革热病毒III 型的探针组成；其中，两条引物的碱基序列分别为SEQ ID No.1和SEQ ID  No.2所示；探针的碱基序列为SEQ ID No.3所示，该探针的5′端标记有荧 光报告基团，3′端标记有荧光淬灭基团。

组分(2)：由一对检测登革热病毒IV型的引物和一条检测登革热病毒IV 型的探针组成；其中，两条引物的碱基序列分别为SEQ ID No.4和SEQ ID No.5所示；探针的碱基序列为SEQ ID No.6所示，该探针的5′端标记有荧 光报告基团，3′端标记有荧光淬灭基团。

其中，所述的荧光报告基团包括FAM、HEX、ROX、CY3或CY5等荧光报 告基团；所述的荧光淬灭基团包括BHQ1、BHQ2或BHQ3等荧光淬灭基团；

本发明对上述引物和探针的配比比例进行了摸索和优化，试验结果发 现，它们之间不同的配比比例对于检测结果的特异性和灵敏性具有显著的差 异，本发明通过高通量的筛选试验发现，上述引物和探针在下述配比下，具 有最优的检测效果：

检测登革热病毒III型的引物及探针的配比分别为：SEQ ID No.1∶SEQ ID  No.2∶SEQ ID No.3＝500nM∶500nM∶400nM；

检测登革热病毒IV型的引物及探针的配比分别为：SEQ ID No.4∶SEQ ID  No.5∶SEQ ID No.6＝600nM∶600nM∶300nM。

表1登革热病毒III型/IV型引物探针

表2登革热病毒III型/IV型双重反应液组分

  试剂名称   加入体积(μl)/50反应   登革热病毒III型FP(SEQ ID No.1)   6.25   登革热病毒III型RP(SEQ ID No.2)   6.25   登革热病毒III型P(SEQ ID No.3)   5   登革热病毒IV型FP(SEQ ID No.4)   7.5   登革热病毒IV型RP(SEQ ID No.5)   7.5   登革热病毒IV型P(SEQ ID No.6)   3.75

为了达到更好的检测效果，本发明试剂盒中还可含有登革热病毒III型 /IV型的阳性参考品(购自北京三博远志生物科技有限公司或上海捷瑞生物 工程有限公司)。

所述的酶混合液包括RNA酶抑制剂、Taq酶、逆转录酶、10×缓冲液、 去RNA酶水。逆转录酶和DNA聚合酶在PCR扩增中起着非常重要的作用，包 括逆转录、扩增的效率和特异性，为了达到更好的效果，本发明优选采用M- MLV逆转录酶和热启动酶。

本发明的另一个目的是提供本发明试剂盒检测登革热病毒III型/IV型的 使用方法，包括：

(1)提取样本的RNA；

(2)准备以下组分：RT-PCR反应液12.5ul，酶混合液1ul，登革热 病毒III型/IV型反应液4ul，去RNA酶水2.5ul，RNA样本5ul。

(3)RT-PCR扩增：按照以下程序进行RT-PCR扩增

(4)结果判定：在FAM通道内荧光曲线呈“S”型曲线且CT≤35.0，判 断为登革热病毒III型为阳性；无典型“S”型扩增或CT＞35.0，判断为登革热 病毒III型为阴性。在VIC通道内荧光曲线呈“S”型曲线且CT≤35.0，判断 为登革热病毒IV型为阳性；无典型“S”型扩增或CT＞35.0，判断为登革热病 毒IV型为阴性。

检测前，先按照常规的RNA提取方法对样本提取RNA，将待测标本加入 准备好的登革热病毒III型/IV型试剂的PCR反应管中，在荧光定量PCR扩增 仪中扩增检测。扩增结束后，根据荧光曲线判断是否感染革热病毒III型或IV 型。

本发明登革热病毒III型/IV型双重荧光PCR检测试剂盒能够同时检测出 登革热病毒III型和IV型，解决了现有产品只能在一管反应中检测一种亚型登 革热病毒的问题。本发明还具有操作简便、可重复性强、检测结果快速客观 等优点，在登革热体外诊断领域具有极广的应用前景。

附图说明

图1本发明试剂盒检测五组样本的曲线图。

图2本发明试剂盒检测登革热病毒III型的灵敏性试验结果。

图3本发明试剂盒检测登革热病毒IV型的灵敏性试验结果。

图4本发明试剂盒检测登革热病毒III型的特异性试验结果。

图5本发明试剂盒检测登革热病毒IV型的特异性试验结果。

具体实施方式

下面结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随 着描述而更为清楚。但这些实施例仅是范例性的，并不对本发明的范围构成 任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下 可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改和替换均 落入本发明的保护范围内。

试验例1 本发明登革热病毒III型/IV型双重荧光PCR试剂盒临床样本的检 测试验

1样本处理(RNA提取)

1.1取200ul登革热临床样品，加入400ul Binding Buffer  supplemented with Poly(A)，充分混匀后转入高纯化过滤管，8000rmp离 心15s，弃去收集管中的废液。

1.2加入500ul Inhibitor Removal Buffer至过滤管，8000rmp离心 1min，弃去收集管中的废液。

1.3加入450ul Washing Buffer至过滤管，8000rmp离心1min，弃 去收集管中的废液。

1.4重复步骤3，然后高速离心10s，此步骤务必将废液去除干净.

1.5加入50ul Elution Buffer至过滤管中，室温静置2min，8000 rmp离心1min，离心所得溶液即为纯化的RNA。

2试剂准备

表3

3PCR扩增程序

4结果分析：5个临床样本具体结果见表4和图1。

表4

试验例2 本发明登革热病毒III型/IV型双重荧光PCR试剂盒灵敏性试验

本试验对登革热病毒III型质粒(购自北京三博远志生物科技有限公司) 和登革热病毒IV型质粒(购自上海捷瑞生物工程有限公司)进行10倍倍比 稀释，检测结果表明，本发明试剂盒具有良好的灵敏性，并且CT值随浓度 减少呈梯度改变(图2、图3)。试验结果表明，本发明试剂盒对于登革热病 毒III型/IV型的诊断具有高度的灵敏性。

试验例3本发明登革热病毒III型/IV型双重荧光PCR试剂盒特异性试验

为了检测本发明试剂盒的特异性，用本发明登革热病毒III型/IV型检测 试剂盒检测登革热病毒毒株、西尼罗病毒株、乙脑病毒毒株、基孔肯雅病毒 毒株、黄热病毒毒株、辛德毕斯病毒毒株等。

试验结果表明，FAM通道仅对登革热病毒III型进行扩增(图4)，VIC通道 仅对登革热病毒IV型进行扩增(图5)。表明本发明检测试剂盒能特异性扩增 登革热病毒而不与其它病毒核酸发生交叉反应。

KLPI110307

<110>江苏硕世生物科技有限公司

<120>登革热病毒III型/IV型双重荧光PCR检测试剂盒

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<170>PatentIn version 3.5

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