α-半乳糖基神经酰胺类似物以及它们作为免疫疗法、佐剂和抗病毒剂、抗细菌剂和抗癌剂的应用

摘要

本公开内容涉及合成的α-半乳糖基神经酰胺(α-GalCer)类似物，以及它们作为免疫疗法、佐剂和抗病毒剂、抗细菌剂和抗癌剂的用途。在一个方面，活化受试者中细胞因子应答的方法包括：给受试者施用有效量的化合物，其中所述受试者具有包括细胞群体的适应性免疫系统，所述群体包括至少一种淋巴细胞和至少一种抗原呈递细胞，且其中所述化合物由式1的结构表示，或其药学上可接受的盐；在化合物和抗原呈递细胞之间形成复合体，其中复合体的形成导致淋巴细胞上的受体的活化；以及活化淋巴细胞以产生细胞因子应答。

说明书

相关申请

本申请要求2008年7月11日提交的美国申请系列号12/218,082 的完全巴黎公约优先权，其内容通过引用整体并入本文。

技术领域

本公开内容涉及α-半乳糖基神经酰胺(α-GalCer)类似物以及它们作 为免疫疗法、佐剂和抗病毒剂、抗细菌剂和抗癌剂的应用。

背景技术

天然杀伤T细胞(NKT)代表具有独特性质的T淋巴细胞的亚群，所 述独特性质包括对由CD1d呈递的天然的或合成的糖脂的反应性和不变 的T细胞抗原受体(TCR)α链的表达。NKT与功能上分化的常规αβT 细胞的不同之处在于，它们具有两种天然杀伤细胞的性质，且T细胞在 用它们的配体刺激后可以快速地产生T_H1-型和T_H2-型应答(先天免疫)。 NKT的活化可以自相矛盾地导致免疫应答的抑制或刺激。例如，认为 T_H1细胞因子的产生会促进具有抗肿瘤、抗病毒/抗细菌和佐剂活性的细 胞免疫，而认为T_H2细胞因子产生会抑制自身免疫病和促进抗体产生。 因为NKT在免疫系统中起调节作用，它们是免疫疗法的有吸引力的靶 标。

发明内容

在一个示例性的实施方案中，通过使用粒细胞-巨噬细胞集落刺激因 子(GM-CSF)，可以刺激树突细胞(DC)发育，或在另一个示例性的实 施方案中，通过使用白介素(IL)-3，其在另一个示例性的实施方案中可 以增强树突细胞存活。

在一个示例性的实施方案中，在本公开内容的方法中使用的树突细 胞可以表达髓细胞样标记，例如，举例来说CD11c，或在另一个示例性 的实施方案中，IL-3受体-α(IL-3Rα)链(CD123)。在另一个示例性的实 施方案中，所述树突细胞可以产生I型干扰素(IFN)。在一个示例性的实 施方案中，在本公开内容的方法中使用的树突细胞表达共刺激分子。在 另一个示例性的实施方案中，在本公开内容的方法中使用的树突细胞可 以表达额外的粘附分子，它们在一个实施方案中可以用作额外的共刺激 分子，或在另一个实施方案中，用于在体内将树突细胞靶向特定部位(当 通过本公开内容的方法递送时，如在下文中进一步描述的)。

在一个示例性的实施方案中，在本公开内容的方法中使用的树突细 胞可以表达：CD83，即增加自身抗原(诸如DEC-205/CD205)的摄取 的胞吞受体，在一个实施方案中，或DC-LAMP(CD208)细胞表面标记， 或在另一个实施方案中，不同水平的呈递抗原的MHC I和II类产物， 或在另一个实施方案中，辅助(粘附和共刺激)分子，包括CD40、CD54、 CD58或CD86，或它们的任意组合。在另一个实施方案中，所述树突细 胞可以表达不同水平的CD115、CD14、CD68或CD32。

在一个示例性的实施方案中，将成熟的树突细胞用于本公开内容的 方法中。在一个实施方案中，术语“成熟的树突细胞”是指具有减少的 CD115、CD14、CD68或CD32表达的树突细胞群体，或在另一个实施 方案中，是指具有增强的CD86表达的细胞群体，或它们的组合。在另 一个实施方案中，成熟的树突细胞表现出p55、CD83、CD40或CD86 中的一种或多种或它们的组合的增加的表达。在另一个实施方案中，在 本公开内容的方法中使用的树突细胞会在它们的表面上表达DEC-205 受体。在另一个实施方案中，树突细胞的成熟可以如下实现：通过例如， CD40连接，CpG寡脱氧核糖核苷酸添加，IL-1、TNFα或TOLL样受体 配体的连接，细菌脂聚糖或多糖添加，或诸如TRAF-6或NF-κB等细胞 内途径的活化。

在一个示例性的实施方案中，诱导树突细胞成熟可以与预先选择的 抗原的胞吞受体递送相组合。在一个实施方案中，抗原的胞吞受体递送 可以是通过使用DEC-205受体来进行。

在一个示例性的实施方案中，可以例如通过检测下述的一项或多 项，证实树突细胞的成熟状态：1)p55、CD83、CD40或CD86抗原中 的一种或多种的表达的增加；2)CD115、CD14、CD32或CD68抗原的 减少；或3)通过本领域众所周知的方法，例如，免疫组织化学、FACS 分析等，在去除促进PBMC成熟为未成熟的树突细胞的细胞因子后，特 征在于增加的粘附和遮蔽物(veil)的损失的巨噬细胞表型回复。

在一个实施方案中，NKT增殖响应于呈递抗原而变化。在一个实施 方案中，将本公开内容的α-GalCer类似物提供在培养物中，同时使树突 细胞接触NKT。在另一个实施方案中，使已经加工抗原的树突细胞接触 NKT。

在一个示例性的实施方案中，术语“接触靶细胞”在本文中是指将细 胞直接和间接暴露于指示的物质。在一个实施方案中，NKT与本公开内 容的α-GalCer类似物、细胞因子、生长因子、树突细胞或它们的组合的 接触是直接的或间接的。在一个实施方案中，接触细胞可以包括通过本 领域众所周知的任意方式诸如显微注射来直接注射细胞。在另一个实施 方案中，也预见到，间接地供给细胞，诸如通过在围绕细胞的培养基中 提供，或通过本领域众所周知和下面描述的任意途径施用给受试者。

用抗原激发树突细胞的方法是本领域技术人员众所周知的，且可以 如例如Hsu等人，Nature Med.2：52-58(1996)或Steinman等人国际申请 PCT/US93/03141所述来实现。

在一个实施方案中，将α-GalCer类似物施用给受试者，且在另一个 实施方案中，使其靶向树突细胞，其中在体内发生摄取(对于下文所述 的方法)。

在一个实施方案中，α-GalCer类似物摄取和加工可以发生在24小 时内，或在另一个实施方案中，可能需要更长的时间段，例如，举例来 说，长达且包括4天，或在另一个实施方案中，可能需要更短的时间段， 例如，举例来说，约1-2小时的时间段。

在另一个实施方案中，在本公开内容的方法中由树突细胞增殖的 NKT相对于所述树突细胞是自体的、同基因的或异基因的。

在一个实施方案中，NKT可以用于以疾病特异性的方式调节免疫应 答。应当理解，任意免疫应答，其中希望增强细胞因子产生或引起特定 的细胞因子分布(profile)，包括干扰素-γ、白介素-2和/或白介素-4， 因而可以使用本公开内容的NK T细胞，并代表本公开内容的一个实施 方案。

在另一个实施方案中，本公开内容的方法可以另外包括下述步骤： 用额外的树突细胞和本公开内容的α-GalCer类似物培养事先分离的 NKT一段时间，导致进一步的NKT增殖、细胞因子产生或它们的组合。

在另一个实施方案中，本公开内容提供了在受试者中延迟发作、减 小发病率或抑制疾病的方法，所述方法包括下述步骤：在培养物中使 NKT接触树突细胞和本公开内容的α-GalCer类似物一段时间，导致NKT 增殖、细胞因子产生或它们的组合，并将这样得到的NKT施用给所述 受试者，其中所述NKT在受试者中延迟发作、减小发病率或抑制疾病， 由此在受试者中延迟发作、减小发病率或抑制疾病。

在一个示例性的实施方案中，在本公开内容中施用给受试者的细胞 可以提供在组合物中。在一个实施方案中，可以肠胃外地或静脉内地施 用这些组合物。在一个实施方案中，用于施用的组合物可以是无菌溶液， 或在其它实施方案中，是水性的或非水性的悬浮液或乳剂。在一个实施 方案中，所述组合物可以包含丙二醇、聚乙二醇、可注射的有机酯(例 如油酸乙酯)或环糊精。在另一个实施方案中，所述组合物也可以包含 润湿剂、乳化剂和/或分散剂。在另一个实施方案中，所述组合物也可以 包含无菌水或任何其它无菌的可注射介质。在另一个实施方案中，对于 本文所述的某些方法(其中希望刺激免疫应答，如下文进一步描述的)， 所述组合物可以包含本领域技术人员众所周知的佐剂(例如，维生素C、 抗氧化剂等)。

在一个示例性的实施方案中，本公开内容提供了由式1的结构表示 的化合物：

在一个示例性的实施方案中，本公开内容提供了由式2的结构表示 的化合物：

在一个示例性的实施方案中，本公开内容提供了由式3的结构表示 的化合物：

在一个实施方案中，本公开内容的α-GalCer类似物、细胞、疫苗或 组合物可以通过注射施用给受试者。在一个实施方案中，注射可以是通 过本领域已知的任意方式，且可以包括，例如，淋巴内的或SubQ注射。

在一个实施方案中，本公开内容的α-GalCer类似物以稳态在体内递 送给树突细胞，在另一个实施方案中，导致改善疾病的NKT的增殖。 在一个实施方案中，稳态类似物递送可以如Bonifaz等人(2002)Journal of Experimental Medicine 196：1627-1638和Manavalan等人(2003) Transpl Immunol.11：245-58所述来实现。

在另一个示例性的实施方案中，选择树突细胞体内功能的类型以激 发NKT。

在另一个示例性的实施方案中，本公开内容提供了调节免疫应答的 方法，所述免疫应答是不适当的或不希望的应答。在一个实施方案中， 所述免疫应答由对宿主有害的细胞因子分布作标记。

在一个示例性的实施方案中，可以将本公开内容的NKT施用给受 体，同时治疗特定疾病，例如，举例来说，同时进行标准的抗癌疗法， 以用作给定癌症的辅助治疗。在另一个实施方案中，可以在施用其它治 疗之前，施用本公开内容的NKT。

在另一个示例性的实施方案中，本公开内容提供了调节免疫应答的 方法，所述免疫应答涉及病原体的感染，且所述免疫应答对于受试者不 是保护性的。

在另一个示例性的实施方案中，所述免疫应答导致对宿主无益的细 胞因子分布。在一个实施方案中，所述细胞因子分布加重疾病。在一个 实施方案中，当T_H1应答对宿主有益时，启动T_H2应答，例如举例来说， 在瘤型麻风中。在另一个实施方案中，启动T_H1应答，并在受试者中持 续，例如举例来说，对卵抗原的应答是血吸虫病。

在另一个示例性的实施方案中，本公开内容提供了在受试者中活化 细胞因子应答的方法，其中施用有效量的化合物或盐或混合物，其中所 述受试者具有包含细胞群体的适应性免疫系统，所述群体包括至少一种 淋巴细胞和至少一种抗原呈递细胞，且其中所述化合物由式1的结构表 示：

或其药学上可接受的盐；

在化合物和抗原呈递细胞之间形成复合体，其中复合体的形成导致 淋巴细胞上的受体的活化；和

活化淋巴细胞，以产生细胞因子应答。

在所述方法的某些方面，至少一种淋巴细胞是T淋巴细胞，且在某 些情况下，所述T淋巴细胞是天然杀伤T细胞。在某些情况下，所述天 然杀伤T细胞是不变的天然杀伤T细胞。

在某些方面，所述至少一种抗原呈递细胞是树突细胞。在某些情况 下，所述树突细胞是未成熟的或成熟的树突细胞。

在所述方法的某些方面，施用化合物是通过皮下施用、静脉内施用、 鼻内施用或肌肉内施用来实现。

在所述方法的某些方面，所述化合物与抗原呈递细胞上的CD1分 子形成复合体。在某些情况下，所述CD1分子是CD1d分子。在某些情 况下，T淋巴细胞上的受体是T细胞受体。在某些情况下，刺激至少一 种其它淋巴细胞以产生细胞因子应答，在某些情况下，所述至少一种其 它淋巴细胞是T辅助细胞。

在所述方法的某些方面，所述细胞因子应答是产生T_H1细胞因子的 T_H1-型细胞因子应答，所述T_H1细胞因子也可以选自：IFN-γ、IL-1β、IL-2、 IL-3、IL-8、IL-12、IL-15、TNF-α、GM-CSF、RANTES、MIP-1α和MCP-1。

在权利要求1的方法的某些方面，其中所述细胞因子应答是产生 T_H2细胞因子的T_H2-型细胞因子应答，所述T_H2细胞因子也可以选自： IL-4、IL-6、IL-8、IL-10、IL-13、RANTES、MIP-1α和MCP-1

在某些示例性的实施方案中，本公开内容提供了疫苗，其包含有效 量的由式1的结构表示的化合物：

，或其药学上可接受的盐；和疫苗试剂。

在某些情况下，所述疫苗试剂选自：杀死的微生物、活的减毒病毒 微生物、类毒素和灭活的或减毒的微生物的片段。在某些情况下，所述 微生物是细菌或真菌。在某些情况下，所述类毒素是破伤风或白喉。在 某些情况下，所述疫苗试剂能在施用所述疫苗的受试者中引起免疫应 答。在某些情况下，所述化合物起免疫佐剂的作用，且能通过刺激免疫 系统来修饰或增加由疫苗试剂引起的免疫应答，这导致受试者对疫苗更 剧烈的应答(与没有化合物相比)。

在某些示例性的实施方案中，本公开内容提供了抗肿瘤免疫疗法， 其包括施用有效量的由式1的结构表示的化合物：

，或其药学上可接受的盐。

在所述方法的某些方面，所述施用是基于至少一种癌症、增加的癌 症或癌变前预兆的风险。在所述方法的某些方面，所述化合物的施用在 至少一种肿瘤和癌症细胞中引起应答。在所述方法的某些方面，引起的 应答是肿瘤生长的减慢。在所述方法的某些方面，引起的应答是肿瘤尺 寸的减小。

在某些示例性的实施方案中，所述方法包括化合物的施用是作用于 包含细胞群体的适应性免疫系统，所述群体包括至少一种淋巴细胞，且 其中引起的应答是适应性免疫系统中的细胞群体的增殖。

在所述方法的某些方面，适应性免疫系统中的细胞群体的增殖包括 T细胞、CD8T细胞、NK细胞或NKT细胞的数目的增加。在所述方法 的某些方面，包括提供其中加入了所述化合物的癌症疫苗。在所述方法 的某些方面，癌症选自：肺癌、乳腺癌、肝细胞瘤、白血病、实体瘤和 癌。

在所述方法的某些方面，所述施用是基于由病原性微生物剂的存在 引起的传染病。在所述方法的某些方面，所述病原性微生物剂选自：病 毒、细菌、真菌、原生动物、多细胞寄生虫和异常蛋白。在所述方法的 某些方面，所述病原性微生物因子是病毒。在所述方法的某些方面，所 述病毒选自：逆转录病毒科、细小RNA病毒科、嵌杯病毒科、披膜病 毒科、黄病毒科、冠状病毒科、弹状病毒科、纤丝病毒科、副粘病毒科、 正粘病毒科、布尼亚病毒科、沙粒病毒科、呼肠孤病毒科、双RNA病 毒科、嗜肝DNA病毒科、细小DNA病毒科、乳多空病毒科、腺病毒科、 疱疹病毒科、痘病毒科和虹膜病毒科。在所述方法的某些方面，所述病 原性微生物剂是细菌。在所述方法的某些方面，所述细菌选自：幽门螺 杆菌(Helicobacter pylori)、伯氏疏螺旋体(Borellia burgdorferi)、嗜肺军团菌 (Legionella pneumophilia)、肺炎克雷伯菌(Klebsiella Pneumoniae)、分枝杆菌 属的种、金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、淋病奈瑟球菌(Neisseria gonorrhoeae)、脑膜炎奈瑟球菌(Neisseria meningitides)、单核细胞增生李斯 特菌(Listeria monocytogenes)、酿脓链球菌(Streptococcus pyogenes)、无乳链 球菌(Streptococcus agalactiae)、链球菌属的种、粪链球菌(Streptococcus faecalis)、牛链球菌(Streptococcus bovis)、肺炎链球菌(Streptococcus pneumoniae)、病原性弯曲杆菌属的种、肠球菌属的种、衣原体属的种、 流感嗜血杆菌(Haemophilus influenzae)、炭疽芽孢杆菌(Bacillus antracis)、白 喉棒状杆菌(Corynebacterium diphtheriae)、棒杆菌属的种、红斑丹毒丝菌 (Erysipelothrix rhusiopathiae)、产气荚膜梭菌(Clostridium perfringers)、破伤 风梭菌(Clostridium tetani)、产气肠杆菌(Enterobacter aerogenes)、肺炎克雷 伯菌(Klebsiella pneumoniae)、多杀巴斯德菌(Pasturella multocida)、拟杆菌属 的种、具核梭杆菌(Fusobacterium nucleatum)、念珠状链杆菌(Streptobacillus moniliformis)、苍白密螺旋体(Treponema palladium)、细弱密螺旋体 (Treponema pertenue)、钩端螺旋体属的种、衣氏放线菌(Actinomyces israelii)、 荚膜鞘氨醇单胞菌(Sphingomonas capsulata)和土拉热弗朗西丝菌 (Francisella tularensis)。

在所述方法的某些方面，其中化合物对受试者的施用导致与没有施 用化合物的受试者相比增强的细菌清除率。在所述方法的某些方面，化 合物的施用导致微生物剂的杀死。在所述方法的某些方面，化合物的施 用导致微生物剂不能生长。

附图说明

本专利或申请含有至少一幅彩色绘制的图。在请求并支付必要的费 用后，含有彩图的该专利或专利申请公开文本的复制件将由美国专利和 商标局提供。

图1(A-B)是说明天然杀伤T细胞(NKT)功能的示意图。图1A显示 了一般线路图。图1B显示了α-半乳糖基神经酰胺(α-GalCer)和本公开内 容的α-GalCer类似物如何结合CD1d并刺激快速的T_H1和T_H2细胞因子 应答。

图2显示了α-GalCer(C1)和本公开内容的不同的α-GalCer糖脂(也 称作类似物)的化学结构，所述不同的α-GalCer糖脂包括：细菌起源的 糖脂(C3、C3和C14)、磺化修饰的糖脂(C4、C5和C9)、苯基-烷基链 糖脂(C6-C8、C10-C11、C15-C16、C18-C34、7DW8-5(aka，C8-5)和 7DW8-6(aka，C8-6))和植物鞘氨醇截短的糖脂(C12、C13和C17)。

图3显示了本公开内容的C12和C13α-GalCer类似物的合成线路 图。

图4显示了用α-GalCer或指示的本公开内容的α-GalCer类似物处 理过的鼠1.2杂交瘤的IL-2细胞因子分泌水平(pg/ml)。

图5(A-C)显示了用α-GalCer或指示的本公开内容的α-GalCer类似 物处理过、并与自体未成熟的CD14⁺DC共培养的人CD161⁺/CD3⁺NKT 的(A)IFN-γ和IL-4、(B)IL-2和IL-6、和(C)IL-12和IL-10细胞因子产生 的“增加倍数”(标准化成DMSO对照)。左侧图指示T_H1-型应答，右 侧图指示T_H2-型应答。

图6(A-B)显示了(A)人CD161⁺CD3⁺NKT的纯度和(B)IFN-γ/IL-4细 胞因子产生的比值的“增加倍数”(标准化成对照(DMSO))，它们源自 图5所示的数据。

图7的表显示了用α-GalCer或指示的本公开内容的α-GalCer类似 物处理过的、来自图5和6的人NKT的上清液中超过基础细胞因子浓 度的增加倍数。

图8(A-F)显示了用α-GalCer或指示的本公开内容的α-GalCer类似 物处理过、并与自体未成熟的树突细胞共培养的幼稚人NKT的(A) IFN-γ、(B)IL-4、(C)IFN-γ/IL-4比值、(D)IL-2、(E)IL-12和(F)IL-6细 胞因子产生的“增加倍数”(标准化成对照(DMSO))。

