一种齐考诺肽的固相合成方法

摘要

本发明公开了一种齐考诺肽的固相合成方法，以Fmoc-氨基树脂为固相载体，依次缩合反应连接25个保护的氨基酸，得到线性全保护肽树脂，形成二硫键的三组Cys分别连接Trt、Acm或tBu保护基；切割树脂，同时脱去除Acm和tBu的其它所有氨基酸的保护基，得到含Acm和tBu的线性肽；氧化线性肽形成第一对二硫键，同时脱除Acm并形成第二对二硫键，得到二环肽树脂；脱除二环肽树脂中的tBu，同时环化形成第三对二硫键，得到齐考诺肽。本发明巧妙选用了Trt、Acm、tBu来分别保护三组Cys，提高了二硫键形成的准确率，然而切除树脂后仅仅通过两步反应完成了三对二硫键的依次形成，精简步骤的同时提高了产率。

说明书

技术领域

本发明涉及一种齐考诺肽的固相合成方法。

背景技术

齐考诺肽(ziconotide)，商品名为Prialt，开发与上市厂商是美国Elan公司，2005 年1月首次在美国上市，2005年2月获欧盟许可。适应症主要有：对啮齿类动物急、慢 性和神经病性疼痛模型具有强效镇痛作用，可安全有效的缓解恶性和非恶性疼痛病人的 疼痛，包括鸦片类药物治疗无效的病人，且耐受性良好，还用于部分其他镇痛治疗疗效 差的严重慢性疼痛患者。药效优于其他镇痛产品，鞘内注射时其镇痛功效比吗啡强1000 倍，且不会出现使用吗啡时的副反应，如呼吸抑制和产生耐药性。其特点是需要鞘内给 药，可通过血脑屏障而发挥药效。药理作用表现为结合并阻断脊髓背角浅层内的初级伤 害感受性传入神经上的N-型钙通道，从而阻止初级传入神经末梢兴奋性神经递质的释 放，对抗伤害感受。药代动力学表现为药物进入全身循环后，被组织中的肽酶或蛋白酶 降解为多肽片段和游离氨基酸，极少量随尿液排泄。副作用表现为：剂量依赖性的心血 管系统反应，如心率缓慢和直立性低血压；中枢神经系统反应，眩晕、眼球震颤、共济 失调、兴奋、幻觉、镇静和昏迷等，在停用药物几天后消失。不存在耐受和成瘾现象， 是非阿片类镇痛药物。

齐考诺肽是ω-芋螺毒素MVIIA的合成形式，天然型存在于海螺(Conus magus)体 内，是由25个氨基酸组成的阳离子多肽，包括3对二硫键连接的6个半胱氨酸残基(这 是此肽合成的主要难点)，分子量为2639.12。它是特异性/选择性的N型电压敏感性钙 通道(N-type voltage-sensitive calcium channels，N-type VSCCs)阻断剂，对其他受体， 尤其是阿片受体没有明显的亲和力。

上述齐考诺肽的一条合成路线^[1]如下：

该方法使用经典的Fmoc-固相合成法，以Fmoc-Rink Amide-MBHA树脂为固相载体， 以HOBt和N，N，-二异丙基碳二亚胺为缩合剂依次将侧链保护的氨基酸连到树脂上，室温 搅拌反应2.5小时反应得到含25个氨基酸的线性全保护肽树脂，其中形成二硫键的三组 Cys分别由Trt、Acm、Mob保护，不同组Cys由不同的保护基保护，同组Cys由同一种保 护基保护。将线性全保护肽树脂溶于1％的三氟乙酸/二氯甲烷室温反应20分钟脱去Trt保 护基，过滤后加入水/己腈/DMSO(体积比10∶15∶1)，用稀氨水调节pH至8，室温下搅拌 反应一小时，得到齐考诺肽一环肽树脂。在得到的一环肽树脂中加入0.4mmol/ml的碘/ 甲醇溶液，室温反应2小时，洗涤过滤得到齐考诺肽二环肽树脂。将得到的二环肽树脂 溶于溶于三氟醋酸、三氟甲磺酸、硫代苯甲醚、乙二硫醇(体积比：80∶8∶8∶4)混合溶 液中，室温反应3小时，过滤后溶于水中，调pH至8，双氧水存在下室温反应一小时，冷 乙醚沉淀得到粗肽，HPLC制备纯化得到齐考诺肽。

