用于口蹄疫病毒实时荧光RT-PCR检测的引物和方法

摘要

本发明公开了属于病毒检测技术领域的一种用于口蹄疫病毒实时荧光RT-PCR检测的引物和方法。本发明分析所有已报道的口蹄疫病毒通用型基因组序列，分别设计引物和荧光探针，通过实时荧光RT-PCR检测，得到口蹄疫通用型的特异性荧光曲线，可以确定血清型，检测结果可靠、准确灵敏、操作简单、省时省力、降低检测成本、提高检测效率。

说明书

技术领域

本发明属于病毒检测技术领域，具体涉及一种用于口蹄疫病毒通用型实时 荧光RT-PCR检测的引物和方法。

背景技术

口蹄疫病毒(Foot-and-mouth Disease Virus，FMDV)属小RNA病毒科属， 是最小的动物病毒之一。口蹄疫病毒是偶蹄兽共患的一种急性、热性、接触性 的烈性传染病，最易感染的动物是猪、黄牛、水牛、骆驼、羊、鹿等，黄羊、 麝、野猪、野牛等野生动物也易感染此病。此病由于有高传染性、高死亡率的 特点，所以传染范围大，速度快，且病毒生命力极强，一旦爆发，必须迅速扑 杀病畜及可疑感染动物，并对疫区进行彻底消毒。因此，口蹄疫病毒的每次爆 发流行，都意味着巨大的经济损失，对发展中国家的农业部经济而言，更是一 场不可预估的毁灭性灾难。

口蹄疫病毒共有O、A、C、Asia I、SAT1、SAT2和SAT3等7个血清型， 而每个血清型中又有许多的亚型，由于各个血清型之间交叉保护较少，因此， 每次疫病爆发后只能进行屠宰和集体焚毁，以绝后患。2001年英国在爆发口蹄 疫病毒的一个多月期间，大约30万头牲畜已被宰杀，口蹄疫病毒危机使英国的 经济损失将达到100亿美元，随后三周内还有近100万头牲畜被宰杀销毁。2003 年巴拉圭政府命令枪杀感染口蹄疫病毒的300多头牛羊，这场灾难给这个南美 国家造成5000多万美元的直接损失。2005年巴西口蹄疫病毒发生，世界41个 国家宣布暂时禁止从巴西进口牛肉，造成损失约5亿美元，如果情况继续发展 下去，2006年将损失10亿美元以上。可见口蹄疫病毒传播迅速、难于防治、 补救措施少，被称为畜牧业的“头号杀手”，严重影响农业经济的发展。

口蹄疫的暴发往往给国家的经济带来致命的打击。1951-1952年在英法爆发 的口蹄疫，造成的损失高达1.43亿英镑。因此世界各国都将其列为一类传染病 认真对待，并采取积极措施防止发生和防范从国外传入。1967年英国口蹄疫大 爆发导致40万头牛被屠宰，损失1.5亿英镑。最近一段时间，在东南亚地区多 次爆发口蹄疫，损失严重，仅台湾地区就宰杀猪超过20万头。1997年，台湾 爆发O型口蹄疫，当局被迫销毁340万头生猪，以防疫情进一步扩大。此次杀 猪行动导致台湾相关行业蒙受2700亿元新台币损失。2000年英国已宰杀了近 10万头牲畜后，口蹄疫席卷整个欧洲和世界上的其他国家。韩国、日本暴发口 蹄疫后，韩国政府决定投入5000亿韩元(5.2亿美元)收购并宰杀口蹄疫发病 地20公里以内地区的所有猪、牛等家畜。同时日本、美国、新加坡以及中国的 台湾和香港都已先后宣布禁止从韩国进口猪肉和牛肉，有些国家和地区甚至把 乳制品也列到禁止范围之内，给其本国带来极大的经济损失。因此，对于口蹄 疫这种一类传染性疾病，世界各国都不敢轻视，随时都严阵以待，采取各项积 极有效的措施，防止该病的发生，防范从国外传入。

实时荧光PCR技术是具有巨大发展潜力的高新检测技术，在许多领域已得 到了广泛应用，因此可以利用其解决口蹄疫病毒多血清型和高变异性给临床检 测造成的难题。实时荧光定量PCR技术是于1996年被首次推出的，该技术不 仅实现了PCR方法从定性到定量的飞跃，而且与常规PCR相比，它具有特异 性更强、检测周期更短、有效解决PCR污染问题、自动化程度高等特点，目前 已得到广泛应用。