图9显示了iNKT的总数响应于指示的本公开内容的α-GalCer类似 物的倍数变化。

图10(A-E)显示了用α-GalCer或指示的本公开内容的α-GalCer类似 物处理过的下述细胞的IFN-γ细胞因子产生：(A)与自体树突细胞共培 养的幼稚iNKT，(B)与HeLa-CD1d细胞共培养的幼稚iNKT，(C)与 HeLa-CD1d细胞共培养的α-GalCer-脉冲的iNKT，和(D)与HeLa-CD1d 细胞共培养的α-GalCer类似物C11-脉冲的iNKT(标准化成载体对照 (DMSO))。(E)显示了人幼稚iNKT、α-GalCer-脉冲的iNKT和α-GalCer 类似物C11-脉冲的iNKT中的IFN-γ细胞因子产生的不同基础水平。

图11(A-C)显示了用α-GalCer或指示的本公开内容的α-GalCer类似 物处理过的人幼稚iNKT的(A)IFN-γ细胞因子分泌水平(pg/ml)，(B) IL-4细胞因子分泌水平(pg/ml)和(C)IFN-γ/IL-4比值。

图12的表指示了用α-GalCer或指示的本公开内容的α-GalCer类似 物处理过的、来自图10的人NKT的上清液中超过基础血清浓度的增加 倍数。

图13显示了用自体未成熟的CD14⁺树突细胞培养的、并用 α-GalCer或指示的本公开内容的α-GalCer类似物脉冲的人CD56⁺细胞 (NK/NKT混合物)的增殖的代表性的流式细胞术数据。显示了NK/NKT 混合物中的CD161⁺/Vα24TCR⁺细胞的百分比。

图14显示了在来自图13的NK/NKT混合物中发现的iNKT总数 (10³)。

图15(A-B)显示了用自体未成熟的CD14⁺树突细胞培养的、并用 α-GalCer或指示的本公开内容的α-GalCer类似物脉冲的人CD56⁺细胞 (NK/NKT混合物)的增殖的代表性的流式细胞术数据。(A)显示了 NK/NKT混合物中的CD161⁺/Vα24TCR⁺细胞的百分比，(B)显示了在 NK/NKT混合物中发现的iNKT总数的增加倍数。

图16显示了用α-GalCer或指示的本公开内容的α-GalCer类似物温 育未成熟的人树突细胞后，树突细胞(DC)上的表面蛋白CD40、CD80、 CD86和CD83、以及MHC II类细胞表面受体HLA-DR的作为平均荧光 强度(MFI)的表达水平。

图17(A-B)显示了本公开内容的α-GalCer类似物C13如何促进人单 核细胞-衍生的DC的成熟。(A)显示了树突细胞中响应于C13的CD40、 CD80、CD83、CD86和HLA-DR表达的直方图。(B)显示了与C13一起 温育48小时的树突细胞的形态学。

图18显示了iNKT细胞受体信号传导途径的示意图。

图19(A-E)证实了本公开内容的α-GalCer类似物如何促进人NKT的 CD1d-依赖性的T细胞受体(TCR)活化。(A)显示了用CD1d转染的HeLa 细胞(HeLa-CD1d)中的CD1d的表达。(B)显示了磷酸-CD3ε的细胞内水 平。(C)显示了磷酸-ERK1/2的细胞内水平。(D)显示了磷酸-Syk的细胞 内水平。(E)显示了磷酸-CREB的细胞内水平。

图20(A-L)证实了本公开内容的α-GalCer类似物如何促进幼稚人 iNKT(Vα24⁺)的CD1d-依赖性的T细胞受体(TCR)活化。(A)显示了通过 流式细胞术测定分离的幼稚人Vα24⁺T细胞。(B-L)显示了iNKT上的 TCR的活化。给HeLa或HeLa-CD1d细胞负载α-GalCer或α-GalCer类 似物C16、C23、7DW8-5、7DW8-6或C26，然后加入到幼稚Vα24⁺T 细胞中。测量下述磷酸化的蛋白的细胞内水平，并表示为平均荧光强度， 并标准化成总输入蛋白的量：(B)磷酸-CD3ε(磷酸酪氨酸)、(C)磷酸 -CREB(Ser-133)、(D)磷酸-ERK1/2(Thr-185/Tyr-187)、(E)磷酸-p38 (Thr-180/Tyr-182)、(F)磷酸-IκBα(Ser32)、(G)磷酸-Lck、(H)磷酸-Lat、(I) 磷酸-STAT3(Ser727)、(J)磷酸-STAT5A/B(Tyr 694/699)、(K)磷酸-Syk (磷酸-酪氨酸)和(L)磷酸-Zap-70(磷酸-酪氨酸)。^*，p＜0.05(相对于 DMSO对照)；#，p＜0.05(相对于α-GalCer)。

图21(A-C)显示了本公开内容的α-GalCer类似物如何诱导更大的细 胞增殖，并表现出更高的结合CD1d-限制的NKT和T细胞的能力。在 静脉内(IV)注射0.1μg/小鼠的载体、α-GalCer或指示的α-GalCer类似物 后72小时，从BALB/c小鼠收获脾。测定(A)小鼠NKT的百分比或(B) T细胞。(C)显示了α-GalCer和指示的α-GalCer类似物对CD1d-限制的 NKT和T细胞的不同的结合亲和力。

图22(A-D)显示了响应于本公开内容的α-GalCer类似物的2个NKT 亚群的CD1d-依赖性的增殖和NK活化。(A-C)显示了2个NKT亚群的 CD1d-依赖性的增殖。在α-GalCer或指示的本公开内容的α-GalCer类似 物注射后72小时，从BALB/c野生型(WT)或CD1KO小鼠收获脾。通 过FACS，评估有应答的(B)WT或(C)CD1KO小鼠中的NKT和它的2 个亚型(命名为I型NKT和II型NKT)的总数。(D)CD1d依赖性的 NK活化。通过FACS，评估有应答的WT(左图)或CD 1KO(右图)小鼠 中的NK总数的增加。

图23(A-C)显示了在静脉内(IV)注射载体、α-GalCer或指示的本公开 内容的α-GalCer类似物后0、2、18、36、48、72h，不同的细胞因子的 小鼠血清水平(pg/ml)：(A)IFN-γ、(B)IL-4和(C)IFN-γ/IL-4比值，并标 准化成DMSO对照。

图24(A-C)显示了在静脉内注射载体、α-GalCer或指示的本公开内 容的α-GalCer类似物后2和18h，不同的细胞因子/趋化因子的小鼠血 清水平(pg/ml)：(A)IFN-γ、(B)IL-4和(C)IFN-γ/IL-4比值。

图25的表是静脉内注射α-GalCer或指示的本公开内容的α-GalCer 类似物的BALB/c小鼠的上清液的结果(超过基础细胞因子浓度的增加倍 数)。所有细胞因子/趋化因子在注射后2小时达到峰值，除了用*标记的 那些在18小时达到峰值。

图26(A-H)显示了响应于来自图23的载体、α-GalCer或α-GalCer 类似物的静脉内注射，(A)有核细胞的总数和脾大小，(B)先天免疫细胞 群体，包括成熟的树突细胞，(C)活化的NK，(D)活化的NKT，(E)有 活性的B细胞，(F)有活性的CD8⁺T细胞，(G)有活性的CD4⁺T细胞 和(H)CD8⁺/CD4⁺T细胞比值(都标准化成DMSO)。

图27(A-C)显示了在皮下(SubQ)注射载体、α-GalCer或指示的本公 开内容的α-GalCer类似物后0、2、18、36、48、72h，不同细胞因子的 小鼠血清水平：(A)IFN-γ、(B)IL-4和(C)IFN-γ/IL-4比值(标准化成DMSO 对照)。

图28(A-H)显示了响应于来自图27的载体、α-GalCer或α-GalCer 类似物的SubQ注射，(A)有核细胞的总数和脾大小，(B)先天免疫细胞 群体，包括成熟的树突细胞，(C)活化的NK，(D)活化的NKT，(E)有 活性的B细胞，(F)有活性的CD8⁺T细胞，(G)有活性的CD4⁺T细胞 和(H)CD8⁺/CD4⁺T细胞比值(都标准化成DMSO)。

图29(A-C)显示了在肌肉内(IM)注射载体、α-GalCer或指示的本公 开内容的α-GalCer类似物后0、2、18、36、48、72h，不同细胞因子的 小鼠血清水平：(A)IFN-γ、(B)IL-4和(C)IFN-γ/IL-4比值，并标准化成 DMSO对照)。

图30(A-H)显示了响应于来自图29的载体、α-GalCer或α-GalCer 类似物的肌肉内注射，(A)有核细胞的总数和脾大小，(B)先天免疫细胞 群体，包括成熟的树突细胞，(C)活化的NK，(D)活化的NKT，(E)有 活性的B细胞，(F)有活性的CD8⁺T细胞，(G)有活性的CD4⁺T细胞 和(H)CD8⁺/CD4⁺T细胞比值(都标准化成DMSO)。

图31(A-K)显示了载体、α-GalCer或指示的本公开内容的α-GalCer 类似物的给药途径(IV、SubQ或IM)对细胞因子动力学和脾细胞增殖/活 化的影响。(A)显示了IFN-γ的小鼠血清水平(pg/ml)。(B)显示了IL-4的 小鼠血清水平(pg/ml)。(C)显示了IFN-γ/IL-4比值(log 10)。(D)显示了 小鼠有核细胞(脾细胞)的总数。(E)显示了先天免疫细胞群体，包括脾中 成熟的树突细胞。(F)显示了脾中活化的NK群体。(G)显示了脾中活化 的NKT群体。(H)显示了脾中有活性的B细胞群体。(I)显示了脾中有活 性的CD8⁺T细胞群体。(J)显示了脾中有活性的CD4⁺T细胞群体。(K) 显示了CD8⁺/CD4⁺T细胞比值。通过标准化成载体，进行所有分析。

图32(A-H)显示了响应于α-GalCer类似物C11或载体的IV施用的 脾细胞增殖/活化的剂量响应。(A)显示了小鼠有核细胞(脾细胞)的总数。 (B)显示了先天免疫细胞群体，包括脾中成熟的树突细胞。(C)显示了脾 中活化的NK群体。(D)显示了脾中活化的NKT群体。(E)显示了脾中单 核细胞粒细胞群体。(F)显示了脾中有活性的CD4⁺T细胞群体。(G)显示 了脾中有活性的CD8⁺T细胞群体。(H)显示了脾中有活性的B细胞群体。 通过标准化成载体，进行所有分析。

图33(A-D)显示了在静脉内注射(A)载体、α-GalCer或本公开内容的 不同的α-GalCer类似物后0、12、24、36、48、72h，不同的细胞因子 的小鼠血清水平：(B)IFN-γ、(C)IL-4和(D)IFN-γ/IL-4比值，并标准化 成载体对照。

图34的表是来自图33的静脉内注射α-GalCer或指示的本公开内容 的α-GalCer类似物的BALB/c小鼠的上清液的结果(超过基础细胞因子浓 度的增加倍数)。所有细胞因子/趋化因子在注射后2小时达到峰值，除 了用*标记的那些在18小时达到峰值。

图35(A-G)显示了在给野生型BALB/c(wt)和CD1d KO BALB/c (CD1KO)小鼠静脉内注射载体、α-GalCer或指示的本公开内容的 α-GalCer类似物后2和18h，不同的细胞因子/趋化因子的血清水平 (pg/ml)。(A)IFN-γ。(B)IL-4。(C)IFN-γ/IL-4比值(log 10)。(D)IL-10。(E) IL-12p70。(F)KC。(G)MCP-1。

图36(A-I)显示了在静脉内注射载体、α-GalCer或指示的本公开内容 的α-GalCer类似物后，C57BL/6小鼠的脾细胞的增殖/活化，(G-I)显示 了在静脉内注射载体、α-GalCer或指示的本公开内容的α-GalCer类似物 后，2个NKT亚群(C57BL/6野生型(Wt)和CD1KO小鼠)的CD1d-依赖 性的活化。(A)显示了C57BL/6小鼠有核细胞(脾细胞)的总数。(B)显示 了成熟的树突细胞群体。(C)显示了活化的NK群体。(D)显示了有活性 的CD4⁺T细胞群体。(E)显示了有活性的CD8⁺T细胞群体。(F)显示了 CD8⁺/CD4⁺T细胞比值，标准化成DMSO。(G)显示了通过流式细胞术测 定野生型小鼠中的NKT细胞(左下图)，NKT的总数(左上图)，和它的 2个亚型，包括II型NKT(右上图)和I型NKT(右下图)。(H)显示了CD1 KO小鼠中的NKT总数。(I)显示了野生型小鼠中的Treg细胞总数。通 过标准化成载体，进行所有分析。

图37(A-B)显示了本公开内容的α-GalCer类似物如何延长具有肺癌 的小鼠的存活。给C57BL/6小鼠静脉内接种小鼠肺癌细胞(TC-1)，然后 用对照、α-GalCer或指示的本公开内容的α-GalCer类似物每周处理2次， 持续4周。(A)显示了来自第I组α-GalCer类似物试验的结果。(B)显示 了来自第II组α-GalCer类似物试验的结果。(C)显示了来自第III组 α-GalCer类似物试验的结果。(D)显示了来自第IV组α-GalCer类似物试 验的结果。显示了具有肺癌的小鼠的卡普兰-迈耶存活曲线(左图)和体重 变化(右图)。对照是没有接种肿瘤的小鼠。

图38(A-B)显示了肿瘤结节和大小：(A)在用α-GalCer类似物C 11 或对照处理过、并在用TC-1细胞肿瘤接种后第16天处死的小鼠的肺表 面上；(B)在用α-GalCer类似物C11或对照处理过、并在给用小鼠乳腺 癌细胞(4T-1)SubQ肿瘤接种后第16天处死的小鼠的皮下肿瘤中。

图39(A-B)显示了小鼠的卡普兰-迈耶存活曲线(左图)和肿瘤生长(右 图)，所述小鼠被皮下地接种小鼠乳腺癌细胞4T-1，并在接种后3天， 通过(A)IV注射或(B)SubQ注射，用对照、α-GalCer或指示的本公开内 容的α-GalCer类似物处理，每周2次，持续4周。

图40显示了通过IV或SubQ注射α-GalCer(C1)处理的患有乳腺癌 的小鼠的卡普兰-迈耶存活曲线。C1的SubQ递送比IV递送更有效地延 长患有乳腺癌的小鼠的存活。

图41(A-C)显示了施用剂量对本公开内容的α-GalCer类似物的治疗 性抗癌方案的优化。IV接种小鼠肺癌细胞(TC-1)、然后用不同剂量的 α-GalCer或α-GalCer类似物7DW8-5或C26处理(每周2次或每周1 次，持续4周)的C57BL/6小鼠的体重变化(右图)和卡普兰-迈耶存活曲 线(左图)。(A)α-GalCer。(B)α-GalCer类似物7DW8-5。(C)α-GalCer 类似物C26。

图42(A-C)显示了改变途径和频率对本公开内容的α-GalCer类似物 的治疗性抗癌方案的优化。(A)显示了BALB/c小鼠的肿瘤体积(mm³)(右 图)和卡普兰-迈耶存活曲线(左图)，其中给所述小鼠SubQ接种小鼠乳腺 癌细胞4T-1，然后在接种后3天，通过IV或SubQ途径，用载体、α-GalCer 或指示的本公开内容的α-GalCer类似物处理，每周2次，持续4周。(B) 显示了C57BL/6小鼠的体重变化(右图)和卡普兰-迈耶存活曲线(左图)， 其中给所述小鼠IV接种小鼠肺癌细胞TC-1，然后在接种后3天，通过 IV或SubQ途径，用载体、α-GalCer或指示的本公开内容的α-GalCer 类似物处理，每周2次，持续4周。(C)显示了给药频率对C57BL/6小 鼠的体重(右图)和卡普兰-迈耶存活曲线(左图)的影响，其中给所述小鼠 IV接种小鼠肺癌细胞TC-1，然后通过IV途径，用载体或α-GalCer类似 物C16处理，每周2次或每周1次，持续4周。

图43(A-B)显示了本公开内容的不同的α-GalCer类似物的抗癌效力 的评价。给C57BL/6小鼠IV接种小鼠肺癌细胞TC-1，或SubQ接种小 鼠黑素瘤B 16细胞，然后用载体、α-GalCer或指示的本公开内容的 α-GalCer类似物处理，每周1次持续4周。(A)显示了卡普兰-迈耶存活 曲线。(B)显示了肿瘤体积(mm³)生长曲线。

图44(A-B)显示了C57BL/6小鼠的肿瘤生长的实时评估，给所述小 鼠(A)SQ接种肺癌细胞(TC-1-GRP-萤光素酶)或(B)乳腺癌细胞 (4T-1-GFP-萤光素酶)，然后用载体、α-GalCer或指示的本公开内容的 α-GalCer类似物处理，每周1次持续4周。

图45(A-H)显示了TH1-偏移的(biased)本公开内容的α-GalCer类 似物在肺和黑素瘤肿瘤中引起更多的肿瘤浸润性淋巴细胞。(A-D)显示 了肺癌细胞(TC-1)中的肿瘤浸润性淋巴细胞。用载体、α-GalCer或 α-GalCer类似物C23、C8-5或C34以0.1μg/小鼠处理C57BL/6小鼠， 每周1次，持续3周。(A)显示了CD3⁺细胞群体。(B)显示了CD8T细 胞群体。(C)显示了NK细胞群体。(D)显示了NKT群体。通过标准化成 载体，进行所有分析。(E-H)显示了黑素瘤细胞中的肿瘤浸润性淋巴细胞。 用载体、α-GalCer或α-GalCer类似物C23、C8-5或C34以0.1μg/小鼠 处理C57BL/6小鼠，每周1次，持续3周。(E)显示了CD3⁺细胞群体。 (F)显示了CD8T细胞群体。(G)显示了NK群体。(H)显示了NKT群体。 通过标准化成载体，进行所有分析。

图46(A-B)显示了铝(alum)、α-GalCer和α-GalCer类似物C 11对 破伤风类毒素(TT)-蛋白疫苗的抗体应答的佐剂效应。(A)在第0天(第 一次疫苗接种)和第28天(4周-第二次疫苗接种)，使用或不使用常规的 佐剂铝、α-GalCer或α-GalCer类似物C11，给小鼠接种TT疫苗。每周 收获血清，用于测定抗-TT-特异性的抗体。(B)显示了第二次疫苗接种后 20周，常规的佐剂铝、α-GalCer和α-GalCer类似物C11对延迟的抗原 增强的作用。

图47显示了在第三次免疫后2周，常规的佐剂铝、α-GalCer和本 公开内容的不同的α-GalCer类似物对含有H1N1病毒株的M2蛋白的胞 外结构域(M2e)的肽的佐剂效应。在第0、3和6周，用或不用α-GalCer 和不同的α-GalCer类似物，用5或45μgM2e肽接种BALB/c小鼠。

图48(A-C)显示了α-GalCer(C1)对用pHA免疫的小鼠的佐剂效应， 所述pHA是含有禽流感病毒的全长H5的共有序列的DNA质粒。(A)在 第0周和第3周，用或不用C1，用5和45μg之间的pHA免疫小鼠。 (B)用或不用C1，用低剂量的pHA疫苗免疫小鼠。(C)显示了用或不用 C1，H5DNA疫苗后2周，对20LD₅₀的越南重配流感株NIBRG-14的 病毒攻击的保护。

图49(A-C)显示了用或不用本公开内容的C1或指示的α-GalCer类 似物，用pHA免疫小鼠后，抗-HA-特异性的IgG抗体的诱导。(A)显示 了在用0.2μgpHA免疫后，小鼠中的抗-HA特异性的IgG抗体(AY3) 的效价。(B)显示了在用0.2μgpHA免疫后，小鼠中的抗-HA特异性的 IgG抗体(AY4)的效价。(C)显示了病毒攻击后的小鼠存活百分比。

图50(A-B)显示了用或不用本公开内容的C1或指示的α-GalCer类 似物，用pHA免疫小鼠后，抗-HA-特异性的IgG抗体的诱导。(A)显示 了在用0.5μgpHA和指示的本公开内容的α-GalCer类似物免疫后，抗 -HA特异性的IgG抗体(AY4)的效价。(B)显示了病毒攻击后的存活百 分比。