整个合成过程反应流程如图1所示。

上述合成路线具有合成步骤繁琐的缺点。而且该技术是在固相条件下完成前两个二 硫键的氧化，重复难度很大。

齐考诺肽的合成路线II^[2]：

该方法以氨基树脂为固相载体，用HATU、HOAt、TMP为缩合剂与Fmoc-Cys(Acm) 缩合得到Fmoc-Cys(Acm)-氨基树脂。该树脂肽与F-moc氨基酸在HOBt、DIC作用下生 成全保护的线性全保护肽，其中全部Cys侧链均用Acm保护。使用TFA/苯甲醚/苯甲硫醚 /乙二硫醇(90∶5∶3∶2)切下树脂，得到Cys侧链含有Acm的齐考诺肽线性粗肽。将粗肽脱 盐，然后用TFA-anisole溶解，加入TI(TFA)₃反应得到不含保护基的线性齐考诺肽。酸性 条件下空气氧化得到齐考诺肽，纯化得到精肽，总收率在30％以上。

整个合成过程反应式如图2所示。

齐考诺肽的合成路线II具有二硫键的连接准确率低、产率低的缺点，总产率仅为 30％。最后的分离纯化也有很大难度。

参考文献：

[1]路杨，李新宇.齐考诺肽的固相合成方法：中国，200710301598.8[P].2009-04-22.

[2]宓鹏程，李红玲，马亚平，袁建成.一种齐考诺肽制备的方法：中国， 200910188686.0[P].2010-05-19.

发明内容

本发明所要解决的技术问题是提供一种步骤精简且收率高的齐考诺肽的固相合成 方法。

为解决上述技术问题，本发明采用的技术方案如下：

一种齐考诺肽的固相合成方法，该方法包括如下步骤：

(1)以Fmoc-氨基树脂为固相载体，从C端到N端依次缩合反应连接25个侧链保 护的氨基酸，得到25个氨基酸的线性全保护肽树脂，其中，形成二硫键的三组Cys(1-16、 8-20、15-25)分别连接Trt、Acm或tBu保护基，同组的Cys连接相同保护基，不同组 的Cys连接不同的保护基；

(2)将步骤(1)得到的线性全保护肽树脂中的树脂进行切割，切割的同时脱去除Cys (Acm)和Cys(tBu)的其它所有氨基酸的侧链保护基，得到含Cys(Acm)和Cys(tBu) 的线性肽；

(3)氧化步骤(2)得到的线性肽形成第一对二硫键，同时脱除Cys(Acm)中的Acm保护 基并形成第二对二硫键，得到二环肽；

(4)脱除步骤(3)得到的二环肽中的Cys(tBu)的tBu保护基，同时环化形成第三对二 硫键，得到含三对二硫键的齐考诺肽。

所合成的齐考诺肽具有如下结构：

步骤(1)中，所述的氨基树脂为Rink-Amide-MBHA、Rink-Amide树脂、 Rink-Amide-BHA树脂、Rink-Amide-AM树脂或Sieber树脂。

步骤(1)中，25个氨基酸的线性全保护肽树脂为：

H-Cys(tBu)-Lys(Boc)-Gly-Lys(Boc)-Gly-Ala-Lys(Boc)-Cys(Acm)-Ser(tBu)-Arg(pbf)- Leu-Met-Tyr(tBu)-Asp(OtBu)-Cys(Trt)-Cys(tBu)-Thr-Gly-Ser(tBu)-Cys(Acm)- Arg(pbf)-Ser(tBu)-Gly-Lys(Boc)-Cys(Trt)-氨基树脂

步骤(1)中，按1∶(1～5)∶(1～5)∶(1～5)∶(2～10)的摩尔比分别称取溶胀后的氨基树脂、 Fmoc保护氨基酸、HoBt、HBTU和DIPEA，将Fmoc保护氨基酸、HoBt、HBTU和DIPEA 溶于二甲基甲酰胺，预活化，然后加入溶胀后的氨基树脂，室温震荡反应0.5～3小时连接 Fmoc保护氨基酸，连接下一个氨基酸之前Fmoc的脱除用哌啶的N，N二甲基甲酰胺溶液脱 Fmoc保护基2次，时间分别为3-5分钟和15-25分钟，优选时间分别为5分钟和20分钟，每 次连接上一个氨基酸和脱除Fmoc保护基后用二氯甲烷和二甲基甲酰胺交替洗涤3-10次， 优选6次。氨基树脂、Fmoc保护氨基酸、HoBt、HBTU和DIPEA的摩尔比优选为1∶4∶4∶4∶8。 所述的溶胀后的氨基树脂采用如下方法制备得到：用相对树脂体积2-10倍量的二氯甲烷 溶胀树脂，待树脂溶胀完全后，用哌啶的N，N二甲基甲酰胺溶液脱Fmoc保护基2次，时 间分别为5分钟和20分钟，再用二氯甲烷和N，N-二甲基甲酰胺交替洗涤树脂即得。所述 氨基树脂的摩尔数以取代值×树脂质量计。