常规反转录聚合酶链式反应(Reverse Transcription Polymerase Chain  Reaction，RT-PCR)是先将RNA反转录成cDNA，然后利用DNA聚合酶在体 外快速扩增目的DNA片断的技术。荧光实时RT-PCR是在普通RT-PCR的基础 上，在扩增反应体系中加入一对引物的同时再加入一个特异性的荧光探针，该 探针为两端分别标记荧光报告基团和荧光淬灭基团的寡核苷酸。在探针完整时， 报告基团发射的荧光信号被淬灭基团所吸收，从而检测不到该探针荧光基团所 发出的荧光信号，而在PCR扩增时，Taq酶的5’端外切酶活性将特异结合在目 的扩增片段上的荧光探针酶切降解，使荧光报告基团游离于反应体系中，脱离 了荧光淬灭基团的屏蔽作用，此时可以检测到荧光报告基团的荧光信号，荧光 信号量的变化与扩增产物量成正比。

由于口蹄疫病毒具有多个亚型且变异快，国内外疫情的发生情况又较复杂， 所以迫切需要建立一种特异敏感、准确可靠、快速简便的口蹄疫病毒检测方法， 用于快速检测国内外主要流行的口蹄疫病毒亚型，从而满足进出口检验检疫和 疫病监控的需要。

发明内容

本发明的目的在于提供用于检测口蹄疫病毒通用型的PCR引物和荧光探 针。

本发明的目的还在于提供利用上述PCR引物和荧光探针进行检测口蹄疫 病毒通用型的方法。

本发明通过以下技术方案实现：分析所有已报道的口蹄疫病毒通用型基因 组序列，分别设计引物和荧光探针。在常规RT-PCR检测技术的基础上，添加 一条标记了两个荧光基团的核苷酸探针，荧光报告基团标记在探针的5’端，荧 光淬灭基团标记在探针的3’端，两者构成能量转移结构，即荧光报告基团所发 射的荧光可被荧光淬灭基团吸收，当二者距离变远时，抑制作用减弱，报告基 团荧光信号增强。在扩增反应过程中，探针同模板上目的扩增片段杂交，由于 Taq酶具有5’端到3’端的外切酶活性，在扩增延伸阶段将探针切断，荧光淬灭 基团的抑制作用消失，报告基团荧光信号增强，从而进行口蹄疫病毒通用型的 检测。

用于口蹄疫病毒实时荧光RT-PCR检测的引物为：

上游引物UNFMDVpf1127：5’-TGGGTTTTACAAACCTGTGATGG-3’；

下游引物UNFMDVpr1221：5’-CCACGGAGATCAACTTCTCCTG-3’；

上游引物UNFMDVpr1221’：5’-CAGGAGAAGTTGATCTCCGTGG-3’；

下游引物UNFMDVpf1127’：5’-CCATCACAGGTTTGTAAAACCCA-3’；

上游引物Hfpf1117：其序列为上游引物UNFMDVpf1127向5’端方向延伸 10个碱基得到的碱基序列；

下游引物Hfpr1231：其序列为下游引物UNFMDVpr1221向3’端方向延 伸10个碱基得到的碱基序列；

下游引物Hfpr1211：其序列为下游引物UNFMDVpr1221向5’端方向延 伸10个碱基得到的碱基序列；

上游引物Hfpf1117’：其序列为上游引物UNFMDVpr1221’向5’端方向延 伸10个碱基得到的碱基序列；

下游引物Hfpr1231’：其序列为下游引物UNFMDVpf1127’向3’端方向延 伸10个碱基得到的碱基序列；

下游引物Hfpr1211’：其序列为下游引物UNFMDVpf1127’向5’端方向延 伸10个碱基得到的碱基序列；

采用上述引物做实时荧光RT-PCR检测时，引物的配对方案为：上游引物 UNFMDVpf1127和下游引物UNFMDVpr1221配对使用；上游引物 UNFMDVpr1221’和下游引物UNFMDVpf1127’配对使用；上游引物Hfpf1117 和下游引物Hfpr1231配对使用；上游引物Hfpf1117和下游引物Hfpr1211配对 使用；上游引物Hfpf1117’和下游引物Hfpr1231’配对使用；上游引物Hfpf1117’ 和下游引物Hfpr1211’配对使用。