图51(A-B)显示了用(A)0.1μgpHA或(B)0.2μgpHA和指示的本公 开内容的α-GalCer类似物免疫后，抗-HA特异性的IgG抗体(AY5)的 小鼠效价。

图52(A-B)显示了用(A)0.1μg pHA或(B)0.2μg pHA和指示的本公 开内容的α-GalCer类似物(0.1μg或1μg)免疫后，抗-HA特异性的IgG 抗体(AY6)的小鼠效价。

图53(A-D)显示了α-GalCer或指示的本公开内容的α-GalCer类似物 对抗-HA-特异性的IgG抗体的诱导。通过电转移，给BALB/c小鼠在肌 肉内接种α-GalCer或指示的α-GalCer类似物和pHAc，并在4周后，用 相同的制剂强化一次。在第二次疫苗接种后2周，收集血样，并通过 ELISA测试抗-HAc-特异性的IgG抗体效价。(A)显示了抗-HA特异性的 IgG抗体(AY3)的效价。(B)显示了抗-HA特异性的IgG抗体(AY4)的 效价。(C)抗-HA特异性的IgG抗体(AY5)的效价。(D)显示了抗-HA 特异性的IgG抗体(AY16)的效价。

图54(A-B)显示了(A)HA-特异性的IFN-γ产生细胞和(B)HA-特异性 的肽应答细胞。通过电转移，给BALB/c小鼠在肌肉内接种pHAc和 α-GalCer或指示的本公开内容的α-GalCer类似物，并在3周后，用相同 的制剂强化一次。用HA-特异性的肽(9-聚体)培养脾细胞，并在1天后 测定斑点。

图55显示了对病毒攻击的保护。通过电转移，给BALB/c小鼠在肌 肉内接种pHAc和α-GalCer或指示的本公开内容的α-GalCer类似物，并 在3周后，用相同的制剂强化一次。在第二次疫苗接种后2周，用200LD₅₀NIBRG-14病毒攻击小鼠，并监测小鼠存活。

图56(A-B)显示了单次剂量疫苗接种的作用。通过电转移，给 BALB/c小鼠在肌肉内接种pHAc(2μg)和α-GalCer或指示的本公开内容 的α-GalCer类似物(2μg)。(A)3周后收集血样，并测试抗-HAc-特异性 的IgG抗体效价。(B)在激发后3周，用200LD₅₀NIBRG-14病毒攻击小 鼠，并监测存活。

图57(A-B)显示了α-GalCer或指示的本公开内容的α-GalCer类似物 对碳水化合物抗原的佐剂效应。通过肌肉内注射，给BALB/c小鼠接种 α-GalCer或指示的α-GalCer类似物，并与globo H-DT混合，在2周间 隔强化2次。在第三次疫苗接种后2周，收集血样，并测试(A)抗-globo H-特异性的IgG抗体和(B)抗-globo H-特异性的IgM抗体生产。

图58(A-B)显示了当通过腹膜内(IP)途径用α-GalCer或指示的本公 开内容的α-GalCer类似物处理BALB/c小鼠时的存活率：(A)在FLU-A 病毒血清型H1N1(WSN)病毒攻击后30min开始，(B)在H1N1病毒攻 击前2周开始。

图59(A-B)显示了用H1N1(WSN)感染、并用α-GalCer或指示的本 公开内容的α-GalCer类似物的处理的BALB/c小鼠的存活累积比例：(A) 在用高剂量的H1N1(WSN)病毒进行病毒攻击之前2周开始，(B)通过 鼻内途径。

图60(A-B)显示了Madin-Darby犬肾(MDCK)细胞的体外细胞病变效 应(CPE)。用载体、10μg/ml的α-GalCer或α-GalCer类似物C13、C14 或C16之一预处理MDCK细胞4小时，随后以10TCID₅₀用FLU-A病 毒血清型H1N1(WSN)感染。(A)显示了糖脂体外处理后的存活病毒效 价(log 10)，(B)显示了在感染后48小时的MDCK细胞的病毒效价。

图61(A-B)显示了以(A)100μg/kg或(B)50μg/kg处理的α-GalCer 或指示的本公开内容的α-GalCer类似物在荚膜鞘氨醇单胞菌感染的小 鼠中的抗细菌效力。

图62(A-B)显示了α-GalCer或指示的本公开内容的α-GalCer类似物 在肺炎克雷伯菌感染的小鼠中的抗细菌效力。在注射后，C1和C14可 以显著减少(A)小鼠肺和(B)肝中的细菌负荷。

图63表明，与未处理组相比，用50μg/kg的C23和C34处理的组 的CFU数(在肺中)是显著的。

图64(A-B)显示了α-GalCer(C1)和本公开内容的不同的α-GalCer糖 脂(也称作类似物)的化学结构，所述不同的α-GalCer糖脂包括：C3、C9、 C11、C14、C16、C17、C23、7DW8-5(aka、C8-5)和C34。

图65显示了以100μg/kg处理的糖脂在荚膜鞘氨醇单胞菌感染的小 鼠中的抗细菌效力。用点表示在感染后24小时测得的每个处理组中的 小鼠的肝中的CFU值。用短水平线指示每个处理组的平均CFU值。使 用ANOVA的统计分析发现，用C1、C11、C14和C 16处理的组导致肝 中显著减少的细菌负荷。用星号“^*”(P＜0.05)、“^**”(P＜0.01)标记与 PBS对照具有显著差异的组。

图66(A-B)显示了选择的糖脂在金黄色葡萄球菌大腿感染模型中的 抗细菌效力。在发光金黄色葡萄球菌Xen29感染后48小时，通过图像 分析，评价在感染后3小时通过IP注射施用的150μg/kg的糖脂的抗细 菌效力。(A)在感染后48小时，采集不同处理的小鼠的图像。(B)将 在感染后48小时测得的每只小鼠的相对发光(RLU)值以单个符号绘制， 并用水平线显示每个处理组的平均值。^*：p＜0.05。

图67显示了针对JEV感染的宿主保护的糖脂增强。在病毒攻击前 1天，给每组的7周龄野生型C57BL/6小鼠腹膜内(IP)注射1μg化合物 C1、7DW8-5、C23、C34或溶剂。给小鼠IP感染5x10⁵PFU的JEV(RP-9 株)，并同时在大脑内注射30μl PBS。病毒感染后1天，用1μg C1、 7DW8-5、C23、C34或溶剂腹膜内加强小鼠。每天监测小鼠，持续25 天，显示了存活百分比。每个实验组包括14只小鼠。使用具有时序检 验的Prism软件统计分析，进行存活曲线对比，并用“^*”指示与溶剂对照 相比P＜0.05。

图68(A-C)显示了为了触发针对JEV感染的保护，糖脂对宿主先天 和适应性免疫组分的依赖性。使用双剂量方案，给缺少Stat-1(A)、免疫 球蛋白μ-链(B)或CD8α-链(C)的7周龄免疫缺陷的小鼠施用在图67中 所述的C34、7DW8-5或溶剂。用0.1PFU的JEV(RP-9株)腹膜内攻击 Stat-1敲除的小鼠。如图67所述，攻击Igμ-链敲除的和CD8α-链敲除的 小鼠。每天监测小鼠，持续25天。显示存活百分比，并在每个图的图 例中显示每个实验组的小鼠的数目。

图69(A-B)显示了双剂量方案的结果，在JEV感染之前1天和之后 1天，产生最好的保护作用。通过图67所述的双剂量方案(第(-1)天和第 (+1)天)，或仅1次在病毒感染之前1天(第(-1)天)、同一天(第(0)天)、或 之后1天(第(+1)天)，将糖脂C34(A)或7DW8-5(B)施用给7周龄野生 型C57BL/6小鼠。如图67所述，攻击和监测小鼠。显示存活百分比， 并在每个图的图例中显示每个实验组的小鼠的数目。

图70(A-B)显示了接受不同次数和剂量的C34的流感感染的小鼠的 存活曲线。通过鼻内途径，用10LD₅₀流感病毒感染Blab/C小鼠。将小 鼠分成4组，在相对于流感感染的第-1天和第+1天，接受2次IP注射。 在(A)中描述了研究方案，包括IP注射的物质(1μg/小鼠C34或PBS载 体)和不同处理组的注射次数。(B)显示了不同处理组的存活曲线。

图71显示了C34施用时间对鼠大腿伤口感染模型的感染清除率的 影响。将在左大腿处被发光金黄色葡萄球菌感染的小鼠分成载体对照组 和2个在感染后0和6小时接受C34的组。在感染后48小时，给小鼠 拍照片。类似于图66，显示发光细菌感染的图像和相对发光单位。“^**” 表示p＜0.01的显著性。

图72的表显示了选择的糖脂用于抑制荚膜鞘氨醇单胞菌感染的效 力。

图73(A-B)显示了2个剂量的pCHA5+/-糖脂疫苗的肌肉内注射的针 对禽流感病毒感染的免疫保护。收集血清，并通过ELISA测试HA-特异 性的抗体效价(A)，并用200LD₅₀的NIBRG-14病毒攻击小鼠，并监测存 活(B)。

图74(A-C)显示了用和不用糖脂作为佐剂，在单次肌肉内剂量的 pCHA5后的免疫应答和小鼠存活。通过肌肉内途径用pCHA5(50μg)+/- 糖脂(2μg)或铝接种疫苗3周后，收集血清，并通过ELISA测试HA- 特异性的抗体效价(A)。同时，处死小鼠，并收获脾细胞，用于ELISPOT 试验(B)。用200LD₅₀的NIBRG-14病毒攻击另一组小鼠，并监测存活 (C)。

图75(A-C)显示了pCHA5和pCHA5-II疫苗的糖脂的佐剂效应的对 比。在第0周和第3周，通过IM/EP途径，用pCHA5或pCHA5-II(30μg)+/- 糖脂(2μg)接种疫苗加强注射2周后，收集血清，并通过ELISA测试 抗-HA抗体效价(A)，并用E319病毒攻击接种过pCHA5(B)和pCHA5-II (C)的小鼠，并监测存活。

图76(A-D)显示了pCHA5-II和C34对小鼠的HA-特异性的抗体生产 和免疫保护的剂量效应。用或不用C34(0.5、1、2、4μg)作为佐剂， 通过肌肉内途径用单次剂量的pCHA5-II(100、75、50μg)接种疫苗3周 后，收集血清，并通过ELISA测试HA-特异性的抗体效价(A)。同时， 处死小鼠，并收获脾细胞，用于ELISPOT试验(B)。图76C显示了用不 同剂量的pCHA5-II和2μgC34佐剂处理的小鼠的存活。图76D显示了 用100μg pCHA5-II和不同剂量的C34处理的小鼠的存活。

图77(A-D)显示了C34针对不同的HA-假型病毒的中和抗体产生的 佐剂效应。关于TK(A)、VN 1194(B)、ID05(C)和Anhui05(D)，显示了 在第0周和第3周用0.2μg pCHA5(溶于含有2μg C34的PBS中)IM/EP 疫苗接种后，对血清稀释液进行的非线性回归分析，产生50％的HA-假 型病毒中和(ID₅₀)。p的值是拟合对比。^*p＜0.05，且当对比C34-佐剂化 的组和仅pCHA5组时，表现出统计显著性。

图78(A-L)显示了用或不用C34作为佐剂，接受pCHA5的小鼠的血 清细胞因子表达特性(expression profiles)。关于IL-2(A)、IL-5(B)、IL-13 (C)、RANTES(D)、MIP-1α(E)、MIP-1β(F)、KC(G)、IL-1β(H)、IL-17 (I)、IL-12p40(J)、G-CSF(K)和IFN-γ(L)，显示了在第0周和第3周通 过IM/EP途径用0.2μg pCHA5(含有或不含C34)接种疫苗后的血清浓 度。

图79(A-D)表明通过单次剂量肌肉内注射，C34诱导了抗血清的中 和能力。关于Anhi05(A)、TK05(B)、ID05(C)和VN 1194(D)，显示了 用50μg pCHA5-II(溶于含有2μg C34的PBS中)疫苗接种3周后进行 的HA-假型病毒中和试验的结果。p的值是拟合对比。^*p＜0.05，且当 对比C34-佐剂化的组和仅pCHA5-II组时，表现出统计显著性。

图80显示了本公开内容的α-GalCer类似物C34的合成线路图。显 示的试剂和条件如下：(a)2-甲氧基丙烯，CSA，DMF，83％；(b)Ph₃CC1，吡 啶，77％；(c)C₁₃H₂₇⁺PPh₃^-Br，LHMDS，THF 75％；(d)H₂，Pd(OH)₂，EA， 90％(e)Tf₂O，2，6-二甲基吡啶，TAIGA，CH₂Cl₂；(f)TFA/TFAA，CH₂Cl₂，2 步63％；(g)Tf₂O，Me₂S，2-C1-吡啶，MS4A，CH₂Cl₂，60％；(h)PPh₃吡啶 /H₂O；(i)EDC，HBTU，TEA，CH₂Cl₂，2步88％；G)NaOMe，MeOH/CH₂Cl₂； (k)AcOH(aq.)；(I)H₂，Pd(OH)₂，MeOH/CHCl₃，3步40％。

具体实施方式

所有科学术语给出本领域技术人员理解的通常含义，除非在下面阐 述替代含义。在冲突的情况下，以本说明书阐述的定义为准。

本文使用的术语“脂类”是指参与细胞信号传导途径的任意脂溶性 的(亲脂的)分子。

本文使用的术语“糖脂”是指用作细胞识别的标记的碳水化合物-连 接的脂类。

本文使用的术语“α-半乳糖基神经酰胺”和“α-GalCer”是指刺激天然 杀伤T细胞来产生T辅助(T_H)1和T_H2细胞因子的糖脂。

本文使用的术语“聚糖”是指多糖或寡糖。聚糖在本文中也用于表示 糖缀合物的碳水化合物部分，所述糖缀合物诸如糖蛋白、糖脂、糖肽、 糖蛋白质组、肽聚糖、脂多糖或蛋白聚糖。聚糖通常唯一地由单糖之间 的O-糖苷键组成。例如，纤维素是由β-1，4-连接的D-葡萄糖组成的聚糖 (或更具体地，葡聚糖)，甲壳质是由β-1，4-连接的N-乙酰基-D-氨基葡萄 糖组成的聚糖。聚糖可以是单糖残基的同型或异型聚合物，且可以是直 链的或分支的。可以发现聚糖连接在蛋白上，如在糖蛋白和蛋白聚糖中。 通常发现它们在细胞的外表面上。O-和N-连接的聚糖在真核生物中非常 常见，但是也可以见于原核生物中(尽管不常见)。发现N-连接的聚糖 连接到sequon中的天冬酰胺的R-基氮(N)上。所述sequon是Asn-X-Ser 或Asn-X-Thr序列，其中X是除了脯氨酸以外的任意氨基酸。

本文使用的术语“糖蛋白”是指用聚糖共价修饰的蛋白。存在4类糖 蛋白：1)N-连接的糖蛋白，2)O-连接的糖蛋白(粘蛋白)，3)葡糖胺聚糖 (GAG，它们也称作蛋白聚糖)，4)GPI-锚定的。大多数糖蛋白具有结构微 不均一性(micro-heterogeneity)(多个不同的聚糖结构连接在相同的糖 基化位点内)和结构宏不均一性(macro-heterogeneity)(多个聚糖连接 位点和类型)。

本文使用的术语“类似物”是指这样的化合物(例如，药物)，其结 构与其它化合物的结构有关，但是其化学和生物性质可能非常不同。

本文使用的术语“抗原”被定义为能引起免疫应答的任意物质。

本文使用的术语“病原体”是对它的宿主造成疾病或病症的生物因 子。机体含有许多针对一些普通病原体(诸如肺囊虫属)的天然防御，其 是以人免疫系统的形式。

本文使用的术语“免疫原”是指能诱导抗原的产生的抗原或物质，诸 如DNA疫苗。

本文使用的术语“免疫原性”是指免疫原、抗原或疫苗的刺激免疫应 答的能力。

本文使用的术语“免疫疗法”是指一组基于调节免疫系统来实现预 防和/或治疗目的的许多治疗策略。

本文使用的术语“CD1d”是指在不同的人抗原呈递细胞的表面上表 达的CD1(分化簇1)家族糖蛋白的成员。CD1d呈递的脂类抗原会活化 天然杀伤T细胞。CD1d具有深的抗原-结合沟，其中可以结合糖脂抗原。 在树突细胞上表达的CD1d分子可以结合和呈递糖脂。

本文使用的术语“适应性免疫系统”是指消除病原性攻击的高度专 门化的、系统的细胞和过程。适应性免疫系统的细胞是白细胞类型，称 作淋巴细胞。B细胞和T细胞是主要的淋巴细胞类型。

本文使用的术语“T细胞”和“T”是指一组称作淋巴细胞的白细胞，其 在细胞-介导的免疫中起重要作用。通过在它们的细胞表面上存在的特别 的受体(称作T细胞受体(TCR))，可以将T细胞与其它淋巴细胞类型 (诸如B细胞和NK)区分开。已经描述了几个不同的T细胞亚群，每 个亚群具有不同的功能。辅助T(T_H)细胞是适应性免疫系统的“中间人”。 在活化后，它们快速分裂，并分泌称作细胞因子的小蛋白，它们调节或 “辅助”免疫应答。根据接收的细胞因子信号，这些细胞分化成T_H1、T_H2、 T_H17或其它亚群之一，它们分泌不同的细胞因子。

本文使用的术语“抗原呈递细胞”(APC)是指这样的细胞，其展示与 在它的表面上与主要组织相容性复合体(MHC)形成复合体的外来抗原。 使用它们的TCR，T-细胞可以识别该复合体。APC分成2类：专职的或 非专职的。树突细胞(DC)属于专职类别，且能将抗原呈递给T细胞(在 CD1的背景下)。在一个示例性的实施方案中，在本公开内容的方法中 使用的树突细胞可以属于几个树突细胞亚群中的任一个，在一个实施方 案中，它们区别于淋巳样祖细胞，或在另一个实施方案中，它们区别于 髓样骨髓祖细胞。

本文使用的术语“幼稚细胞”是指未分化的免疫系统细胞，例如CD4 T-细胞，其尚未专门化成识别特定病原体。

本文使用的术语“天然杀伤细胞”和“NK”是指一类淋巴细胞，它们被 干扰素活化，以促成抗病毒和其它细胞内病原体的先天性宿主防御。

本文使用的术语“天然杀伤T细胞”(NKT)是指与常规的T和NK共 有特征/受体的T细胞亚群。许多这样的细胞识别非多形的CD1d分子， 即结合自身和外来脂类和糖脂的抗原呈递分子。NKT的TCR能识别 CD1d分子呈递的(作为分子伴侣的)糖脂抗原。NKT的主要应答是在刺 激后快速分泌细胞因子，包括IL-4、IFN-γ和IL-10，因而影响不同的免 疫应答和致病过程。NKT可以是同质群体或异质群体。在一个示例性的 实施方案中，所述群体可以是“非-不变的NKT”，其可以包含人和小鼠 骨髓和人肝T细胞群体，它们是例如，表达不同的TCR的CD1d-反应 性的非-不变的T细胞，且它们也可以生产大量IL-4和IFN-γ。最知名的 CD1d-依赖性的NKT亚群表达不变的TCR-α(TCR-α)链。它们称作I型 或不变的NKT(iNKT)。这些细胞在人(Vα24i NKT)和小鼠(Vα14i NKT) 之间是保守的，且参与许多免疫学过程。

本文使用的术语“细胞因子”是指许多小的、分泌的蛋白中的任一 种，它们通过影响免疫细胞分化过程(通常包括基因表达的变化，由此 使前体细胞变成不同的专门化的细胞类型)，调节免疫应答的强度和持 续时间。细胞因子已经被不同地命名为淋巴因子、白介素和趋化因子， 这基于它们的假定的功能、分泌的细胞或作用靶标。例如，一些常见的 白介素包括但不限于：IL-12、IL-18、IL-2、IFN-γ、TNF、IL-4、IL-10、 IL-13、IL-21和TGF-β。