步骤(2)中，将三氟乙酸、苯甲硫醚、二巯基乙烷和苯甲醚按90∶5∶2.5∶2.5的体积比混 合，或者，将三氟乙酸、甲醇、水和三异丙基硅烷按体积比88∶5∶5∶2混合，将步骤(1)得 到线性全保护肽树脂加入上述两种混合液中的任意一种中，每1g线性全保护肽树脂使用 混合液的体积为10-20mL，震荡反应0.5～3小时后，将反应液注入-20℃冷乙醚中，沉淀， 离心后收集沉淀，得到含Cys(Acm)和Cys(tBu)的线性肽。

步骤(3)中，将步骤(2)得到的线性肽溶于乙酸，使线性肽的浓度约为0.5mg/mL，加 入线性肽的10倍摩尔量的I₂(I₂事先溶于甲醇)，室温搅拌反应1小时，反应完全与否用 HPLC检测，然后加入水，水的加入体积约为反应液体积的20％，反应完全后，加入抗 坏血酸直到溶液变为无色，反应混合液冻干，得到二环肽。

步骤(4)中，将二甲基亚砜和苯甲醚溶于三氟乙酸配制成氧化溶液，二甲基亚砜、苯 甲醚和三氟乙酸的体积比为258∶1.6∶100000，将步骤(3)得到的二环肽加入上述氧化溶液 中，使得二环肽树脂的浓度约为0.1mg/mL，室温震荡反应3-7小时，优选5小时，加 水稀释，纯化后得到齐考诺肽，所述的纯化方法是冻干后经冷乙醚洗涤再用HPLC纯化。

本发明关键技术部分的合成示意图见图3所示。

有益效果：本发明为齐考诺肽的一种合成方法，同时结合了线性肽的固相合成和三 对二硫键在液相条件下的形成。与现有技术相比，本发明巧妙选用了Trt、Acm、tBu来 分别保护三组Cys，提高了二硫键形成的准确率，然而切除树脂后仅仅通过两步反应完 成了三对二硫键的依次形成，精简步骤的同时提高了产率。

相比专利200710301598.8，从肽树脂起，反应步骤精简3步，另外此方法完全可以 在多肽自动合成仪上实施，可以高度重现实验结果；相比专利200910188686.0，本发明 采用分步脱保护并合成二硫键的方法，兼有专利200710301598.8的特点，步骤数相同， 因为二硫键形成有序，产品更易于制备纯化。

附图说明

图1为背景技术中合成路线I的反应流程图。

图2为背景技术中合成路线II的反应流程图。

图3为本发明的合成路线示意图。

具体实施方式

根据下述实施例，可以更好地理解本发明。然而，本领域的技术人员容易理解，实 施例所描述的具体的物料配比、工艺条件及其结果仅用于说明本发明，而不应当也不会 限制权利要求书中所详细描述的本发明。

说明书或权利要就书中所使用的缩写含义列于下表：

 Fmoc   9-芴甲氧羰基  DCM   二氯甲烷  DMF   N，N-二甲基甲酰胺  HOBT   1-羟基苯并三唑  HBTU   苯并三氮唑-N，N，N′，N′-四甲基脲六氟磷酸酯  DIPEA   N，N-二异丙基乙胺  DMSO   二甲基亚枫  HATU   2-(7-偶氮苯并三氮唑)-N，N，N′，N′-四甲基脲六氟磷酸酯  HOAt   N-羟基-7-偶氮苯并三氮唑  TMP   磷酸三甲酯  DIC   N，N′-二异丙基碳二亚胺  TI(TFA)₃  三氟乙酸铊  Anisole   苯甲醚  TFA   三氟乙酸  HOAC   乙酸  Thioanisole   苯甲硫醚  EDT   乙二胺四乙酸

实施例1：齐考诺肽线性肽树脂的制备。

树脂溶胀：称取1g Fmoc-Rink-Amide-MBHA树脂置于加筛板的20ml BD注射器 (普通玻璃肽反应器也可以)，用3倍树脂体积的DCM溶胀1-4小时，等到树脂溶胀完 全后用20％(v/v)哌啶/DMF溶液脱Fmoc保护基2次，时间分别为5min和20min，DCM 和DMF交替洗涤6次。

氨基酸连接：将2mmol的Fmoc保护氨基酸、2mmol的HoBt、2mmol的HBTU、 4mmol的DIPEA溶于DMF，预活化5分钟，然后加入溶胀好的树脂(树脂质量*取代 值＝0.5mmol)中，室温震荡反应1.5-2.5小时，每一种氨基酸、缩合剂的用量及具体反 应时间见表1。连接下一个氨基酸之前Fmoc的脱除用哌啶的N，N二甲基甲酰胺溶液脱 Fmoc保护基2次，时间分别为5分钟和20分钟，每次连接上一个氨基酸和脱除Fmoc 保护基后用二氯甲烷和二甲基甲酰胺交替洗涤6次。每一步的脱Fmoc结果和反应终点 由茚三酮法检测。最终得到：