用于口蹄疫病毒实时荧光RT-PCR检测的荧光探针序列为：

UNFMDVpv1181：5’-CTCTCCTTTGCACGCCGTGGG-3’；

UNFMDVpv1181’：5’-CCCACGGCGTGCAAAGGAGAG-3’；

UNFMDVpv1182：其序列为UNFMDVpv1181向5’端方向延伸10个碱基 得到的碱基序列；

UNFMDVpv1182’：其序列为UNFMDVpv1181向3’端方向延伸10个碱 基得到的碱基序列；

UNFMDVpv1183：其序列为UNFMDVpv1181’向5’端方向延伸10个碱基 得到的碱基序列；

UNFMDVpv1183’：其序列为UNFMDVpv1181’向3’端方向延伸10个碱 基得到的碱基序列；

上述荧光探针分别用Joe、Rox、Ned、Hex、Tet、Fam或Vic荧光素标记 探针序列的5’端，荧光淬灭基团标记探针序列的3’端。

一种口蹄疫病毒实时荧光RT-PCR检测的方法，按照如下步骤进行：

(1)选择权利要求1任一配对引物和权利要求2任一荧光探针；

(2)提取各种来源样品中口蹄疫病毒的基因组RNA；

(3)确定最佳引物浓度、镁离子浓度、反转录酶用量、Taq DNA聚合 酶用量和dNTPs浓度；

(4)选择仪器的检测通道；

(5)上机检测，若得到口蹄疫病毒特异性的荧光曲线，则证明待检样品 中含有口蹄疫病毒。

口蹄疫病毒的基因组RNA的提取方法为QIAamp Viral RNA Mini kit或 Trizol核酸抽提试剂。

本发明的有益效果：充分运用PCR技术的高效扩增性、核酸杂交的良好特 异性和荧光检测技术的快速敏感性，检测操作即可完成高致病性口蹄疫病毒通 用型的检测，可以确定血清型，具有结果可靠和准确灵敏、操作简单、省时省 力、降低检测成本、提高检测效率等优点。

附图说明

图1为口蹄疫病毒通用型实时荧光RT-PCR检测曲线图。

图2为口蹄疫病毒通用型实时荧光RT-PCR方法的特异性试验结果曲线。

图3为口蹄疫病毒通用型实时荧光RT-PCR方法的敏感性试验结果曲线。

具体实施方式

下面结合附图和具体实施例对本发明做进一步说明。

实施例1口蹄疫病毒实时荧光RT-PCR反应体系的优化

(1)引物浓度的优化  在反应体系中，将引物浓度分别从0.1μmol/L至 1.6μmol/L作倍比连续稀释，互相组合后进行检测，通过试验结果的分析比较， 确定的最佳引物终浓度见表1：

表1口蹄疫病毒通用型引物的最佳浓度

(2)镁离子浓度的优化  在反应体系中其它条件相同的条件下，将MgCl₂的浓度从1mmol/L至10mmol/L以1mmol/L递增，经过多次重复实验选定5 mmol/L为反应体系中最佳的镁离子浓度。

(3)反转录酶(AMV RnaseXL)用量的优化经过使用不同浓度AMV  RNaseXL的试验结果比较，选定5U作为反应体系中AMV RnaseXL的最佳用 量。

(4)Taq DNA聚合酶(Taq酶)用量的优化通过比较Taq酶用量(以单位Unit 计)的优化实验结果，选定5U作为试剂盒反应体系中Taq酶的最佳用量。

(5)dNTPs浓度的优化通过使用不同浓度的dNTPs进行检测，综合评估 后选1mmol/L作为试剂盒反应体系中dNTPs的最佳使用量。

利用上述引物和探针进行反应体系的建立，最后确定采用的口蹄疫病毒O、 H7和H9亚型三重实时荧光RT-PCR反应体系为50μL体系，所需各组分及相 应浓度见表2。

表2口蹄疫病毒实时荧光RT-PCR反应中的各组分情况

  组分   用量/终浓度   10×Buffer   1×   25mmol/L MgCl2   5mmol/L   dNTP Mixture   1mmol/L   RNase Inhibitor   40Unit   引物   0.4μmol/L each   探针   0.2μmol/L   模板   5μL   AMV RNaseXL   5Unit   AMV Taq   5Unit

注：1.使用的仪器不同，应将反应参数作适当调整。

2.根据检测样本来源不同，应适当调整模板加量。

仪器检测通道的选择：

在进行口蹄疫病毒实时荧光RT-PCR反应时，应对所用仪器中反应管荧光 信号的收集进行设置，选择的荧光检测通道与探针所标记的荧光报告基团一致。

实施例2口蹄疫病毒实时荧光RT-PCR反应检测过程

(1)待测模板的制备

方法一：利用QIAamp Viral RNA Mini kit提取各种来源样品中口蹄疫病毒 的基因组RNA，具体操作步骤如下：

a.取560μL含载体RNA的AVL缓冲液至1.5mL的微量离心管中；

b.加入140μL血浆、血清、尿样、细胞培养上清液或拭子的PBS清洗液， 旋涡振荡15sec；

c.于室温(15-25℃)下孵育10min；

d.瞬时离心以便将盖上的液体离心至离心管内；

e.再加入560μL无水乙醇，旋涡振荡15sec，瞬时离心，将盖上的液体离 心至离心管内；

f.小心吸取630μL上述液体至QIAamp离心柱内(置于2mL的收集管内)， 不要弄湿管口边缘，8000rpm离心1min。弃去含有液体的收集管，将QIAamp 离心柱放置于另一2mL的收集管中；