本文使用的术语“趋化因子”是指在感染部位释放出的不同的小的 趋化性的细胞因子中的任一种，它们提供淋巴细胞的活动和活化的方 式。趋化因子将白细胞吸引到感染部位。趋化因子具有保守的半胱氨酸 残基，其使得它们被分成4组。具有代表性的趋化因子的组是C-C趋 化因子(RANTES、MCP-1、MIP-1α和MIP-1β)、C-X-C趋化因子(IL-8)、 C趋化因子(淋巴细胞趋化因子)和CXXXC趋化因子(Fractalkine)。

本文使用的术语“T_H2-型应答”是指产生某些类型的细胞因子、干扰 素、趋化因子的细胞因子表达模式。典型的T_H2细胞因子包括但不限于： IL-4、IL-5、IL-6和IL-10。

本文使用的术语“T_H1-型应答”是指生产某些类型的细胞因子、干扰 素、趋化因子的细胞因子表达模式。典型的T_H 1细胞因子包括但不限于： IL-2、IFN-γ、GM-CSF和TNF-β。

本文使用的术语“T_H1偏移的”是指这样的免疫原应答，其中T_H1细 胞因子和/或趋化因子的产生增加到比T_H2细胞因子和/或趋化因子的产 生更大的程度。

本文使用的术语“表位”被定义为接触抗体或T细胞受体的抗原结合 位点的抗原分子部分。

本文使用的术语“疫苗”是指含有抗原的制品，其由完整的致病生物 (杀死的或减毒的)或这些生物的组分(诸如蛋白、肽或多糖)组成，其 用于赋予针对所述生物造成的疾病的免疫性。疫苗制品可以是天然的、 合成的或通过重组DNA技术衍生的。

本文使用的术语“抗菌剂”是指杀死或抑制微生物(诸如细菌、真菌 或病毒)的生长的物质。

本文使用的术语“类毒素”是指这样的细菌毒素，其毒性已经通过化 学(福尔马林)或热处理减弱或抑制，而其它性质(通常是免疫原性)被 维持。类毒素被用于疫苗中，因为它们会诱导对原始毒素的免疫应答， 或增加对另一种抗原的应答。例如，破伤风类毒素是源自由破伤风梭菌 产生的破伤风痉挛毒素，并造成破伤风。在美国，破伤风类毒素被许多 血浆中心用于开发富含血浆的疫苗。

本文使用的术语“DNA疫苗”是指这样的DNA构建体，其被导入细 胞中，并随后翻译成特定的抗原蛋白。

本文使用的术语“质粒”是指能复制的染色体外的环状DNA，其可以 用作克隆载体。

本文使用的术语“微生物”(“microorganism”和“microbe”)是指 用显微镜可见的生物(小到人裸眼不可见)。微生物是惊人地多样的，包 括但不限于细菌和真菌。

本文使用的术语“免疫佐剂”是指与免疫原一起使用的物质，其增强 或修饰对免疫原的免疫应答。在一个示例性的实施方案中，本公开内容 的α-GalCer类似物被用作免疫佐剂，以修饰或增进疫苗的作用，这通过 刺激施用疫苗的患者的免疫系统更强烈地应答疫苗来实现。

本文使用的术语“铝佐剂”是指具有免疫佐剂活性的铝盐。该试剂会 吸附和沉淀在溶液中的蛋白抗原；得到的沉淀物会提高疫苗免疫原性， 这通过促进抗原从在接种部位形成的疫苗储存(depot)的缓慢释放来实 现。

本文使用的术语“抗肿瘤免疫疗法活性剂”是指抑制、减少和/或消除 肿瘤的本公开内容的α-GalCer类似物。

本文使用的术语“粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子”(GM-CSF)是指 这样的细胞因子，其被用作刺激白细胞、尤其是粒细胞(嗜中性粒细胞、 嗜碱性粒细胞和嗜酸性粒细胞)、巨噬细胞和骨髓中血小板前体细胞的产 生的集落刺激因子。

本文使用的术语“抗原特异性的”是指细胞群体的性质，使得特定抗 原或抗原片段的供给导致特定细胞增殖。

本文使用的术语“流式细胞术”或“FACS”是指用于通过光学和电子 检测装置检查颗粒或细胞的物理和化学性质的技术，所述颗粒或细胞悬 浮在流体流中。

除非另外指出，本文使用的α-GalCer类似物或合成的α-GalCer类 似物是指以α-半乳糖基神经酰胺为基础的基于结构合成的糖脂类似物。

在下文中肽中的氨基酸残基缩写如下：苯丙氨酸是Phe或F；亮氨 酸是Leu或L；异亮氨酸是Ile或I；蛋氨酸是Met或M；缬氨酸是VaI 或V；丝氨酸是Ser或S；脯氨酸是Pro或P；苏氨酸是Thr或T；丙氨 酸是Ala或A；酪氨酸是Tyr或Y；组氨酸是His或H；谷氨酰胺是GIn 或Q；天冬酰胺是Asn或N；赖氨酸是Lys或K；天冬氨酸是Asp或D； 谷氨酸是GIu或E；半胱氨酸是Cys或C；色氨酸是Trp或W；精氨酸 是Arg或R；且甘氨酸是GIy或G。关于氨基酸的其它描述，请参见： Proteins：Structure and Molecular Properties by Creighton，T.E.，W.H. Freeman & Co.，New York 1983。

已知哺乳动物和分支杆菌的脂类由人CD1a、CD1b、CD1c和CD1d 呈递。α-半乳糖基神经酰胺(在海洋海绵，海绵体(Agelas mauritianus) 中发现的脂类)已经成为最广泛研究的CD1d的配体。已经证实，α-GalCer 对小鼠脾细胞的体外刺激导致NKT的增殖和IFN-γ和IL-4的产生(分 别是T_H1-型和T_H2-型应答)。鼠研究已经证实，携带α-GalCer的未成 熟的树突细胞(iDC)可以快速地活化细胞，且活化的iNKT又可以诱导树 突细胞的完全成熟。

在一个方面，本公开内容提供了α-GalCer类似物的一系列新颖的脂 类部分，它们能结合CD1分子上的结合沟，形成CD1-类似物复合体。 借助于T细胞受体识别，这些CD1-类似物复合体被呈递给CD1-限制的 T细胞(NKT)，且能实现TCR活化、T_H1和T_H2细胞因子释放、和NKT 增殖。在一个示例性的实施方案中，设计本公开内容的α-GalCer类似物， 使得它与CD1分子上的结合沟具有强结合亲和力，与T_H1-偏移的免疫 原应答相关联。在另一个示例性的实施方案中，设计本公开内容的 α-GalCer类似物，使得它与CD1分子上的结合沟具有强结合亲和力，与 T_H2-偏移的免疫原应答相关联。

在本公开内容的另一个方面，所述α-GalCer类似物可以用作免疫疗 法。在一个示例性的实施方案中，所述α-GalCer类似物可以用于癌症免 疫疗法。在一个示例性的实施方案中，所述α-GalCer类似物可以用于佐 剂免疫疗法。在另一个示例性的实施方案中，所述α-GalCer类似物可以 用于抗微生物免疫疗法，这包括疫苗接种。在还另一个示例性的实施方 案中，所述α-GalCer类似物可以用于免疫抑制，用于自身免疫病的治疗。

根据另一个方面，本文公开的组合物可以与本领域技术人员在阅读 本公开内容后可识别的额外的活性剂、载体、介质、赋形剂，或助剂一 起包含在药物或营养组合物中。

药物或营养组合物优选地包含至少一种药学上可接受的载体。在这 样的药物组合物中，本文公开的组合物形成“活性化合物”，也称作“活性 剂”。本文使用的语言“药学上可接受的载体”包括适合药用的溶剂、分散 介质、包衣剂、抗细菌剂和抗真菌剂、等渗剂和吸收延迟剂等。也可以 将补充性的活性化合物掺入组合物中。将药物组合物配制成与它的预期 给药途径相容。给药途径的实例包括肠胃外的、例如静脉内的、真皮内 的、皮下的、经口的(例如，吸入)、透皮的(局部的)、透过粘膜的和直肠 的给药。用于肠胃外的、真皮内的或皮下应用的溶液或悬浮液可以包括 下述组分：无菌的稀释剂诸如注射用水、盐水溶液、不挥发性油、聚乙 二醇、甘油、丙二醇或其它合成溶剂；抗菌剂诸如苯甲醇或对羟基苯甲 酸甲酯；抗氧化剂诸如抗坏血酸或亚硫酸氢钠；螯合剂诸如乙二胺四乙 酸；缓冲剂诸如醋酸盐、柠檬酸盐或磷酸盐和张力调节剂诸如氯化钠或 葡萄糖。可以用酸或碱调节pH，诸如盐酸或氢氧化钠。肠胃外制品可 以封装在安瓿、一次性注射器或由玻璃或塑料制成的多剂量小瓶中。

本文使用的“受试者”是指人和非人灵长类动物(例如guerilla、猕 猴、狨猴)、牲畜动物(例如羊、牛、马、驴、猪)、伴侣动物(例如 狗、猫)、实验动物(例如小鼠、兔、大鼠、豚鼠、仓鼠)、捕获的野 生动物(例如狐狸、鹿)和可以从本公开内容的试剂获益的任意其它生 物。可以从本文所述的试剂获益的动物的类型没有限制。受试者(无论 它是人还是非人生物)可以称作患者、个体、动物、宿主或受体。

适合注射用的药物组合物包括无菌水性溶液(如果是水溶的话)或者 分散液和用于即时配制无菌注射溶液或分散液的无菌粉末。对于静脉内 给药而言，合适的载体包括生理盐水、抑菌水、Cremophor EL.TM. (BASF，帕瑟伯尼(Parsippany)，新泽西州)或磷酸盐缓冲盐水(PBS)。在 所有的情况中，所述组合物应当是无菌的，并且应当是具有易注射性的 流体。所述组合物在生产和储存条件下应当稳定，并且保护其免受诸如 细菌和真菌等微生物的污染作用。载体可以是溶剂或分散介质，包括， 例如水、乙醇、多元醇(例如，甘油、丙二醇和液体聚乙二醇等)，和其 合适的混合物。通过例如，使用诸如卵磷脂等包衣，通过保持所需的粒 径(在分散体的情况下)和通过使用表面活性剂，可以保持合适的流动 性。通过不同的抗细菌剂和抗真菌剂(例如，对羟基苯甲酸酯、氯代丁醇、 苯酚、抗坏血酸和硫柳汞等)，可以实现对微生物作用的预防。在许多情 况下，所述组合物中优选包含等渗剂，例如，糖，诸如甘露醇、山梨糖 醇等多元醇，或氯化钠。通过在注射组合物中包含延迟吸收的试剂(例如 单硬脂酸铝和明胶)，可以实现所述组合物的延长吸收。

可通过下述方法配制无菌注射溶液：将所需量的活性化合物掺入含 有上面列举的成分中的一种或其组合(如果需要的话)的适当的溶剂中， 而后进行过滤灭菌。一般而言，通过将活性化合物掺入包含基本分散介 质和选自上面列举的那些成分的所需其它成分的无菌载体中来制备分 散体。在用于制备无菌注射溶液的无菌粉末的情况下，制备方法包括真 空干燥和冷冻干燥，它们从事先过滤灭菌的溶液得到活性成分和任何附 加的所需成分的粉末。

口服组合物通常包括惰性稀释剂或可食用的载体。为口服治疗给药 目的，可将活性化合物与赋形剂混合，并以片剂、锭剂或胶囊(例如，明 胶胶囊)等形式使用。使用作为漱口剂的流体载体，也可制备口服组合物。 可包含药学相容的粘合剂或辅料作为所述组合物的一部分。片剂、丸剂、 胶囊和锭剂等可包含任何下述成分或具有相似性质的化合物：诸如微晶 纤维素、黄芪树胶或明胶等粘合剂；诸如淀粉或乳糖等赋形剂；诸如褐 藻酸、Primogel或玉米淀粉等崩解剂；诸如硬脂酸镁或Sterotes等润滑 剂；诸如胶体二氧化硅等助流剂；诸如蔗糖或糖精等甜味剂；或诸如薄 荷、水杨酸甲酯或柑桔香精(orange flavoring)等调味剂。

对于吸入给药而言，以气溶胶喷雾剂的形式递送所述化合物，所述 喷雾剂来自包含合适的推进剂(例如，诸如二氧化碳等气体)的加压容器 或分配器，或者喷雾器。

也可通过透粘膜或透皮方式，进行全身施用。对于透粘膜给药或透 皮给药而言，将与待渗透的阻挡层相适应的渗透剂用在制剂中。这样的 渗透剂通常是本领域已知的，且对于透粘膜给药而言，包括例如去垢剂、 胆汁盐和夫西地酸衍生物。通过使用鼻腔喷雾剂或栓剂，可以实现透粘 膜施用。对于透皮给药而言，可将活性化合物配制进本领域通常已知的 软膏剂、油膏剂、凝胶剂或乳膏剂。也可将化合物制备成栓剂形式(例如， 含有诸如可可脂和其它甘油酯等常规的栓剂基质)，或用于直肠递送的保 留灌肠剂形式。

根据实施方案，将活性化合物与防止所述化合物从体内快速消除的 载体一起制备，例如，控释制剂，包括植入物和微囊递送系统。可以使 用可生物降解的、生物相容的聚合物，例如乙烯醋酸乙烯酯、聚酸酐、 聚乙醇酸、胶原、聚原酸酯和聚乳酸。制备这样的制剂的方法是本领域 技术人员显而易见的。所述材料也可以从Alza Corporation和Nova Pharmaceuticals，Inc.商购获得。脂质体悬浮液(包括靶向含有细胞特异性 抗原的单克隆抗体的受感染的细胞的脂质体)也可以用作药学上可接受 的载体。它们可以根据本领域技术人员已知的方法制备，例如，如在美 国专利号4,522,811中所述，其通过引用并入本文。

有利地以剂量单位形式配制口服或肠胃外组合物，以便于给药和剂 量的均一性。本文使用的“剂量单位形式”是指适合作为要治疗的受试 者的单位剂量的物理上离散的单位；每个单位含有经过计算会产生希望 的治疗效果的预定量的活性化合物以及需要的药用载体。

通过在细胞培养物或实验动物中的标准药物程序，例如，用于测定 LD50(群体50％的致死剂量)和ED50(群体50％的治疗有效剂量)的标准 药物程序，可以测定这样的化合物的毒性和疗效。毒性和疗效之间的剂 量比为治疗指数，可将其表示为LD50/ED50比。表现出高治疗指数的化 合物是优选的。尽管可以使用表现出毒性副作用的化合物，应当小心地 设计将这样的化合物靶向被感染位置的位点(the site of affected location)的递送系统，以使对未感染的细胞的潜在损害最小化，并由此 减少副作用。

从细胞培养物试验和动物研究获得的数据可用于确定用于人的剂 量范围。这样的化合物的剂量优选位于毒性较小或没有毒性的、包括 ED50的循环浓度范围内。该剂量可根据所使用的剂型和所采用的施用 途径而在该范围内变化。对本公开内容的方法中所用的任何化合物而 言，最初可由细胞培养物试验估算治疗有效剂量。可在动物模型中确定 剂量，以获得包括在细胞培养物中所测得的IC50(即，达到症状的最大 抑制的一半时的测试化合物浓度)的循环血浆浓度范围。这样的信息可以 用于更准确地测定人的可用剂量。通过例如高效液相色谱法，可以测量 血浆中的水平。

如本文定义的，活性化合物的治疗有效量(即，有效剂量)可以是在 从约0.001至100g/kg体重的范围内，或技术人员无需过多实验即可明 白和理解的其它范围。技术人员将理解，某些因素会影响有效地治疗受 试者所需的剂量和时机，包括但不限于疾病或障碍的严重性、先前的治 疗、受试者的总体健康状况或年龄，以及存在的其它疾病。

根据另一个方面，本领域技术人员可以预见到部件的一个或多个试 剂盒，所述部件的试剂盒执行至少一种本文公开的方法，根据至少一种 上述方法，所述部件的试剂盒包含2种或更多种组合物，所述组合物包 含单独的或组合的有效量的本文公开的组合物。

所述试剂盒还可能包括含有活性剂的组合物、生物事件的标识符、 或技术人员在阅读本公开内容后可识别的其它化合物。术语“标识符” (“identifier”)是指这样的分子、代谢物或其它化合物、诸如抗体、 DNA或RNA寡核苷酸，其能在本领域技术人员可识别的方法中，发现 或测定生物事件的存在、出现或事实，或以其它方式检测生物事件；示 例性的标识符是抗体，示例性的方法是蛋白质印迹、亚硝酸盐测定和 RT-PCR，或在实施例中所述的其它规程。

所述试剂盒也可以包含至少一种组合物，所述组合物含有有效量的 本文公开的组合物或细胞系。根据本领域技术人员可识别的方法，使用 部件试剂盒的组合物和细胞系来执行本文公开的至少一种方法。

通过本公开内容的α-GalCer类似物进行T细胞受体识别和活化，以及得到的免疫应答

图1A的示意图显示了由CD1d呈递的糖脂抗原对不变的NKT细胞 的识别如何导致一连串事件。糖脂抗原的脂类部分插入CD1分子的疏水 结合沟，形成CD1-抗原复合体，其能接触NKT上的T-细胞受体(TCR)， 这导致包含细胞因子、趋化因子和共刺激分子的一连串事件。细胞因子 产生的多样性和程度具有广范围的效应，从增强的细胞-介导的免疫 (T_H1-型应答)到受抑制的细胞-介导的免疫(T_H2-型应答)。图1B的示意图 显示了由CD1d呈递的α-GalCer或本公开内容的α-GalCer类似物对NKT 细胞的识别如何刺激快速的T_H1和T_H2细胞因子应答。在一个示例性的 实施方案中，启动T_H1细胞因子应答。在另一个示例性的实施方案中， 启动T_H2细胞因子应答。在另一个示例性的实施方案中，启动T_H1和 T_H2细胞因子应答。

在图2中显示了α-GalCer以及本公开内容的合成的α-GalCer类似 物的化学结构。本公开内容的α-GalCer类似物包括：细菌起源的α-GalCer 类似物(第I组：C2、C3和C14)、磺化修饰的α-GalCer类似物(第II组：C4、 C5和C9)、苯基-烷基链α-GalCer类似物(第III组：C6-C8、C10-C11、 C15-C16、C18-C34、C8-5和C8-6)和植物鞘氨醇截短的α-GalCer类似物 (第IV组：C12、C13和C17)。图3显示了鞘糖脂α-GalCer类似物C12 和C13的合成实例。

在一个方面，本公开内容的合成的α-GalCer类似物能与CD1d分子 形成复合体。在另一个方面，本公开内容的合成的α-GalCer类似物能被 NKT T-细胞受体识别。在另一个方面，本公开内容的合成的α-GalCer 类似物能引起T_H1-型、T_H2-型、或T_H1-型和T_H2-型应答。在一个示例性 的实施方案中，本公开内容的α-GalCer类似物能在体外活化NKT。在 另一个示例性的实施方案中，本公开内容的α-GalCer类似物能在体内活 化NKT。

提供了刺激或增强组织、细胞和/或受试者中的细胞因子产生的方 法，所述方法包括：给受试者施用任一种本公开内容的合成的α-GalCer 类似物，其中所述受试者中的NKT在接触α-GalCer类似物后被活化， 并启动细胞因子应答。所述细胞因子可以是，例如，干扰素-γ(IFN-g) 或白介素-4(IL-4)。

在一个示例性的实施方案中，本公开内容提供了活化组织、细胞和 /或受试者中的细胞因子应答的方法，其中施用有效量的化合物或盐或混 合物，所述化合物选自C2-C8、C8-5、C8-6和C9-C34，且其中所述受 试者具有包括细胞群体的适应性免疫系统，所述群体包括至少一种淋巴 细胞和至少一种抗原呈递细胞；在化合物和抗原呈递细胞之间形成复合 体，其中复合体的形成导致淋巴细胞上的受体的活化；和活化淋巴细胞， 以产生细胞因子应答。

