一种柯萨奇病毒A16型(CA16)IgM抗体检测试纸条

摘要

本发明提供了一种用于检测柯萨奇病毒A16型(CA16)IgM抗体的检测试纸条。它是在硝酸纤维膜(NC膜)上包被CA16基因抗原(VP1)和抗鼠IgG，结合胶体金标记的抗人IgM单克隆抗体，应用膜层析捕获法，检测感染人标本中CA16特异性IgM抗体。应用本发明试纸条检测，操作简单、方便、快速、简捷，不需特殊仪器设备，不需专业培训，结果清晰易辨，操作简单，易于推广，适合基层，适合于现场检测和早期诊断，对CA16感染诊断起到辅助作用。

说明书

技术领域

本发明属于生物检测领域，具体涉及一种柯萨奇病毒A16型(CA16)IgM 抗体检测试纸条及其应用。

背景技术

柯萨奇病毒(Coxsackievirus)是一种人类疾病严重的致病病原，其感染可以 导致许多疾病，从较轻的呼吸道感染疾病，到比较严重的心肌炎、心包炎及 神经系统的一些疾病，甚至可以引起婴幼儿死亡。CoxV可分A、B两组：A 组病毒有24个血清型，B组有6个血清型。B组所有型别和A组第9型有共 同组特异性抗原；B组各型病毒血清型之间有交叉反应，而A组没有。感染 人体的CoxV以A组居多，引起手足口病的CoxV多以A16型、A4型、A5 型、A7型、A10型、B2型、B5型、B13型为主。CoxV为单股正链RNA 病毒，分子量为(2～2.8)×106，呈球形，直径20-30nm，无包膜，含有由32 个壳微粒形成的二十面体立体对称的衣壳；耐低温，对乙醚、乙醇、来苏尔 等消毒液敏感，对热、干燥、紫外线等也较敏感。

柯萨奇病毒是单股正链RNA病毒，病毒颗粒呈球形，为二十面体立体对 称，无包膜。基因组全长为7389～7402个核苷酸，不包括3’端的多聚腺苷酸 尾。在柯萨奇病毒基因组的5’端，以共价键结合了一个小的蛋白质，称为毒 粒蛋白，叉称VPg；而在3’末端有一个多聚腺苷酸尾，其由几十个到近百个 腺苷酸连结而成。柯萨奇病毒RNA基因组的顺序依次为5’端非编码区，P1 区、P2区、P3区和一段3’端非编码区(图1)。病毒外壳由结构蛋白VP1、VP2、 VP3和VP4构成，其中VP1、VP2、VP3裸露于病毒外壳表面，VP4隐藏于 病毒外壳内面。

Cox A16的基因组长约7400bp，包括5′及3′端的非编码区和中间一个大 的开放读码框(ORF)，依次由VP4、VP2、VP3、VP1、2A、2B、2C、3A、3B、 3C、3D 11个基因组成，主要编码产生病毒结构蛋白和病毒复制所需要的酶类。 其中VP1区长891bp，编码含297个氨基酸的VP1蛋白。VP1是病毒主要的 中和抗原决定簇所在的部位，是肠道病毒血清型的分型依据。VP1区的核苷 酸序列也是肠道病毒基因分型的依据。

通过基因工程获得该抗原的表达蛋白，并用其作为抗原检测CA16的特异 性IgM抗体。

目前，手足口病的诊断，除了依据临床症状外，实验室诊断是不可缺如 的环节。实验室的诊断标准如下：

1)血液检查的细胞总数一般正常或偏高，分类时淋巴细胞较高，中性粒细 胞较低。2)有中枢神经系统并发症时，脑脊液细胞数可增多，蛋白升高。3) 发病后从粪便、咽喉漱口液分离或检测到相关病毒。4)从脑脊液或疱疹液分离 或检测到相关病毒。5)从早期血清中检测出相关病毒IgM抗体。6)恢复期血清 中和抗体比急性期有≥4倍的增长。