g.小心打开QIAamp离心柱盖，重复步骤f；

h.小心打开QIAamp离心柱盖，加入500μL的AW1缓冲液，8000rpm离 心1min。将QIAamp离心柱放置于另一个干净的2ML的收集管上，弃掉含 有液体的收集管；

i.小心打开QIAamp离心柱盖，加入500μL的AW2缓冲液，14000rpm 离心3min。将QIAamp离心柱放置于另一个干净的2ML的收集管上，弃掉含 有液体的收集管，再次14000rpm离心1min；

j.将QIAamp离心柱放置于一个干净的1.5mL的离心管中，小心打开柱 盖，加入60μL AVE洗脱缓冲液，室温孵育1min后，8000rpm离心1min即获 得病毒RNA，-20℃储存备用。

方法二用Trizol核酸抽提试剂的提取方法

a.将100μL口蹄疫病毒培养上清液加入1.5mL的离心管中，再向其中加入 300μL的TrizoL组织抽提液，于振荡器上充分振荡。然后13000rpm离心15min， 将上清移至1.5mL的离心管中；

b.向上清液中加400μL的预冷异丙醇，在振荡器上充分振荡后；

c.13000rpm离心10min以便获得RNA沉淀；

d.小心倒掉上清，加入600μL75％乙醇，用手上下颠倒数次洗涤。(注意： 不能剧烈振荡，防止RNA的断裂和RNA沉淀溶解后难以重新沉淀)；

e.13000rpm离心10min，缓慢吸弃上清，室温干燥约25min，待乙醇完全挥 发后加25-40μL无RNA酶的水溶解(充分弹动混匀，或用枪反复吹打)，-20℃ 储存备用。

(2)口蹄疫病毒通用型实时荧光RT-PCR反应的扩增条件

根据表2加样，将加好样的PCR管放在荧光PCR仪中，设置相应荧光收 集条件后进行扩增，反应程序如下：

50℃30min进行RNA的反转录，95℃3min灭活反转录酶；

95℃15sec变性，55℃30sec退火，72℃1min延伸，如此重复5个循环进 行预扩增；

95℃10sec变性，60℃40sec退火、延伸，如此重复40个循环进行目的片 段的扩增检测，试验结果可以实时监测。

(3)口蹄疫病毒通用型实时荧光RT-PCR的检测结果

在50μL反应体系中，利用针对口蹄疫病毒的特异性引物和探针进行实时 荧光RT-PCR，检测只含有口蹄疫病毒基因组RNA的阳性样品，结果可以得到 特异性的荧光曲线(图1)。

以上试验结果表明，本发明涉及的引物和探针特异且工作性能良好，并建 立了用于同时检测口蹄疫病毒的实时荧光RT-PCR检测方法。

实施例3口蹄疫病毒实时荧光RT-PCR方法的特异性试验

在50μL反应体系中，同时加入口蹄疫病毒与其它动物疫病病毒的基因组 RNA作为模板，而只加入针对口蹄疫病毒的引物、探针，按照实施例2所述的 方法进行实时荧光RT-PCR检测，结果只得到口蹄疫通用型的特异性荧光曲线， 表明该方法只对有口蹄疫通用型有特异性扩增，对其它动物疫病病毒的基因组 RNA无扩增，证实本发明涉及的针对口蹄疫病毒通用型的引物、探针具有很强 特异性(图2)。

以上试验结果表明，本发明涉及的口蹄疫病毒通用型实时荧光RT-PCR方 法具有很好的特异性，可以对口蹄疫病毒通用型进行检测。实施例4口蹄疫病 毒实时荧光RT-PCR方法的敏感性试验

在口蹄疫病毒实时荧光RT-PCR反应体系中，只将口蹄疫病毒的基因组 RNA作10倍连续稀释，按照实施例2所述的方法进行实时荧光RT-PCR检测， 进行针对口蹄疫病毒的实时荧光敏感性检测。

试验结果表明，本发明涉及的口蹄疫病毒通用型实时荧光RT-PCR方法具 有很高敏感性，可以检测到样品中微量存在的口蹄疫病毒(图3)。

本发明提供的用于检测口蹄疫病毒探针的使用进一步提高了检测的特异 性，而且两者之间没有显著的相互干扰现象，从而可以达到省时省力、降低检 测成本、提高检测速度和效率的目的。

本发明对口蹄疫病毒通用型的检测灵敏度分别为10^-7，可以满足各种样品 的检测要求。

利用本发明进行检测，其操作简便快速，一般可在2小时左右完成，而且 可以在检测过程中实时监测结果，不需要进行扩增产物的电泳观察，避免了扩 增产物之间的污染以及电泳观察时EB对环境的污染。