在一个示例性的实施方案中，在mCD1d-包被的96孔平板中培养鼠 1.2杂交瘤(CD1d-反应性的Vα14iT细胞杂交瘤)，并用100ng/ml的对照 DMSO、α-GalCer(C1)或指示的本公开内容的α-GalCer类似物脉冲处理。 在培养18小时后，测量组织培养基中的IL-2释放，如图4所示。大多 数本公开内容的α-GalCer类似物诱导比α-GalCer更大的IL-2生产。当 检测本公开内容的α-GalCer类似物在体外在人幼稚NKT(CD161⁺CD3⁺) 中引起细胞因子/趋化因子生产的能力时，发现类似的结果。用自体未成 熟的树突细胞(CD14⁺DC)培养人幼稚CD161⁺CD3⁺NKT，并用10μg/ml 的对照DMSO、α-GalCer或指示的本公开内容的α-GalCer类似物脉冲处 理。在培养18小时后，测量组织培养基中的细胞因子释放，如图5所 示。α-GalCer类似物是T_H1和T_H2细胞因子分泌的有效诱导物。图5A 显示了IFN-γ和IL-4的诱导，图5B显示了IL-2和IL-6的诱导，图5C 显示了IL-12和IL-10的诱导。来自第III和IV组的芳族化合物，特别是 C11、C16和C13，诱导比α-GalCer明显更大的IFN-γ分泌，而所有 α-GalCer类似物引起比α-GalCer稍微更少的IL-4。图6显示了人 CD161⁺CD3⁺NKT的纯度(上图)和标准化成DMSO对照的IFN-γ/IL-4 比值(下图)。当表示为IFN/IL-4比值时，C9、C12、C13、C14和所有 第III组化合物是更向T_H1-偏移的；而C1、C3、C4、C5、C8和C17是 更向T_H2-偏移的。在图7中列出了来自人CD161⁺CD3⁺NKT的细胞因 子和趋化因子的诱导。用粗体标记每种细胞因子的最高5个值。某些测 试的α-GalCer类似物显示出比α-GalCer更大的趋化因子诱导；例如， C13引起诸如MIP-1α、MCP-1和IL-8等趋化因子的惊人增加。芳族化 合物C10、C11和C16显示出更大的IL-3、粒细胞/巨噬细胞集落刺激因 子(GM-CSF)和IL-15的诱导。

图8显示了本公开内容的α-GalCer类似物在幼稚人iNKT中引起细 胞因子/趋化因子生产的能力的更多体外结果。用自体未成熟的DC培养 幼稚人iNKT，并用对照DMSO、α-GalCer或指示的α-GalCer类似物(C11 和C18-C29)脉冲处理。如图8A所示，所有测试的本公开内容的α-GalCer 类似物诱导比C1更高的INF-γ分泌水平。α-GalCer类似物诱导相当的 IL-4水平(参见图8B)。α-GalCer类似物诱导比C1更高的IFN-γ/IL4比 值，即，T_H1/T_H2偏移(参见图8C)。α-GalCer类似物C20、C24和C26 比α-GalCer类似物C11明显更有效地引起IFN-γ生产、更高的IFN-γ/IL4 比值和更高的IL-2水平(参见图8D)。α-GalCer类似物C20和C24诱导 IL-12生产，且也比测试的其它α-GalCer类似物引起更多的IL-6释放 (参见图8E和8F)。图9显示了α-GalCer类似物C11和C18-C29对人 iNKT的增加。α-GalCer类似物C20、C22-C24和C26-C27比C1和C11 诱导明显更大的CD1d-限制的人iNKT细胞的增加。

图10显示了幼稚和不同的α-GalCer类似物-脉冲的人NKT之间的 不同的IFN-γ分泌水平。图10A显示了来自用未成熟的CD14⁺DC培养、 并用对照DMSO、α-GalCer或指示的本公开内容的α-GalCer类似物脉冲 处理的人幼稚iNKT(Vα24⁺)的IFN-γ分泌。图10B-D显示了3种不同的 iNKT来源中响应于α-GalCer类似物的IFN-γ分泌：(B)人幼稚iNKT，(C) α-GalCer脉冲的iNKT和(D)C11脉冲的iNKT。用HeLa-CD1d细胞培养 iNKT，并用对照DMSO、α-GalCer或指示的α-GalCer类似物脉冲处理 18小时。图10E显示了人幼稚iNKT、α-GalCer脉冲的iNKT和C11脉 冲的iNKT中IFN-γ的不同的基础水平。

图11显示了不变的人幼稚NKT响应于本公开内容的α-GalCer类似 物的T_H1/T_H2细胞因子产生。用自体未成熟的CD14⁺DC培养人Vα24+ iNKT，并用对照DMSO、α-GalCer或指示的α-GalCer类似物脉冲18小 时。图11(A)显示了IFN-γ的诱导，(B)显示了IL-4的诱导，(C)显示了标 准化成DMSO对照的IFN-γ与IL-4比值。在图12中列出了来自幼稚人 Vα24+iNKT的细胞因子和趋化因子的诱导。

使用α-GalCer类似物增殖和活化NKT

在一个方面，本公开内容的合成的α-GalCer类似物能增殖和活化 NK和iNKT。因为已经在具有恶性肿瘤的患者中证实了人外周血单核细 胞中iNKT数目的减少，使用本公开内容的α-GalCer类似物来增殖和活 化这样的患者的iNKT可以具有治疗益处。在一个示例性的实施方案中， 本公开内容的α-GalCer类似物能在体外使人iNKT增殖。

提供了生产分离的、培养增殖的NKT群体的方法，其包括：使Vα14i 或Vα24iT细胞接触树突细胞和本公开内容的α-GalCer类似物一段时间， 导致类似物-特异性的T细胞增殖，并分离这样得到的增殖的T细胞， 从而生产分离的、培养增殖的NKT群体。在一个示例性的实施方案中， 生产分离的、培养增殖的NKT群体的方法另外包含下述步骤：将细胞 因子或生长因子加入树突细胞、NKT细胞培养物中。

用自体未成熟的CD14⁺DC培养人CD56⁺细胞(NK/NKT细胞混合 物)，并用DMSO、α-GalCer或本公开内容的不同的α-GalCer类似物脉 冲处理。在暴露后第9天，通过流式细胞术，测定NK和NKT和NKT 亚群iNKT(CD161⁺/Vα24⁺/CD56⁺/CD3⁺)的增殖/存活。如图13和14所示， 在用C2、C8-C12和C15-C16刺激后，观察到iNKT相对于对照的显著 增加。在测试的α-GalCer类似物中，来自第III组的几种芳族化合物(特 别是C11、C15和C16)比C1更有效。

如图15所示，用自体未成熟的CD14⁺DC培养人CD56⁺细胞 (NK/NKT混合物)，并在第2天用10或100ng/ml的DMSO、α-GalCer 或本公开内容的不同的α-GalCer类似物脉冲处理18小时。在第9天， 通过流式细胞术测定NK/NKT混合物中CD161⁺/Vα24TCR⁺细胞的百分 比。图15A显示了响应于100ng/ml的Vα24i NKT的百分比。图15B 显示了响应于不同剂量的Vα24i NKT的总数的倍数变化。^*，p＜0.05(相 对于DMSO)；#，p＜0.05(相对于C1)。

使用α-GalCer类似物进行树突细胞的成熟和延长

最有效的抗原呈递细胞(APC)是成熟的、免疫活性的树突细胞(DC)。 DC能从未成熟的抗原捕获细胞进化成成熟的、呈递抗原的、引发T细 胞的细胞；将抗原转化成免疫原，并表达诸如细胞因子、趋化因子、共 刺激分子和蛋白酶等分子，以启动免疫应答。但是，诱导的T细胞-介 导的免疫应答的类型(耐受性相对于免疫，T_H1相对于T_H2)可以随具体 的DC谱系和成熟阶段以及从周围微环境接收的活化信号而变化。

树突细胞的调节免疫的能力依赖于树突细胞成熟。结果，树突细胞 的成熟对于免疫应答的启动是至关重要的。在抗原摄取和在DC内加工 后，许多因素可以诱导成熟。在它们从未成熟的细胞向成熟的细胞转化 过程中，树突细胞经历许多表型的和功能的变化。一般而言，树突细胞 成熟的过程包含：主要组织相容性复合体(MHC)分子从细胞内胞吞隔 室向树突细胞表面重新分布，抗原内化的下调，共刺激分子的表面表达 的增加，形态学变化(例如树突的形成)，细胞骨架重造，趋化因子、细 胞因子和蛋白酶的分泌，和粘附分子和趋化因子受体的表面表达。

在一个方面，本公开内容的合成的α-GalCer类似物能促进人DC的 成熟。树突细胞成熟可以导致增强的适应性免疫应答。公开了成熟树突 细胞的方法，其包括：提供未成熟的树突细胞；以及用一定浓度的本公 开内容的α-GalCer类似物温育未成熟的树突细胞一段时间，使得未成熟 的树突细胞变得成熟。在一个示例性的实施方案中，这些成熟的树突细 胞然后可以用作免疫疗法，例如，癌症免疫疗法和佐剂免疫疗法。在另 一个示例性的实施方案中，本公开内容的α-GalCer类似物可以与未成熟 的树突细胞或成熟的树突细胞相组合，然后用作免疫疗法，例如，癌症 免疫疗法和佐剂免疫疗法。

本公开内容的α-GalCer类似物能诱导小鼠脾树突细胞成熟。在体 外，本公开内容的α-GalCer类似物能直接增加人DC上的不同表面成熟 标记(包括CD40、CD54、CD80、CD83、CD86、CD209和HLA-DR(MHC II分子))的表达水平以及树突延长。如图16所示，C13表现出CD40、 CD80、CD83、CD86和HLA-DR的表达水平的显著增加，并促进人单 核细胞-衍生的DC的成熟。图17A显示了响应于C13的树突细胞中 CD40、CD80、CD83、CD86和HLA-DR表达的直方图。图17B显示了 用C13温育48小时的树突细胞的形态学。

使用α-GalCer类似物对NKT的CD1d-依赖性的TCR活化

在另一个方面，本公开内容的合成的α-GalCer类似物能诱导CD1d- 依赖性的TCR活化。图18显示的示意图总结了NKT中的TCR信号传 导途径。iNKT识别在抗原呈递细胞(APC)的表面上的CD1d通过T细胞 受体复合体呈递的糖脂抗原。糖脂抗原的结合会活化iNKT中的胞质激 酶，包括ERK1/2、p38、lκBα、CREB、STAT3和STAT5的磷酸化。这 些信号传导级联导致iNKT增殖和细胞因子/趋化因子产生。

在一个示例性的实施方案中，本公开内容的α-GalCer类似物能诱导 幼稚人NKT的CD1d-依赖性的TCR活化。为了辨别TCR活化是否是 CD1d-依赖性的，测定了由过表达人CD1d的HeLa-CDld和对照HeLa 细胞呈递的本公开内容的不同的α-GalCer类似物的作用。另外，对比了 HeLa-CD1d(非专职APC)和未成熟的DC(专职APC)的将不同的 α-GalCer类似物呈递给NKT的能力。如图19所示，C1和α-GalCer类 似物C11、C13和C17使细胞内的磷酸-CD3ε值比对照分别增加到7.3、 10、7.3和5.9倍(当由HeLa-CD1d细胞呈递时)和10.8、21.3、17.3 和12倍(当由DC呈递时)。对于磷酸-ERK1/2，C1和α-GalCer类似 物C11、C13和C17分别诱导增加到6.6、14.6、6.6和3.3倍(HeLa-CD1d 细胞)和30、48.3、35和18.6倍(DC)。磷酸-CREB的诱导甚至是更 令人惊奇的；C1和α-GalCer类似物C11、C13和C17肺病诱导了2、117、 41和20倍表达(当由HeLa-CD1d细胞呈递时)和增加到68、204、158 和49倍(当由DC呈递时)。测试的α-GalCer类似物都对Syk的磷酸 化没有任何作用，所述磷酸化是已知在B细胞受体信号传递中起作用、 但是不在TCR途径中起作用的蛋白激酶。这些发现表明，与非专职APC 相比当由专职APC呈递时，本公开内容的芳族的α-GalCer类似物以 CD1d-依赖性的方式诱导强TCR活化，且活化程度得到极大增强。当与 对照HeLa细胞共培养时，本公开内容的α-GalCer类似物都没有表现出 对NKT细胞中的CD3ε、ERK1/2或CREB的磷酸化的任何作用。总之， 在TCR活化中，化合物C11和C13看起来比化合物C1和C17更强， 这与由C11(相对于C1)触发的它们的更大的T_H1-偏移的细胞因子分 布的诱导相一致，因为已经报道，ERK1/2和CREB活化在许多T_H1细 胞因子(诸如IL-12和IFN-γ)的诱导中起作用。C13也触发显著的TCR 活化，推测是C13的增强DC上的共刺激分子的表达的独特能力的结果。 对于检查的4种α-GalCer类似物，与HeLa-CD1d细胞相比，当由树突 细胞(尤其是C13)呈递时，会更有效地活化TCR。与C1相比，α-GalCer 类似物C11诱导的更高水平的磷酸化的CD3ε、ERK1/2和CREB与下述 观念相一致：糖脂与CD1d的更强的结合诱导NKT上TCR的更大的刺 激。

图20显示了本公开内容的α-GalCer类似物能诱导CD1d-依赖性的 TCR活化的另一个示例性的实施方案。本公开内容的不同的α-GalCer 类似物(具体地C16、C23、C26、C8-5和C8-6)能活化人iNKT(Vα24⁺T 细胞)中的TCR信号传导途径，磷酸化ERK1/2、p38、lκBα、CREB、 STAT3和STAT5。为了辨别TCR活化是否是CD1d-依赖性的，测定了 由过表达人CD1d的HeLa-CD1d和对照HeLa细胞呈递的本公开内容的 不同的α-GalCer类似物的作用。图20A显示了通过流式细胞术测定分 离的Vα24⁺T细胞，其含有92％幼稚Vα24⁺/CD3⁺T细胞。C1和α-GalCer 类似物(具体地C16、C23、C26、C8-5和C8-6)增加细胞内的(B)磷酸 -CD3ε(磷酸-酪氨酸)、(C)磷酸-CREB(Ser133)、(D)磷酸 -ERK1/2(Thr185/Tyr187)、(E)磷酸-p38(Thr180/Tyr182)、(F)磷酸-IκBα (Ser32)、(G)磷酸-Lck、(H)磷酸-Lat、(I)磷酸-STAT3(Ser727)、(J)磷酸 -STAT5A/B(Tyr 694/699)、(K)磷酸-Syk(磷酸-酪氨酸)和(L)磷酸-Zap-70 (磷酸-酪氨酸)的值。^*，p＜0.05(相对于DMSO)；#，p＜0.05(相对于 C1)。

本公开内容的α-GalCer类似物在体外也表现出更高的对CD1d-限制 的小鼠NKT/T的结合亲和力(图21)，和在体内2个亚群NKT和NK的 CD1d-依赖性的活化(图22)。如图21所示，在静脉内(IV)注射0.1μg/小 鼠的指示的α-GalCer类似物(C1、7DW8-5、C26、C8、C17)或载体后 72小时，从BALB/c小鼠收获脾。用负载α-GalCer的mCD1d四聚体(10 摩尔/μg)，染色小鼠NKT细胞(图21A)或T细胞(图21B)的百分比。图 21C显示了α-GalCer和苯酚α-GalCer类似物7DW8-5对CD1d-限制的 NKT和T细胞的不同的结合亲和力。图22显示了2个NKT亚群的CD1- 依赖性的增殖。在静脉内注射DMSO对照、α-GalCer或指示的α-GalCer 类似物C8、C16、C22、C23、C26、7DW8-5和7DW8-6后72h，从BALB/c 野生型(WT)或CD1敲除(KO)小鼠收获脾。通过FACS，评估(B)野生型 或(C)CD1敲除的小鼠中响应于指示的α-GalCer类似物的NKT和它的2 个亚型的总数，所述2个亚型命名为II型NKT(CD3⁺/NK⁺/CD49⁺/CD69_-) 和I型NKT(CD3⁺/NK⁺/CD49_-/CD69⁺)。(D)显示了NK的CD1d-依赖性 的活化。通过FACS，评估了WT或CD1KO小鼠中响应于指示的 α-GalCer类似物的有活性的NK(CD3^-/NK⁺/CD69⁺)的总数的增加。^*，p＜ 0.05(相对于DMSO)；#，p＜0.05(相对于C1)。

使用α-GalCer类似物的体内T_H细胞活化、脾细胞的增殖/活化和NKT的CD1d-依赖性的TCR活化

在另一个方面，本公开内容的α-GalCer类似物能在体内活化T_H细 胞。为了评价施用途径对细胞因子分泌的影响，通过静脉内(IV)、皮下 (SubQ)或肌肉内(IM)途径，将α-GalCer和7种本公开内容的α-GalCer 类似物注射进BALB/c小鼠，并测定对细胞因子产生的影响。图23A、 27A和29A显示了通过不同的途径注射不同的α-GalCer类似物后72小 时内的IFN-γ的血清水平。一般而言，细胞因子产生的增加早在2小时 就可检出，在18小时达到峰值，并在48小时之前逐渐下降至基线水平。 当通过IV途径引入时(图23A)，α-GalCer类似物C9和α-GalCer类似物 C16表现出与C1接近的活性水平，继之为α-GalCer类似物C13、C11、 C2、C14和C3。值得注意的是，SubQ施用(图27A)相同的α-GalCer类 似物诱导的IFN-γ的水平比IV途径低很多，而IM途径的水平(图29A) 是中间值。尽管当IV施用时C1诱导最高的IFN-γ水平，但当通过SubQ 和IM途径施用时，α-GalCer类似物C9超过了C1。图23B、27B和29B 显示了通过不同的途径注射α-GalCer类似物后的IL-4水平。当通过SubQ 途径引入时，测试的所有α-GalCer类似物以及α-GalCer表现出微小的 IL-4诱导，而当IM施用时，所有α-GalCer类似物诱导中间的IL-4水平。 当将数据表示为IFN-γ/IL-4比值(图23C、27C和29C)来反映T_H1/T_H2 偏移时，通过IV途径在2小时，细菌起源的芳族α-GalCer类似物C11、 C13、C16和C14引起比C1更少的T_H2应答，且在18-72小时期间，所 有α-GalCer类似物诱导T_H1偏移应答，如图23C、27C和29C所示。此 外，当通过SubQ途径施用时，在2-72小时的整个时段，除了α-GalCer 类似物C2和C3以外，所有测试的本公开内容的α-GalCer类似物表现 出比C1更高的T_H1/T_H2比。另一方面，当通过肌肉内注射施用时，在2 小时，所有本公开内容的α-GalCer类似物表现出T_H2偏移的应答，且在 18-72小时期间，除了C14以外，又都转向更向T_H1偏移的应答。后者 在2小时表现出更T_H1偏移的应答，且在2-72小时的整个期间保持T_H1 偏移。从另一个角度，图24显示了在IV施用指示的α-GalCer类似物后 2和18h，分泌的(A)IFN-γ、(B)IL-4的小鼠血清水平和(C)IFN-γ/IL-4 比值。

响应于这些新颖的α-GalCer类似物，连同IFN-γ和IL-4一起，血清 中的其它细胞因子和趋化因子也显著增加。它们包括IL-2、IL-6、KC、 IL-10、IL-12、IL-13、GM-CSF、TNFα、RANTES、MCP-1和MIP-1， 它们列出在图25的表中。在IV施用中，这些新颖的α-GalCer类似物引 起比C1更大的T_H1偏移的细胞因子和趋化因子应答。例如，芳族 α-GalCer类似物C11、C13和C16诱导IL-2、IL-12、MIP-1β和MCP-1 的惊人升高，且C14表现出更大的IL-3、GM-CSF和IL-12的诱导。