H-Cys(tBu)-Lys(Boc)-Gly-Lys(Boc)-Gly-Ala-Lys(Boc)-Cys(Acm)-Ser(tBu)-Arg(pbf)-Leu-M et-Tyr(tBu)-Asp(otBu)-Cys(Trt)-Cys(tBu)-Thr-Gly-Ser(tBu)-Cys(Acm)-Arg(pbf)-Ser(tBu)-Gl y-Lys(Boc)-Cys(Trt)-Rink-Amide-MBHA。

肽树脂干重2.9g，该步粗产率为87％。

茚三酮法为：挑取少量脱Fmoc的树脂放入试管进行茚三酮检测，试管中分别滴加茚 检试剂I、II、III各两滴，然后沸水浴加热3min，观察试管中树脂的颜色变化。树脂显 蓝色则表明脱Fmoc完全。[Kaiser，R.L.Colescott，C.D.Bossinger，P.I.Cook，Analytical  Biochemistry 34 595(1970).]

表1每种氨基酸、缩合剂的用量及反应时间

  氨基酸名称   氨基酸用量(mg)   HoBt(mg)   HBTU(mg)   DIPEA(ml)   反应时间(h)   Fmoc-Cys(Trt)-OH   1181.4   270.2   758.4   0.65   2   Fmoc-Lys(Boc)-OH   973.2   270.2   758.4   0.65   2.5   Fmoc-Gly-OH   594.6   270.2   758.4   0.65   1.5   Fmoc-Ser(tBu)-OH   766.8   270.2   758.4   0.65   1.5   Fmoc-Arg(pbf)-OH   1297.6   270.2   758.4   0.65   2.5   Fmoc-Cys(Acm)-OH   829   270.2   758.4   0.65   2   Fmoc-Thr-OH   682.8   270.2   758.4   0.65   1.5   Fmoc-Cys(tBu)-OH   799   270.2   758.4   0.65   2   Fmoc-Asp(otBu)-OH   823   270.2   758.4   0.65   1.5   Fmoc-Tyr(tBu)-OH   919   270.2   758.4   0.65   2   Fmoc-Met-OH   743   270.2   758.4   0.65   1.5   Fmoc-Leu-OH   706.8   270.2   758.4   0.65   2.5   Fmoc-Ala-OH   622.6   270.2   758.4   0.65   2

注：不同连接位置的相同氨基酸用量及反应时间相同，故没有重复罗列。

实施例2：树脂的切割及部分侧链保护基的脱除。

将三氟乙酸、苯甲硫醚、二巯基乙烷和苯甲醚按90∶5∶2.5∶2.5的体积比混合，或者， 将三氟乙酸、甲醇、水和三异丙基硅烷按体积比88∶5∶5∶2混合，将实施例1制得的线性 全保护肽树脂加入上述两种混合液中的任意一种中，每1g线性全保护肽树脂使用混合 液的体积为10mL，震荡反应2小时后将反应液注入-20℃冷乙醚，沉淀，离心后收集 白色沉淀，风干得到Cys侧链含有Acm和tBu的线性粗肽，重1.4g，粗产率为94％。

实施例3：齐考诺肽二环肽的形成。

实施例2制得的线性肽1.0g溶于乙酸，使线性肽的浓度为0.5mg/mL，再加入10 倍摩尔量的I₂(溶于甲醇)，室温搅拌反应1小时，然后加入反应液体积20％的水，反应 完全与否用HPLC检测，反应完全后，加入0.1M的抗坏血酸直到溶液变为无色，反应 混合液冻干，用乙醚洗涤沉淀后得到Cys侧链含有tBu的二环肽粗肽，重0.91g，该步 粗产率为91％。

分析型HPLC检测方法为：

装备：C18分析柱：4.6×150mm；

洗脱液A：0.1％(v/v)TFA/H₂O；

洗脱液B：0.08％(v/v)TFA/乙腈；

流速：1ml/min；

检测波长：220nm；

洗脱梯度：5％-95％。

实施例4：齐考诺肽三环肽的形成

具有tBu保护基的环肽(实施例3)27.5mg以0.1mg/ml溶于该氧化溶液(氧化溶 液的配制：将二甲基亚砜和苯甲醚溶于三氟乙酸配制成氧化溶液，二甲基亚砜、苯甲醚 和三氟乙酸的体积比为(258∶1.6∶100000)，室温震荡反应5小时然后加水稀释，混合物冻 干后，HPLC进一步纯化得到含三对二硫键的齐考诺肽，重15.8mg，该步产率为60％。

HPLC纯化方法：

装备：C18制备柱：20×250mm；

洗脱液A：0.1％(v/v)TFA/H₂O；

洗脱液B：0.08％(v/v)TFA/乙腈；

流速：8ml/min；

检测波长：220nm；

洗脱梯度：5％-70％。