然而到目前为止，还没有一种能够方便、快捷检测CA16特异性IgM抗 体的试纸条的报道。

发明内容

(一)、要解决的技术问题

发明的目的是提供一种使用方便、快捷，用于检测CA16特异性IgM抗 体的试纸条，检测感染患者标本中CA16特异性IgM抗体，用于人CA16感 染的辅助诊断。

(二)、技术方案

本发明提供了一种检测试纸条，它包含以下成分：

(1)包被CA16病毒抗原VP1和二抗IgG两个条带的反应膜；

(2)含有胶体金标记的抗人IgM单克隆抗体的结合物释放垫。

上述二抗可以是抗鼠IgG二抗，所述反应膜可以是硝酸纤维素膜，所述 结合物释放垫可以是玻璃纤维膜。

本发明还提供制备上述试纸条的方法，其包括如下步骤：

1)将CA16病毒抗原VP1以及二抗IgG在反应膜上分别形成检测带和质 控带，备用；

2)用胶体金标记抗人IgM单克隆抗体，包被到结合物释放垫中；

3)将制备好的反应膜以及结合物释放垫与样本垫、吸水垫和反应支持物 组装成试纸条。

本发明还公开了所述试纸条在检测CA16特异性IgM抗体的应用。

本发明通过采用高纯度的纯化的CA16基因工程抗原VP1和抗鼠IgG分 别固相于硝酸纤维膜上(NC膜)，结合胶体金标记的抗人IgM单克隆抗体， 应用膜层析捕获法的原理检测人标本中的CA16特异性IgM抗体。

(三)、有益效果

本发明的试纸条利用胶体金标记技术和膜层析技术，用于快速定性检测 样本中可能存在的CA16特异性IgM抗体，达到快速筛检病人，及时诊断治 疗的目的。可节省大量人力物力，方便、快速、简捷，不需特殊仪器设备， 不需专业培训，结果清晰易辨，操作简单，易于推广，适合基层，适合于现 场检测和早期诊断，对CA16的感染诊断起到辅助作用。

附图说明

图1：A本发明试纸条的正面示意图；B  本发明试纸条的侧面示意图。 其中，1：吸水垫；2：硝酸纤维膜(T：CA16基因工程抗原VP1；C：包被 抗鼠IgG的质控条带)；3：含有胶体金标记的抗人IgM单克隆抗体的玻璃纤 维膜；4：金标抗体保护膜；5：反应支持物。

图2：检测结果示意图。其中，从左至右依次为：T、C两条线阳性；C 一条线阴性；T、C两条线阴性或仅有T线阳性，无效。

具体实施方式

以下实施例进一步说明本发明的内容，但不应理解为对本发明的限制。 在不背离本发明精神和实质的情况下，对本发明方法、步骤或条件所作的修 改或替换，均属于本发明的范围。

若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常 规手段。

实施例1：CA16特异性IgM抗体检测试纸条(胶体金法)(参见图1)

柯萨奇病毒A16型VP1抗原购于北京安波特基因技术有限公司

反应支持物为6.5cm×0.4cm PCV板；吸水垫为2cm×0.4cm的滤油纸； 2.0cm×0.4cm的硝酸纤维膜依次包被抗鼠IgG(2mg/ml)，CA16抗原 VP1(2.3mg/ml)，含有0.4cm×0.4cm胶体金标记的抗人IgM(标记量25μg/ml) 的单克隆抗体聚酯膜；样品垫2.7cm×0.4cm的玻璃纤维；即组成了柯萨奇病 毒A16型(CA16)IgM抗体检测试纸条(胶体金法)。

实施例2检测方法(参见图2)

将患者全血、血浆或血清标本100-150μl直接滴加入实施例1试纸条“4” 处，样品液沿膜上行，10-15分钟判读结果。

结果：

如检测样本中含有CA16的IgM抗体，则与试纸条上胶体金标记的抗人 IgM单克隆抗体形成相应的复合物，上行与包被在硝酸纤维膜上的CA16特异 性抗原VP1结合，形成红色线条，即在T处形成红色条带。

无论标本中是否含有相应的抗体，胶体金标记的抗人IgM单克隆抗体继 续向上爬行与包被在膜上的抗鼠IgG形成红色沉淀线，即在“C”处形成红色 条带。此线是质控线，如胶体金失效，此线就不会出现，说明试纸条失效。

取150例血清样本，其中，100例为柯萨奇病毒A16型临床阳性血清样 本，50例为正常血清样本，按上述的检测方法用实施例1的的试纸条对样本 进行检测。结果表明，100例临床阳性样本中检测出99例，正确率为99％， 50例正常血清样本均为阴性，正确率为100％。