为了测定注射过α-GalCer或指示的本公开内容的α-GalCer类似物 的BALB/c小鼠的脾中的免疫细胞群体，注射BALB/c小鼠，然后在注 射后72小时检查。如图26所示，在IV施用后，测试的所有α-GalCer 类似物诱导下述细胞的显著增加：(A)脾细胞，其中C9、C13和C16 表现出比C1更大的效价，(B)DC，(C)NK，(D)NKT，(E)B细胞，(F)CD8⁺T细胞，(G)CD4⁺T细胞和(H)活化的CD8⁺/CD4⁺比。如图28所示，在 SubQ施用后，与C1相比，测试的α-GalCer类似物都没有表现出对(A)脾 细胞的增加的显著作用。如图30所示，在IM施用后，测试的所有 α-GalCer类似物诱导：(A)脾细胞增殖，其中C9、C13和C14具有比 C1更大的作用。芳族α-GalCer类似物C12、C13和C16诱导比C1明 显更大的总DC和成熟DC的升高(图26B、28B和30B)。α-GalCer类 似物C9、C12、C13和C16表现出NK和NKT的增殖/活化的最好能力 (图26C-D、28C-D和30C-D)。α-GalCer类似物C16在B细胞增殖方面 最有效，且α-GalCer类似物C2、C9、C10和C11也比C1更有活性(图 26E、28E和30E)。对于CD8⁺T细胞，α-GalCer类似物C14在细胞增 殖/活化方面最有效，尽管α-GalCer类似物C9、C11、C16、C12和C13 也比C1更有活性(图26F、28F和30F)。α-GalCer类似物C9在CD4⁺T 细胞增殖/活化方面比C1更有效(图26G、28G和30G)。在T细胞亚群 中，测试的所有α-GalCer类似物诱导CD8⁺/CD4⁺比的升高，α-GalCer 类似物C11、C13、C14和C16比C1更有效(图26H、28H和30H)。 在通过SubQ途径用α-GalCer类似物处理的小鼠中，α-GalCer类似物C9 诱导比C1明显更大的总DC和成熟DC的增殖，而剩余的α-GalCer类 似物与C1相当(图28B)。对于NK和NKT增殖/活化，α-GalCer类似物 C9、C11、C13、C14和C16表现出与C1相当的活性，且剩余的α-GalCer 类似物表现出更少的活性(图28C-D)。对于B细胞增殖/活化，α-GalCer 类似物C1、C9、C11和C13表现出显著的活性(图28E)。对于CD8⁺T 细胞，α-GalCer类似物C9、C11、C13、C14和C16表现出比C1更高 的活性，且剩余的α-GalCer类似物表现出与C1相当的活性(图28F)。 对于CD4⁺T细胞，C1最有效，尽管α-GalCer类似物C9、C11、C13、 C14和C16也比对照更有活性(图28G)。对于T细胞，测试的大多数 α-GalCer类似物引起比C1更大的CD8⁺/CD4⁺比增加(图28H)。当通过 肌肉内途径引入α-GalCer类似物时，全部诱导DC、NK、NKT、B细胞 和CD8⁺/CD4⁺比的显著增加。大多数新颖的α-GalCer类似物引起比C1 更大的树突细胞增殖(图30B)。α-GalCer类似物C9和C14表现出比 C1更强的NK细胞诱导(图30C)，但是相当的或更少的对NKT细胞的作 用(图30D)。α-GalCer类似物C2、C11、C12和C16表现出比C1更强 的B细胞活化(图30E)。对于CD8⁺T细胞，α-GalCer类似物C9和C16 表现出与C1相当的细胞增殖/活化活性，且剩余的α-GalCer类似物与对 照相比诱导显著的增加(图30F)。对于CD4⁺T细胞，α-GalCer类似物C2 和C9表现出与C1相当的细胞增殖/活化活性，且剩余的α-GalCer类似 物与对照相比诱导显著的增加(图30G)。α-GalCer类似物C9、C11和 C16表现出与C1类似的升高CD8⁺/CD4⁺比的活性(图30H)。

图31显示了α-GalCer类似物的给药途径对细胞因子动力学和脾细 胞增殖/活化的影响的另一个示例性的实施方案。图31(A-C)显示了通过 不同途径施用的DMSO载体、α-GalCer或α-GalCer类似物C16引起的 细胞因子的动力学。给BALB/c小鼠IV、SubQ或IM注射载体、C1或 C16(每只小鼠2μg)。分析在0、2、18、36、48、72h收集的血清样品 中的细胞因子：(A)IFN-γ、(B)IL-4和(C)标准化成DMSO载体的IFN-γ 与IL-4比值。图31(D-K)显示了对不同的途径施用的载体、C1和C16 响应的脾细胞的增殖/活化。在IV、SubQ或IM注射C1、C16(每只小 鼠2μg)或载体后72h，从BALB/c小鼠收获脾。(D)显示了有核细胞的 总数，(E-G)显示了先天免疫细胞群体，包括成熟的树突细胞 (CD11C+/CD80⁺/CD86⁺)，活化的NK(U5A2^-13Ag⁺/CD3^-/CD69⁺)，活化 的NKT(U5A2^-13Ag⁺/CD3⁺/CD69⁺)，(H-J)显示了适应性免疫细胞，包括 活化的B细胞(CD45R⁺/CD23⁺/CD69⁺)，活化的CD8T细胞 (CD3⁺/CD4^-/CD8⁺/CD69⁺)，和活化的CD4T细胞 (CD3⁺/CD4⁺/CD8^-/CD69⁺)，(K)显示了标准化成DMSO的CD8/CD4比 值。^**，p＜0.05(相对于C1)。

在另一个示例性的实施方案中，以不同的剂量，将本公开内容的 α-GalCer类似物施用给小鼠，以测定脾细胞的增殖/活化的剂量-应答是 否是显著的。如图32A-H所示，在静脉内注射载体或α-GalCer类似物 C11(2或0.1μg/小鼠)后72h，从BALB/c小鼠收获脾。(A)显示了有核 细胞的总数，(B-H)显示了先天免疫细胞群体，包括成熟的DC (CD11C+/CD80⁺/CD86⁺)，活化的NK(U5A2^-13Ag⁺/CD3^-/CD69⁺)，活化 的NKT(U5A2^-13Ag⁺/CD3⁺/CD69⁺)，单核细胞(CD11b⁺Gr1^-)，粒细胞 (CD11b^-Gr1⁺)；(F-H)显示了适应性免疫细胞，包括活化的CD4T细胞 (CD3⁺/CD4⁺/CD8^-/CD69⁺)，活化的CD8T细胞(CD3⁺/CD4^-/CD8⁺/CD69⁺)， 和活化的B细胞(CD45R⁺/CD23⁺/CD69⁺)。^*，p＜0.05(相对于DMSO)； #，p＜0.05(相对于C11)(每只小鼠2μg)。

在另一个体内示例性的实施方案中，评估了由本公开内容的不同的 α-GalCer类似物诱导的T_H1/T_H2细胞因子的动力学(图33)。给BALB/c 小鼠IV注射载体、C1或指示的α-GalCer类似物(参见A，0.1μg/小鼠)。 在0、2、12、24、48和72h收集血清样品，然后评估(B)IFN-Y、(C)IL-4 的分泌和(D)标准化成DMSO对照的IFN-γ与IL-4比值。这些有效的 α-GalCer类似物引发了细胞因子/趋化因子，从图34中的表可以看出， 其中显示了在2和18h收集的血清样品。将本公开内容的α-GalCer类 似物IV施用给野生型(WT)和CD1d敲除的(CD1KO)BALB/c小鼠(0.1 μg/小鼠)，参见图35。在2和18h收集血清样品，然后分析细胞因子/ 趋化因子，包括(A)IFN-γ、(B)IL-4、(C)IFN-γ/IL-4比、(D)IL-10、(E) IL-12p70、(F)KC)和(G)MCP-I。^*，p＜0.05(相对于DMSO)。结果表 明本公开内容的α-GalCer类似物在小鼠中引起CD1-依赖性的细胞因子/ 趋化因子分泌。

图36显示了注射本公开内容的不同的α-GalCer类似物后，脾细胞 的增殖/活化和2个NKT亚群的CD1d-依赖性的活化的另一个示例性的 实施方案。(A-F)显示了测试的α-GalCer类似物引起的脾细胞的增殖/活 化。在静脉内注射载体、α-GalCer或指示的α-GalCer类似物(0.1μg/小 鼠)后72h，从C57BL/6小鼠收获脾。(A)显示了有核细胞的总数，(B-F) 显示了成熟的树突细胞的群体(CD11C⁺/CD80⁺/CD86⁺)，活化的NK (NK1.1⁺/CD3^-/CD69⁺)，活化的CD4T细胞(CD3⁺/CD4⁺/CD8^-/CD69⁺)，活 化的CD8T细胞(CD3⁺/CD4^-/CD8⁺/CD69⁺)，和标准化成DMSO的 CD8/CD4比。^*，p＜0.05(相对于DMSO)。(G-H)显示了2个NKT亚 群的CD1-依赖性的增殖。在静脉内注射载体、C1、7DW8-5、C22、C23、 C26、C34和C17(0.1μg/小鼠)后72h，从C57BL/6野生型(Wt)或CD1 敲除的(CD1KO)小鼠收获脾。(G)显示了通过流式细胞术测定小鼠NKT (左下图)。通过FACS，在野生型中观察到NKT(左上图)和它的2个亚 型的总数的增加，所述亚型包括II型NKT (CD3⁺/NK1.1⁺/CD49⁺/CD69^-)(右上图)和I型NKT (CD37NK1.1⁺/CD49^-/CD69⁺)(右下图)。(H)显示了CD1KO小鼠中的NKT 的总数，且(I)显示了α-GalCer类似物引起的野生型C57BL/6小鼠中Treg 细胞(CD4⁺/CD25⁺/FoxP3⁺)的总数。^*，p＜0.05(相对于DMSO)；#，p＜ 0.05(相对于C1)。

免疫疗法

免疫系统通过清除病菌来有效地防止我们的身体被侵占。如果没有 有效的免疫系统，人类会发展所有类型的细菌、病毒、原生动物、寄生 虫和真菌的感染。他们还更可能发展癌症。因为NKT在免疫系统中起 调节作用，它们是免疫疗法的有吸引力的靶标。NKT的活化可以自相矛 盾地导致免疫应答的抑制或刺激。例如，认为T_H1细胞因子的产生与抗 肿瘤、抗病毒/抗细菌和佐剂活性有关，而认为T_H2细胞因子的产生会抑 制自身免疫病。

抗肿瘤免疫疗法

现在理解，免疫系统和癌症之间存在坚固的联系，且通过适当地刺 激免疫系统，可能影响许多癌症。已经证实，用α-GalCer处理小鼠会 抑制肿瘤转移到肝、肺和淋巴结。在给晚期癌症患者注射α-GalCer或 α-GalCer-负载的iDC的2个I期临床试验中，在治疗之前具有可检测的 Vα24⁺Vβ11⁺NKT数目的那些患者中观察到免疫系统的显著活化。尽管 没有持续的肿瘤消退，在几位患者中观察到稳定的疾病，没有任何毒性， 且有些患者甚至表现出血清肿瘤标记或肿瘤大小的暂时减少。α-GalCer 在几个临床试验中缺少显著的抗癌活性，可能是由于IL-4(一种T_H2细 胞因子)对IFN-γ(一种T_H1细胞因子)的作用的中和，导致没有净益处。

在一个方面，本公开内容的合成的α-GalCer类似物具有作为抗肿瘤 免疫疗法活性剂的用途。可以设计本公开内容的α-GalCer类似物，使得 它们是T_H1-偏移的。这些T_H1-偏移的α-GalCer类似物能引起T_H1细胞 因子应答，增加遭受癌症的动物的存活时间，减慢遭受癌症的动物中的 肿瘤生长，和增加肿瘤浸润性淋巴细胞，包括T、CD8T、NK和NKT 细胞。

在一个示例性的实施方案中，本公开内容的α-GalCer类似物用作抗 肿瘤免疫疗法中的治疗药物。α-GalCer类似物可以作为癌症疫苗施用。 在另一个示例性的实施方案中，本公开内容的α-GalCer类似物可以用于 组合的免疫疗法中，其中将α-GalCer类似物与已经存在的癌症疫苗相组 合。用任一种本公开内容的a-GalCer类似物治疗的受试者可以遭受癌 症，可以处于增加的癌症风险中，或可以具有癌变前预兆。

在某些示例性的实施方案中，本公开内容提供了抗肿瘤免疫疗法， 其包括将有效量的化合物或盐或其混合物施用给受试者，所述化合物选 自：C3、C10-C17、C19-C28、C34和C8-5。

为了测定本公开内容的α-GalCer类似物的抗癌效力，在一个示例性 的实施方案中，在同基因的免疫活性的小鼠(分别是C57BL/6和BALB/c) 中，研究了TC1细胞系的转移性肺癌小鼠模型和4T1细胞系的乳腺癌的 SubQ肿瘤模型。图38A显示了代表性的实验的结果，用α-GalCer类似 物C11处理的小鼠的肺表面上的肿瘤结节的数目减少。在图37中，显 示了IV施用来自第I-IV组的本公开内容的不同的α-GalCer类似物和C1 对携带TC1肿瘤的小鼠的存活的影响。除了C4、C6、C7、C8和C17 以外，使用许多测试的α-GalCer类似物观察到显著的存活延长和减少的 体重减轻。此外，8种测试的α-GalCer类似物C3、C10、C11、C12、 C13、C14、C15和C16具有比C1明显更大的抗癌效力。接着，评估了 IV施用的8种α-GalCer类似物和C1对携带4T1乳腺癌的小鼠的抗肿 瘤效力。作为一个实例，在图38B中显示了用α-GalCer类似物C11处 理后16天，小鼠减小的肿瘤大小。与对照相比，测试的所有α-GalCer 类似物都能抑制肿瘤生长和延长存活，且都比C1更有效(图39A)。 基于这些发现，测试了一些最有活性的本公开内容的α-GalCer类似物 (C9、C11、C13、C14、C16)和C1的SubQ递送的作用。与对照相比， 测试的α-GalCer类似物的SubQ递送能抑制肿瘤生长和延长存活。 α-GalCer类似物C13、C14和C16实现了比C1明显更大的肿瘤大小抑 制，尽管它们对存活的作用没有明显不同于C1(图39B)。SubQ递送的 C1表现出比IV途径统计上更好的效力(图40)，而给药途径没有显著影 响测试的其它α-GalCer类似物的抗肿瘤作用(图39A-B)。接受α-GalCer 类似物的SubQ注射的小鼠表现比IV治疗的那些更低的发病率，这与 SubQ施用后更低的细胞因子/趋化因子的血清水平相一致。

为了优化这些新颖的α-GalCer类似物的治疗方案，我们评估了在携 带肿瘤的小鼠中的抗癌效力，特别聚焦于途径、频率和施用剂量(参见 图41-44)。结果证实，最佳给药方案是给每只小鼠IV施用0.1μg α-GalCer，每周1次。这适用于患有乳腺癌和肺癌以及黑素瘤的小鼠的 治疗(参见，图43和44)。用新的α-GalCer类似物治疗导致肿瘤浸润性 淋巴细胞的增加，包括T、CD8T、NK和NKT(参见，图45)。图41A-B 显示了不同的施用途径的影响。(A)给BALB/c小鼠SubQ接种小鼠乳 腺癌细胞4T-1。肿瘤接种后3天，用载体、α-GalCer或指示的α-GalCer 类似物(每只小鼠2μg)处理小鼠(IV或SubQ)，每周2次，持续4周。 每3天记录肿瘤体积，持续33天，并监测存活，直到70天。左图，患 有乳腺癌的小鼠的卡普兰-迈耶存活曲线；右图，肿瘤生长曲线。(B)给 C57BL/6小鼠IV接种小鼠肺癌细胞TC-1，然后用载体、α-GalCer或指 示的α-GalCer类似物(每只小鼠2μg)处理(IV或SubQ)，每周2次，持 续4周。左图，患有肺癌的小鼠的卡普兰-迈耶存活曲线；右图，体重的 变化。

(C)显示了施用频率的影响。给C57BL/6小鼠IV接种小鼠肺癌细胞 TC-1，然后用载体、α-GalCer或指示的α-GalCer类似物(每只小鼠2μg) 处理(IV或SubQ)，每周2次或每周1次，持续4周。左图，具有肺癌 的小鼠的卡普兰-迈耶存活曲线；右图，体重的变化。

图43和44显示了使用优化的方案对本公开内容的α-GalCer类似物 的抗癌效力的评价。图43显示给C57BL/6小鼠IV接种肺癌(TC1)或 SubQ接种黑素瘤(B16)细胞，然后用载体、α-GalCer或指示的α-GalCer 类似物(C23、C26、C34、7DW8-5)IV处理(0.1μg/小鼠)，每周1次持 续4周。(A)显示了携带TC1的小鼠的卡普兰-迈耶存活曲线，(B)显示了 B16肿瘤的生长曲线。测试的所有α-GalCer类似物表现出携带TC1的小 鼠的存活时间的显著增加。另外，当用本公开内容的α-GalCer类似物处 理携带B16的小鼠时，肿瘤大小显著减小。图44(A-B)显示了小鼠中肿 瘤生长的实时评估。给C57BL/6小鼠SubQ接种(A)肺癌(TC1-GFP- 萤光素酶)或(B)乳腺癌(4T1-GFP-萤光素酶)细胞，然后用载体、 α-GalCer或指示的α-GalCer类似物(C23、C34、7DW8-5和C17)IV处 理(0.1μg/小鼠)，每周1次持续4周。评估体内肿瘤生物发光的像素， 并通过IVIS系统计算。左图，生物发光的定量数据；右图，携带肿瘤 的小鼠的代表性图像。^*，p＜0.05(相对于DMSO)；#，p＜0.05(相对 于C1)。在接种肺癌的小鼠中，α-GalCer类似物C34、C23和C8-5表 现出与对照和α-GalCer相比显著减少的肿瘤生长。令人感兴趣地，这些 α-GalCer类似物C34、C23和C8-5都已经被证实产生向T_H1-偏移的应 答，如上面的结果所证实的。在接种乳腺癌的小鼠中，α-GalCer类似物 C8-5表现出与对照和α-GalCer相比显著减少的肿瘤生长。α-GalCer类 似物C17表现出与对照相比显著减少的肿瘤生长，但是具有与α-GalCer 类似的结果。令人感兴趣地，α-GalCer类似物C17已经被证实产生向 T_H2-偏移的应答，如上面的结果所证实的。这些结果证实了下述观点， 即认为T_H1细胞因子的产生与抗肿瘤活性相关联。

图45显示了在一个示例性的实施方案中，本公开内容的α-GalCer 类似物如何在肺和黑素瘤肿瘤中引起向T_H1-偏移的肿瘤浸润性淋巴细 胞。(A-D)显示了肺癌中的肿瘤浸润性淋巴细胞。用载体、α-GalCer或指 示的α-GalCer类似物(C23、C34、C8-5；0.1μg/小鼠，每周1次)处理携 带TC1肿瘤的C57BL/6小鼠，在第21天，取出肿瘤的单细胞悬浮液进 行染色：(A)CD3⁺T细胞，(B)CD8T细胞(CD3⁺/CD4^-/CD8⁺)，(C)NK (NK1.1⁺/CD3^-)和(D)NKT(NK1.1⁺/CD3⁺)，标准化成DMSO。与对照和 α-GalCer相比，α-GalCer类似物C34表现出肺癌中T_H1-偏移的肿瘤浸润 性淋巴细胞数目的显著增加。与对照相比(对于CD3⁺T细胞)和与对照和 α-GalCer相比(对于CD8T细胞、NK和NKT)，α-GalCer类似物C23和 C8-5也表现出肺癌中肿瘤浸润性淋巴细胞数目的显著增加。(E-H)显示 了黑素瘤中的肿瘤浸润性淋巴细胞。用载体、α-GalCer或指示的α-GalCer 类似物(C23、C34、C8-5；0.1μg/小鼠，每周1次)处理携带B16黑素 瘤的C57BL/6小鼠，在第21天，取出肿瘤的单细胞悬浮液进行染色： (E)CD3⁺T细胞，(F)CD8T细胞(CD3⁺/CD4^-/CD8⁺)，(G)NK (NK1.1⁺/CD3^-)和(H)NKT(NK1.1⁺/CD3⁺)，并标准化成DMSO。与对照和 α-GalCer相比，α-GalCer类似物C23、C8-5和C34均表现出黑素瘤中 T_H1-偏移的肿瘤浸润性淋巴细胞数目的显著增加。^*，p＜0.05(相对于 DMSO)；#，p＜0.05(相对于C1)。

佐剂免疫疗法

对肽、蛋白、多糖和DNA免疫原的佐剂效应

佐剂是这样的化合物，当与抗原相组合时，其会增强免疫的物种中 的免疫应答。八十多年来，佐剂已经被用于增强疫苗的效力。含有减毒 形式的传染性生物的活疫苗通常自己就能很好地起作用。但是含有死的 生物(灭活疫苗)或传染性生物的碎片或它们的毒素(无细胞的或重组的 疫苗)的疫苗通常需要佐剂来增强它们的效力。在大多数情况下，诱导的 应答的类型(1型或2型)对疫苗的保护效力具有显著影响。选择性的佐 剂倾向于有利特定类型的应答。但是，功能不可预知性和商业的限制和 可用性使佐剂选择复杂化。

铝盐(称作铝，alum)是在美国被批准用于常规预防疫苗的唯一佐 剂。但是，已经证实，铝盐会在人类以及动物中排它地增加向T_H2-型应 答(例如，IL-4生产)的转移。铝盐不能引起T_H1细胞-介导的免疫应答 (例如，IFN-y生产)，这是它用作佐剂的主要限制。具体地，对于抗细胞 内病毒和细菌感染的疫苗，细胞毒性T细胞应答的缺乏是致命的。

可以合成本公开内容的α-GalCer类似物，从而启动T_H1偏移的免疫 原应答。因此，使用本公开内容的α-GalCer类似物作为佐剂，可以实现 显示出T_H1-型引导的免疫应答的改良疫苗，或除了T_H2-型应答以外还允 许免疫反应的T_H1-型转移的疫苗。这样，将一种或多种α-GalCer类似物 作为佐剂与疫苗联合施用。此外，当将本公开内容的α-GalCer类似物加 入它们中时(这允许诱导T_H1-型应答)，可以以改进的形式提供已经可 得到的疫苗。

在某些示例性的实施方案中，本公开内容提供了疫苗，其包含有效 量的选自C3、C11、C13-C14、C16-C18、C20、C22-C24、C26、C8-5 和C8-6的化合物或盐或其混合物，和疫苗试剂。在某些情况下，所述 疫苗试剂选自：杀死的微生物、活的减毒病毒微生物、类毒素和灭活的 或减毒的微生物的片段。在某些情况下，所述微生物是细菌或真菌。在 某些情况下，所述类毒素是破伤风或白喉。在某些情况下，所述疫苗试 剂能在施用所述疫苗的受试者中引起免疫应答。在某些情况下，所述化 合物起免疫佐剂的作用，且能通过刺激免疫系统来修饰或增加由疫苗试 剂引起的免疫应答，这导致受试者对疫苗更剧烈的应答(与没有化合物 相比)。

在一个方面，适宜的疫苗可以包含肽、蛋白、多糖或DNA免疫原。 在另一个方面，所述疫苗可以选自一种或多种可商业得到的疫苗，例如， 但不限于，针对下述的疫苗：甲型肝炎、乙型肝炎、轮状病毒、白喉、 破伤风、百日咳、流感嗜血杆菌b型、肺炎球菌、脊髓灰质炎病毒、流 感、麻疹、腮腺炎、风疹、水痘、Meningiococcal、人乳头状瘤病毒、 带状疱疹、猫鼻气管炎、伤寒、日本脑炎、狂犬病、蜱传脑炎、霍乱、 黄热、H5N1、西尼罗、细小病毒、猫鼻气管炎，、杯状病毒、猫瘟病毒、 鹦鹉衣原体、猫白血病、犬瘟热、犬腺病毒、犬副流感、支气管炎博德 特菌、犬冠状病毒、兰伯贾第虫、钩端螺旋体属死菌苗、牛鼻气管炎病 毒、副流感3病毒、牛呼吸道合胞体病毒、牛病毒性腹泻病毒、肖韦梭 菌、Septicum Haemolyticum、Septicum Novyi、破伤风、Sordellii Perfringens、牛莫拉菌(Moraxella bovis)、溶血曼海姆菌(Mannheimia haemolytica)、Pateurella multocida、波摩那钩端螺旋体(Leptospira pomona)、哈德焦钩端螺旋体(Leptospira hardjo)、感冒伤寒型钩端螺旋 体(Leptospira grippotyphosa)、犬钩端螺旋体(Leptospira canicola)和黄 疸出血型钩端螺旋体(Leptospira icterohaemorrhagiae)。

提供了增强化合物、组合物或疫苗在受试者中的免疫原性的方法， 所述方法包括：给受试者施用另外包含根据本公开内容的佐剂的化合 物、组合物或疫苗，其中所述佐剂增强化合物、组合物或疫苗的免疫原 性。

对蛋白疫苗的佐剂效应

测试了α-GalCer和本公开内容的α-GalCer类似物的增强对现有的 基于蛋白的疫苗(诸如破伤风类毒素(TT)灭活毒素)的免疫应答的能力。 在第0天和第28天，使用或不使用本公开内容的α-GalCer类似物，给 小鼠接种TT疫苗。每周收获血清，用于测定抗-TT-特异性的抗体。图 46A显示了本公开内容的α-GalCer类似物对针对TT的抗体应答的佐剂 效应。如图46A所示，α-GalCer(C1)和α-GalCer类似物C11增强了抗-TT- 特异性的IgG抗体的生产。尽管抗-TT产生的动力学类似于常规佐剂铝 (“Alum”)所诱导的，但是C1引起比Alum明显更大的抗体产生。当将常 规的TT+Alum与C1或C11相组合时，抗体应答进一步增强至常规疫苗 的～2倍。这些发现表明C1和C11具有与Alum协同的佐剂效应，以进 一步增强免疫应答。α-GalCer类似物C11的佐剂效应非常持久。在第二 次免疫后20周，加强剂量的单独的TT(没有Alum或α-GalCer类似物 C11)在小鼠中导致在1周后抗-TT抗体快速升高。图46B显示了在第 二次免疫后20周，α-GalCer类似物C11对延迟的抗原增强的作用。用 C1或C11处理的小鼠中的抗体的水平是施用TT+Alum的2倍，且是仅 注射TT的那些的超过25倍，如图46B所示。这些发现表明C1或 α-GalCer类似物C11对记忆T和B细胞有作用，导致增加的增强免疫应 答。

对肽疫苗的佐剂效应

用含有甲型流感病毒的H1N1亚型的M2蛋白的胞外结构域的肽疫 苗，评价了佐剂效应。肽疫苗的氨基酸序列是 MSLLTEVETPIRNEWGCRCN。在第0、3和6周，使用或不使用本公开 内容的不同的α-GalCer类似物(C9、C11、C14、C17)，给雌性BALB/c 小鼠接种5或45μgM2e肽。图47显示了不同的α-GalCer类似物对M2e 肽疫苗的佐剂效应。如图47所示，在第三次免疫后2周，单独的M2e 肽诱导1.8x10⁵和5.4x10⁵(分别对于5和45μg抗原剂量)的抗-M2e- 特异性的IgG效价。当与本公开内容的α-GalCer类似物相组合时，得到 10-30倍升高的抗-M2抗体效价。在测试的α-GalCer类似物中，C11具 有最好的佐剂效应，其与完全弗氏佐剂(CFA)等效，但是效价为C1的 3倍。剩余的α-GalCer类似物(C9、C14和C17)与C1等效。这些发现 表明α-GalCer和它的类似物对肽抗原具有强佐剂活性，其中在酰基尾含 有芳族环的那些(诸如C11)是最有效的。

对DNA疫苗的佐剂效应

将H5DNA构建体(pHA)制备成含有禽流感病毒的全长H5共有序 列的质粒。简而言之，为了覆盖遗传变异性并从而诱导不同的H5N1株 之间的交叉保护，从500个H5N1病毒株的HA基因推导出共有的HA 序列，并用于疫苗开发工作。基于关于ADVAX的类似策略，将HA的 共有序列构建到pVAX载体中，作为DNA疫苗候选物，所述ADVAX 是HIV的DNA疫苗，由Ho等人开发(Jin等人，(2002)J.Virol.76 (5)：2306-2216)。在图48A中显示了在第一次免疫后3周，使用或不使用 α-GalCer(C1)的H5DNA疫苗(pHA)剂量对小鼠中的抗-H5效价的影 响。用5-45μg H5DNA疫苗(使用或不使用α-GalCer)免疫小鼠证实在 5-30μg H5DNA，α-GalCer增强了抗H5应答，但是在45μg达到平稳状 态。图48B显示了在第二次免疫后2周，低剂量H5DNA疫苗和α-GalCer (C1)对抗H5效价的影响。当H5DNA剂量减少至0.2-5μg时，对于所 有测试的低剂量，v-GalCer的佐剂效应是明显的。图48C显示了低剂量 H5DNA疫苗(使用或不使用C1)后2周，对由越南重配流感株NIBRG-14 进行的病毒攻击的保护。用＜2μg处理的动物都没有在20LD50 NIBRG-14的病毒攻击(不使用α-GalCer)中存活，而在用0.2-1μg pHA (使用α-GalCer)处理的动物中，观察到80％保护(图48C)。这些发现 证实，当与低剂量pHA疫苗一起使用时，α-GalCer对针对NIBRG-14的 保护性免疫的诱导的佐剂效应。

也使用如上所用的类似方案和计划，测试了本公开内容的其它 α-GalCer类似物作为pHA疫苗在小鼠中的佐剂，观察到差异。通过电转 移，给6-7周龄雌性BALB/c小鼠在肌肉内接种α-GalCer或指示的 α-GalCer类似物(含有pHAc)，并在4周后用相同的制剂加强一次。 在第二次疫苗接种后2周，收集血样，并通过ELISA测试抗HAc特异 性的IgG抗体效价。图49A显示了使用或不使用α-GalCer或α-GalCer 类似物C3、C11、C13、C14和C16，用0.2μg pHA免疫后，小鼠中抗 HA特异性的IgG抗体(AY3)的效价。图49B显示了使用或不使用 α-GalCer或α-GalCer类似物C10C13、C18、C19和C20，用0.2μg pHA 免疫后，小鼠中抗HA特异性的IgG抗体(AY4)的效价。图49C显示了 对于一些测试的α-GalCer类似物，如上病毒攻击后的小鼠存活百分比。 图50A显示了用0.5μg pHA和指示的α-GalCer类似物免疫后的抗HA 特异性的IgG抗体(AY4)。图50B显示了如上所述病毒攻击后的存活百 分比。图51显示了用下述物质免疫后，抗HA特异性的IgG抗体(AY5) 的小鼠效价：(A)0.1μg pHA(pHA_0.1相对于pHA_0.1+C26：p＜0.01，单向 方差分析Kruskal-Walis检验)，或(B)0.2μg pHA(pHA_0.2相对于 pHA_0.2+C17：p＜0.01，pHA_0.2相对于pHA_0.2+C26：p＜0.05，单向方差分 析Kruskal-Walis检验)和指示的α-GalCer类似物。图52显示了用下述 物质免疫后，抗HA特异性的IgG抗体(AY6)的小鼠效价：(A)0.1μg pHA或(B)0.2μg pHA和指示的α-GalCer类似物(0.1μg或1μg)。在 0.2μg pHA剂量，作为佐剂特别有效的本公开内容的α-GalCer类似物是 C13、C17、C20和C26。

图53显示了用0.2μg pHAc和α-GalCer或指示的α-GalCer类似物 C3、C10、C11、C13、C14、C16、C17、C18、C19、C20、C23、C24、 C26、7DW8-5和Alum免疫后，抗HAc特异性的IgG抗体(A)AY3、 (B)AY4、(C)AY5和(D)AYI 5的小鼠效价。结果表明C1、C13、C14、 C17、C26和7DW8-5具有比其它试剂更好的增强抗体效价的佐剂活性。 为了研究使用本公开内容的α-GalCer类似物作为佐剂是否会增强HA特 异性的CD8T细胞应答，进一步评估了C1、C26和7DW8-5。如图54 所示，在α-GalCer类似物-佐剂化的组中，IFN-γ分泌细胞增加。此外， 在NIBRG-14病毒攻击后，C1、C26和7DW8-5佐剂化的组的存活百分 比高于alum-佐剂化的或仅pHA的组(图55)。

在单次剂量的pHA疫苗接种后，本公开内容的α-GalCer类似物的 佐剂效应也是明显的。在单次剂量免疫后3周，在用C26和C1作为佐 剂处理的小鼠中，抗HA-特异性的IgG抗体增加(图56)。用C1、C26 或7DW8-5处理的小鼠被有效地保护免于NIBRG-14病毒攻击的致命攻 击，存活率范围是87.5％至100％。这些发现表明C1、C26和7DW8-5 在单次疫苗接种方法的情况中具有良好的佐剂活性。

对多糖免疫原的佐剂效应

使用单克隆抗体MBrl(IgM)和VK-9(lgG3)已经证实，Globo H多 聚己糖(Fucα1→2Galβ1→3GalNAcβ1→3Galα1→4Galβ1→4Glcβ1)在多 种上皮细胞肿瘤(诸如结肠癌、卵巢癌、胃癌、胰腺癌、子宫内膜癌、 肺癌、前列腺癌和乳腺癌)上过表达。在正常的组织中，globo H限于 腔边缘处的上皮细胞的顶表面，即免疫系统似乎不可达到的部位。因此， globo H是乳腺癌和其它上皮癌症的免疫疗法的理想靶抗原。

评价了α-GalCer和本公开内容的α-GalCer类似物C23和7DW8-5 对于globo H缀合到白喉类毒素(GH-DT)的疫苗的佐剂效应。给BALB/c 小鼠IM注射globo H-DT/α-GalCer或globo H-DT/α-GalCer类似物3次， 间隔2周。在第三次疫苗接种后2周，收集血清，并使用聚糖微阵列， 分别在1∶480和1∶240稀释度，测试IgG和IgM抗-globo H-特异性的抗 体。如图57A所示，单独的GH-DT没有诱导任何抗-globo H抗体，但 是C1或7DW8-5的加入引起了显著的IgG抗体产生。另一方面，仅在 7DW8-5-佐剂化的组中观察到IgM的产生，但是在C1处理的组中没有 观察到(图57B)。总之，将C1或7DW8-5加入GH-DT疫苗中会增强针 对碳水化合物抗原的特异性抗体生产。

抗微生物免疫疗法

在另一个方面，本公开内容的α-GalCer类似物可以用于例如传染性 疾病的治疗方法，所述传染性疾病源自例如致病的微生物剂的存在，包 括病毒、细菌、真菌、原生动物、多细胞寄生虫和异常蛋白(朊病毒)。

在某些示例性的实施方案中，所述方法为受试者提供了抗微生物免 疫疗法，其包括：将有效量的化合物或盐或其混合物施用给受试者，所 述化合物选自：C9、C11、C13-C16、C23和C34。

抗病毒作用

抗病毒药物是用于特异性地治疗病毒感染的一类药物。象抗生素一 样，特定的抗病毒药被用于特定的病毒。它们对宿主是相对无害的，因 此可以用于治疗感染。抗病毒药物仅可用于治疗几种病毒病。2种有用 的抗病毒药是核苷类似物和干扰素。存在3类干扰素：α-β-和γ-干扰素。 α和β干扰素是由病毒感染的细胞分泌的细胞因子。它们结合邻近细胞 上的特定受体，并保护它们免于病毒的感染。它们形成对病毒侵入的立 即的保护性宿主应答的一部分。除了这些直接的抗病毒作用以外，α和 β干扰素也增强受感染的细胞的表面上的I类和II类MHC分子的表达， 以此方式，增强病毒抗原向特定免疫细胞的呈递。在病毒感染的急性期， 可以在体液中证实它们的存在。重组α和β干扰素现在可得到，并已经 用于治疗慢性乙型和丙型肝炎病毒感染。但是，诸如发热、不适和体重 减轻等副作用已经限制了该应用。γ干扰素(免疫干扰素)是由T_H1 CD4细胞分泌的细胞因子。它的功能是增强特定T细胞介导的免疫应答。

干扰素的作用机理包括：1)特定免疫应答的增强。通过增加受感 染的细胞的表面上的MHC I类分子的表达，干扰素增加特定细胞毒性的 T细胞的识别和杀死受感染的细胞的机会；和2)直接的抗病毒作用：a) 病毒mRNA的降解和b)蛋白合成的抑制，这防止新细胞的感染。

在一个方面，本公开内容的合成的a-GalCer类似物用于不同的传染 性病毒的抗病毒治疗和预防。希望刺激针对它们的保护性免疫应答(可 通过本公开内容的方法来实现，或利用本公开内容的NKT、疫苗或组合 物)的传染性病毒的实例包括但不限于：逆转录病毒科(例如，人免疫 缺陷病毒，诸如HIV-1(也称作HTLV-III，LAV或HTLV-III/LAV，或 HIV-III；和其它分离物，诸如HIV-LP；细小RNA病毒科(例如，脊髓 灰质炎病毒，甲型肝炎病毒；肠道病毒，人柯萨奇病毒，鼻病毒，埃可 病毒)；嵌杯病毒科(例如，造成胃肠炎的毒株)；披膜病毒科(例如， 马脑炎病毒，风疹病毒)；黄病毒科(例如，登革热病毒，脑炎病毒，黄 热病毒)；冠状病毒科(例如，冠状病毒)；弹状病毒科(例如，水疱性 口腔炎病毒，狂犬病病毒)；纤丝病毒科(例如，埃波拉病毒)；副粘液 病毒科(例如，副流感病毒，腮腺炎病毒，麻疹病毒，呼吸道合胞病毒)； 正粘病毒科(例如流感病毒)；布尼亚病毒科(例如，汉坦病毒，bunga病 毒，白蛉病毒和Nairo病毒)；沙粒病毒科(出血热病毒)；呼肠孤病毒科 (例如，呼肠病毒，环状病毒和轮状病毒)；双RNA病毒科；嗜肝DNA 病毒科(乙型肝炎病毒)；细小DNA病毒科(细小病毒)；乳多空病毒科 (乳头状瘤病毒，多瘤病毒)；腺病毒科(大多数腺病毒)；疱疹病毒科(单 纯疱疹病毒(HSV)1和2，水痘带状疱疹病毒，巨细胞病毒(CMV)，疱 疹病毒)；痘病毒科(天花病毒，牛痘病毒，痘病毒)和虹膜病毒科(例 如非洲猪瘟病毒)和未分类的病毒(例如，海绵状脑病的病原体，δ肝 炎的致病因子(认为是乙型肝炎病毒的有缺陷伴随体)，非甲型、非乙型 肝炎的致病因子(1级＝在内部传递；2级＝肠胃外地传递(即，丙型肝炎)； 诺瓦克和有关的病毒和星状病毒)。

病毒攻击——流感病毒H1N1感染

通过IP注射α-GalCer类似物进行治疗

图58显示了流感病毒H1N1感染后0-12天的小鼠存活。用2μg α-GalCer(C1)或α-GalCer类似物C2、C3、C9、C11、C13、C14和C16 处理小鼠(IP注射)，并与对照DMSO相对比。测试了3个不同的治疗方 案。图58A显示了在H1N1病毒攻击后30分钟开始处理BALB/c小鼠的 存活率。相对于对照的P值是：C1：0.4554，C2：0.5149，C3：0.5764， C9：0.5466，C110.2031，C16：0.0359。图58B显示了在H1N1(WSN)病 毒攻击之前2周开始处理BALB/c小鼠的存活率。在第-14天、-10天、 -3天、0.5小时、2天、4天、6天8天10天和12天，用2μg(IP注射) 对照、α-GalCer(C1)或α-GalCer类似物处理小鼠。当在病毒攻击之前2 周开始处理并每周施用2次时，对于所有测试的类似物(C9、C11、C13 和C14)，α-GalCer类似物处理过的小鼠表现出显著增加的存活。相对于 对照的P值是：C1：0.000116，C9：0.000126，C11：0.02627，C13： 0.000027，和C14：0.000147。图59显示了用更高剂量的流感病毒H1N1 感染的小鼠的存活累积比例。在图59A中，在H1N1(WSN)病毒攻击 之前2周，开始处理BALB/c小鼠。在第-14天、-10天、-3天、0.5h、 2天、4天和6天，用2μg(IP注射)对照、α-GalCer(C1)或α-GalCer类 似物处理小鼠。第1组是对照组。用α-GalCer(C1)处理第6组。用α-GalCer 类似物C13处理第7组。用α-GalCer类似物C14处理第8组。用α-GalCer 类似物C16处理第9组。α-GalCer类似物C16表现出延长的存活，指示 C16具有直接的抗病毒作用。

通过鼻内施用α-GalCer类似物进行治疗

图59B显示了用H1N1感染的小鼠的存活累积比例。在H1N1(WSN) 病毒攻击之前1小时，通过鼻内途径，用对照、α-GalCer(C1)或α-GalCer 类似物C13、C14或C16处理BALB/c小鼠。C13表现出延长的存活， 指示直接的抗病毒作用。一般而言，某些α-GalCer类似物可能发挥直接 的抗病毒作用，或通过免疫刺激间接起作用。图60显示了Madin-Darby 犬肾(MDCK)细胞的体外细胞病变效应(CPE)。用载体、α-GalCer或 α-GalCer类似物C13、C14或C16之一，以10μg/ml预处理MDCK细 胞4小时，然后以10TCID₅₀的FLU-A病毒血清型H1N1(WSN)感染。 在感染后48小时，测定MDCK细胞中的病毒效价(右图)。α-GalCer以 及3种测试的α-GalCer类似物在体外表现出H1N1病毒的进入/复制的轻 微抑制。

抗细菌作用

自从二十世纪四十年代将青霉素引入临床应用以来，抗细菌剂已经 挽救了数百万生命。但是，抗菌剂耐药性的日益延长的阴影威胁着返回 到抗生素前时期。诸如α-GalCer等合成糖脂和天然的细菌糖脂被证实是 活化NKT细胞并促进宿主的抗细菌功能的CD1-d配体。记载了 α-GalCer的抗细菌活性可用于改善结核分枝杆菌感染、清除铜绿假单孢 菌的肺感染。通过糖脂对NKT细胞的活化，在小鼠中也减弱了荚膜鞘 氨醇单胞菌和鼠埃立克体(Ehrlichia muris)的感染。

希望刺激针对它们的保护性免疫应答(可通过本公开内容的方法来 实现，或利用本公开内容的NKT、疫苗或组合物)的传染性细菌的实例 包括但不限于：幽门螺杆菌、伯氏疏螺旋体、嗜肺军团菌、肺炎克雷伯 菌、分枝杆菌属的种(例如结核分枝杆菌、鸟分枝杆菌、细胞内分枝杆 菌、堪萨斯分枝杆菌(M.kansaii)、戈登分枝杆菌(M.gordonae))、 金黄色葡萄球菌、淋病奈瑟球菌、脑膜炎奈瑟球菌、单核细胞增生李斯 特菌、酿脓链球菌(A群链球菌)、无乳链球菌(B群链球菌)、链球菌属(草 绿色链球菌组)、粪链球菌、牛链球菌、链球菌属(厌氧种)、肺炎链球菌、 病原性弯曲杆菌属的种、肠球菌属的种、衣原体属的种、流感嗜血杆菌、 炭疽芽孢杆菌、白喉棒杆菌、棒杆菌属的种、猪红斑丹毒丝菌、产气荚 膜梭菌、破伤风梭菌、产气肠杆菌、肺炎克雷伯菌、多杀巴斯德菌、拟 杆菌属的种、具核梭杆菌、念珠状链杆菌、苍白密螺旋体、细弱密螺旋 体、钩端螺旋体属的种、衣氏放线菌、荚膜鞘氨醇单胞菌和土拉热弗朗 西丝菌。

增强的细菌清除——荚膜鞘氨醇单胞菌感染的小鼠

荚膜鞘氨醇单胞菌是在许多地方(诸如空气和水)发现的普通环境 细菌株。因为它的黄色菌落颜色，在营养琼脂平板上可以容易地鉴别它。 不同于大多数革兰氏阴性细菌，荚膜鞘氨醇单胞菌不含有脂多糖(LPS)， 所述脂多糖被动物用于活化宿主抗细菌活性。由于通过糖脂结合的 -CD1-d分子对NKT细胞的活化来介导糖脂抗原的抗细菌活性，使用荚 膜鞘氨醇单胞菌感染的疾病模型来评价抗细菌效力将聚焦于糖脂结合 对活化的NKT介导的途径的影响。给6-8周龄雌性C57BL/6小鼠IP注 射荚膜鞘氨醇单胞菌细胞。感染后4小时，给小鼠IP注射对照、50或 100μg/kg的α-GalCer(C1)或α-GalCer类似物(C3、C9、C11、C14、C16 或C17)。细菌感染后24小时，从小鼠取出肝，并匀浆化。通过在营养 平板上涂布稀释的样品，测定肝匀浆中荚膜鞘氨醇单胞菌的菌落形成单 位(CFU)。在37℃温育48小时后，计数菌落。图61A表明，在细菌感 染后24小时，用100μg/kg的α-GalCer和C11、C14和C16处理的组的 CFU数显著低于对照组。为了证实这些α-GalCer类似物的抗细菌效力， 通过在相同的疾病模型中用50μg/kg处理受感染的小鼠，进行另一个研 究来重复该研究。图61B表明，与未处理组相比，用C11、C14、C16 和C15处理的小鼠的抗细菌效力是显著的。在3个有效组(C1、C11和 C15)中，每克肝的CFU的值的差异不是统计上显著的。图63表明， 与未处理组相比，用50μg/kg的C23和C34处理的组的CFU数(在肺中) 是显著的。在用C23和C34处理小鼠后，在肝中的CFU数发现了类似 的结果。

增强的细菌清除——肺炎克雷伯菌感染的小鼠

肺炎克雷伯氏菌是造成肝脓肿的革兰氏阴性细菌，且在台湾的糖尿 病患者中正在变成严重的疾病。图62表明，在注射后，C1和C14可以 显著减少小鼠肺和肝中的细菌负荷。通过经口管饲法，给BALB/cByl 雌性小鼠施用单次剂量的活肺炎克雷伯氏菌。在细菌感染后4和8小时， 给小鼠注射对照、α-GalCer或α-GalCer类似物C14，以100μg/kg注射2 次。在感染后24小时，从每只小鼠收集肝和肺，并匀浆化。如上所述 类似地测定细菌数。

发现C14的细菌清除程度大于C1的清除，如图62所示。

抗真菌作用

T辅助细胞1型(T_H1)细胞-介导的免疫在针对不同的传染性真菌的 保护中起关键作用。在另一个方面，本公开内容的α-GalCer类似物可以 用于抗真菌治疗中。抗真菌药物被用于治疗由真菌造成的感染，和预防 具有减弱的免疫系统的患者中真菌感染的发展。真菌感染已经变为促成 免疫抑制的患者的发病率和死亡率的主要因素之一。

抗真菌病的先天宿主防御是基于吞噬细胞(PMNL和巨噬细胞)的作 用；这些细胞的数目和功能可以由集落刺激因子(CSF)调节。另一方面， 获得性防御包括细胞和体液免疫，其需要抗原呈递细胞、T淋巴细胞、 B淋巴细胞和NK之间的相互作用，这由诸如IL-2和IFN-γ等细胞因子 驱动和调节。通过细胞因子活化免疫在抗机会性真菌的宿主防御中的潜 在重要性已经成为几项研究的主题，且已经引起一些关于念珠菌和曲霉 菌感染的新颖抗真菌策略的令人感兴趣的问题。已经描述了细胞因子的 不同的潜在作用。首先，暴露于真菌和它们的抗原可以诱导IL-2、IFN-γ、 肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、粒细胞集落刺激因子(G-CSF)和粒细胞巨噬 细胞集落刺激因子(GM-CSF)的释放。这些细胞因子又可以活化或增强 吞噬细胞对念珠菌和曲霉菌物种的抗真菌功能。

希望刺激针对它们的保护性免疫应答(可通过施用单独的或与抗真 菌药物组合的本公开内容的α-GalCer类似物来实现)的传染性真菌的实 例包括但不限于：新型隐球菌、荚膜组织胞浆菌、粗球孢子菌、皮炎芽 生菌、沙眼衣原体、白色假丝酵母菌。其它传染性生物(即，原生生物) 包括：疟原虫属的种、利什曼原虫属的种、血吸虫属的种和弓形虫属的 种。

合成的α-半乳糖基神经酰胺类似物在鼠疾病模型中抑制细菌和病 毒感染

通过识别呈递到CD1-d分子上的脂类和糖脂抗原，天然杀伤T细 胞促成许多免疫过程。CD1-d是主要组织相容性复合体I类样的蛋白， 且在大多数单核细胞、巨噬细胞、树突细胞、B细胞、以及非淋巴细胞 中表达。通过Th1和Th2型细胞因子(诸如IFN-γ和IL-4)的产生，CD1-d 将糖脂抗原呈递给参与宿主先天防御系统的CD1d-限制的T细胞(或 NKT细胞)。在多种结合CD1-d的配体中，最充分地研究的配体是α-半 乳糖基神经酰胺(α-GalCer)，其是合成的、结构优化的α-连接的鞘糖脂 (来自海洋海绵：海绵体)。合成的糖脂诸如α-半乳糖基神经酰胺 (α-GalCer)和天然的细菌糖脂被报道为活化NKT细胞的CD1-d配体。用 α-GalCer处理的小鼠发动多种感染的保护。合成了许多α-GalCer类似物。 经证实，它们的免疫调节活性与结合CD1-d有关。使用CD1-d阵列结合 的最新研究确认，NKT细胞对IFN-γ和IL-4的分泌，由α-GalCer类似 物对CD1-d结合袋的结合常数决定，且分泌的Th1和Th2细胞因子的比 例是这些分子的免疫调节性质的决定因素之一。

使用几个鼠传染病模型，测定了一些合成的糖脂保护细菌和病毒感 染的效力。在所有测试的合成的α-GalCer类似物中，4-(4-氟苯氧基)苯 基辛酰基修饰的α-GalCer(C34)在鼠模型的细菌和病毒感染保护中是最 有活性的。当以预防的方式或在感染后短时间内施用时，C34的保护作 用是最有效的。

使用荚膜鞘氨醇单胞菌感染的小鼠来研究α-GalCer类似物的抗细 菌效力

将荚膜鞘氨醇单胞菌感染的小鼠用作感染模型，以评价一些合成的 糖脂的抗细菌效力。荚膜鞘氨醇单胞菌是在许多地方(诸如空气和水) 发现的普通环境细菌株。因为它的黄色菌落颜色，在营养琼脂平板上可 以容易地鉴别它。不同于大多数革兰氏阴性细菌，荚膜鞘氨醇单胞菌不 含有脂多糖(LPS)，所述脂多糖被动物用于活化宿主抗细菌活性。由于通 过糖脂结合的-CD1-d分子对NKT细胞的活化来介导糖脂的抗细菌活 性，使用荚膜鞘氨醇单胞菌感染的疾病模型来评价抗细菌效力将聚焦于 糖脂结合活化NKT介导的途径的影响。图65表明，在细菌感染后24 小时用100μg/kg C1、C11、C14或C16处理的组的CFU数显著低于对 照组。相反，与在对照组的小鼠中发现的CFU相比，用C3、C9和C17 处理的组的CFU差异不是显著的。进行了这些糖脂的额外的抗细菌效力 研究，在相同的疾病模型中用50μg/kg糖脂处理感染的小鼠。在用C1、 C11、C14和C16处理的小鼠的肝中，也观察到了与未处理组相比显著 减少的CFU值(数据未显示)。在体内抑制荚膜鞘氨醇单胞菌方面， α-GalCer看起来比C11、C14和C16更有效；尽管差异不是显著的。

认为Th1细胞因子的产生与糖脂的抗肿瘤、抗细菌和抗病毒作用相 关联，而认为诱导Th2细胞因子的能力与某些自身免疫病(诸如1型糖 尿病)的改善相关联。最近合成了许多α-GalCer类似物，并在体外或在 体内表征了它们的细胞因子诱导特性。研究了α-GalCer和已知在NKT 细胞中诱导更高水平的IFN-γ分泌的3种类似物(7DW8-5、C23和C34) 的抗细菌和抗病毒性质。首先使用在C57/b小鼠中的荚膜鞘氨醇单胞菌 感染模型，评价了这4种糖脂。图72的表表明，与载体处理过的小鼠 相比，50μg/kg的所有4种糖脂都能在更大程度上抑制荚膜鞘氨醇单胞 菌感染，p值小于0.001。但是，在4种糖脂中，它们在荚膜鞘氨醇单胞 菌感染模型中的效力不是显著不同的。

使用发光金黄色葡萄球菌(Xen29)研究α-GalCer类似物在大腿伤口 小鼠模型中的抗细菌活性

给C57/B小鼠腹膜内注射荚膜鞘氨醇单胞菌经常导致暂时感染，且 在感染后24小时用糖脂处理会加速清除。但是，在没有任何处理的情 况下，感染经常会在2-3天内清除。为了评价α-GalCer类似物的抗细菌 效力，使用更有关的小鼠深大腿伤口的疾病模型，在小鼠后大腿肌肉处 注射发光金黄色葡萄球菌Xen29。通过对活小鼠的图像分析，可以监测 金黄色葡萄球菌Xen29感染，以在抗细菌研究中减少实验小鼠的数目， 并允许重复检查感染的程度。图66(A-B)表明：用α-GalCer和它的类似 物处理大腿肌肉感染的小鼠导致大多数处理的小鼠感染的深度清除；但 是，仅在接受C34的组中，观察到与载体处理组相比统计上显著的差异 (p＜0.01)。因而该结果表明，C34处理可能具有有益于该疾病模型中的 细菌清除的高可能性。

使用日本脑炎病毒(JEV)感染动物模型进行α-GalCer类似物的抗 病毒评价

为了测定糖脂是否会引起抗日本脑炎病毒(JEV)感染的保护性免 疫，使用了双剂量方案，其中在病毒攻击之前1天和之后1天，给小鼠 施用糖脂。与溶剂对照相比，原型糖脂αGalCer(C1)和糖脂衍生物C23 使小鼠存活从21％增加到57％(图67)。此外，在接受诸如C34和7DW8-5 等糖脂的小鼠中，保护作用甚至更深远，存活率分别是64％和71％(图 67)。这些结果强烈地证实糖脂-刺激的NKT细胞可能促进抗JEV感染的 宿主防御。类似地，也发现有效地保护JEV感染的那些类似物会延长流 感感染的Balb/C小鼠的存活(数据未显示)。为了进一步分析对糖脂-介导 的免疫保护的需要，进行实验来测定在某些免疫缺陷的小鼠中是否仍然 观察到C34和7DW8-5的有益作用。显然，这些糖脂触发抗JEV的保护 性免疫需要先天性和适应性免疫组分，因为在缺乏Stat-1、免疫球蛋白 μ-链或CD8α-链的小鼠中没有观察到有益作用(图68(A-C))。

以预防方式施用的α-GalCer类似物的抗感染活性最有效

进行评估来测定如果在病毒感染后施用这些糖脂，它们是否会产生 保护性免疫。除了上述的双剂量方案以外，也测试了几个单剂量方案。 与双剂量方案相比，在病毒感染之前1天或当天施用仅1次的糖脂C34 和7DW8-5引起了更弱的保护作用(图69(A-B))。但是，如果在病毒感 染之后1天施用糖脂，没有观察到抗JEV攻击的保护(图69(A-B))，表 明糖脂-介导的免疫调节是感染时间依赖性的事件。还在流感感染的 Balb/C小鼠中，评价了C34施用时间相对于病毒感染时间的影响。在流 感感染之前1天施用C34最有益于小鼠存活(P值＜0.0001)。在流感感 染之前1天和之后1天施用的2次剂量的C34的处理也比载体处理组显 著延长存活(P值＝0.0002)。类似于JEV感染，在流感感染之后1天施用 的单次剂量的C34无益于存活(图7)。也研究了C34施用时间对金黄色 葡萄球菌大腿感染模型中的细菌清除的作用。当在感染后48小时检查 小鼠感染时，在引入大腿感染后立即施用C34的小鼠组中的细菌清除是 最具深度的。对于在大腿感染后6小时接受C34的组，观察到细菌清除 的提高，但是与载体处理组的差异不是显著的(图71)。当在感染后72 小时检查时，观察到类似的细菌清除特性(数据未显示)。

使用细菌和病毒感染鼠模型来评价几种α-GalCer类似物的感染抑 制效力，并发现，4-(4-氟苯氧基)苯基辛酰基修饰的α-GalCer(C34)在 我们的模型中最有效。以前的研究表明，α-GalCer处理伴有有害的副作 用，且处理效力受到多种参数的影响。天然杀伤(NKT)细胞象微生物活 化的树突细胞产生的细胞因子一样好地对感染有关的糖脂刺激做出响 应。因而，在接受糖脂和感染攻击的实验小鼠中，预见到对鼠免疫系统 的复杂的刺激。在流感感染的、α-GalCer-处理的、或流感感染的且 α-GalCer-处理的小鼠中，记录了细胞因子应答。在许多双重刺激的小鼠 中，发现了更大的血清细胞因子。但是，特性是复杂的，并在不同的观 察时间变化。

发现α-GalCer在抗脂多糖-诱导的休克的保护中的效力取决于施用 时间，同时糖脂需要在LPS攻击之前或之后2h内施用。我们使用细菌 和病毒感染模型的体内研究也证实当在感染之前或之后短时间内施用 时，C34最有效地抑制感染。感染导致具有不同动力学的不同免疫刺激， 它们与疾病进展密切相关。可以想象对于抗感染的保护，需要精确地调 节糖脂的剂量和施用时间将是有益的。

自身免疫病的免疫疗法

自身免疫性源自免疫系统调节的破坏，导致针对自身抗原和组织的 炎症应答。在美国，自身免疫病是排在癌症和心脏病之后的第三类最常 见的疾病类别；它们影响大约5％-8％的人口或1400-2200万人。包含T 淋巴细胞对自身抗原的破坏的自身免疫病包括但不限于，多发性硬化、 胰岛素依赖性的糖尿病和类风湿性关节炎。

根据现在的理论，诸如心肌炎等炎性自身免疫病主要归因于T_H1应 答(其中IFN-γ作为原型细胞因子)、T_H2应答(其中认为IL-4支配减 少自身免疫)。因为可以设计本公开内容的α-GalCer类似物，从而启动 T_H2-偏移的免疫原应答，这些α-GalCer类似物可以用作自身免疫病的免 疫疗法。

α-GalCer类似物的佐剂活性

α-GalCer类似物对肌肉内施用的pCHA5疫苗的佐剂活性

以前已经证实，通过电穿孔/肌肉内(EP/IM)途径用30μg pCHA5免 疫小鼠会诱导高抗HA抗体效价，并赋予对NIBRG-14病毒的致死攻击 的100％保护。使用通过EP/IM递送的高剂量pCHA5，糖脂的加入不 会进一步增强免疫应答。因此，测试了糖脂对通过肌肉内途径(替代 EP/IM)递送的pCHA5疫苗的佐剂效应。使用或不使用2μg糖脂(C1、 C23、C26、C34和7DW8-5)，给小鼠肌肉内注射30μg pCHA5，并在2 周后仅用pCHA5加强。收集血清，并在第二次疫苗接种后2周用 NIBRG-14病毒攻击小鼠。在仅pCHA5的小鼠中，观察到显著的抗HA- 特异性的IgG抗体，而在接受pVAX的小鼠中没有检查到。与仅pCHA5 组相比(16180±5261)，在接受C1(24250±3206)或C34(23622±5516) 作为佐剂的组中，来自小鼠的血清表现出稍微更高的抗体效价，在C23 (14538±3223)和C26(16350±2193)组中的水平类似(图73A)。在病毒 攻击后，接受pVAX载体的小鼠都没有存活，但是接受C1、C23、C26、 C34作为佐剂的所有小鼠存活。尽管仅pCHA5组的存活(80％)不如糖脂 -佐剂化的组好，但是存活的差异不是统计上显著的(图73B)。因此，在 该方案中没有清楚地描绘这些糖脂的佐剂效应。但是，尚未评价疫苗递 送的肌肉内注射途径。

接着，评价了糖脂对通过肌肉内注射递送的单次剂量的pCHA5的 佐剂效应。给小鼠肌肉内接种单剂量的50微克pCHA5(含有/不含有糖 脂或Alum)。3周后，收集血清，并用NIBRG-14病毒攻击小鼠。在pCHA5 (3692±897.5)接种的小鼠中，观察到HA特异性的抗体应答的诱导，加 入的铝(transditional alum)(2192±547.5)佐剂没有显示出更好的作用。 但是，在糖脂佐剂C34(7208±1482)处理的组中观察到增加的效价(图 74A)。类似地，在糖脂作为佐剂存在下，检测到通过功能性IFN-γ ELISPOT分析测得的增强的细胞免疫(图74B)。pCHA5中的IFN-γ分 泌细胞是29.5±0.5/2x10⁵个细胞，并在糖脂佐剂化的组中显著增加(p ＜0.05)，诸如66.33±5.3(在C1中)、176.7±2.3(在C34中)、69.17 ±1.5(在7DW8-5中)、和68.56±8.72(在铝中)。在用致死量的NIBRG-14 病毒攻击后，对照(pVAX)中的动物没有存活，仅pCHA5的组中有20％ 存活。使用佐剂的小鼠的存活率是40％(对于C1和7DW8-5组)、60％ (对于C34)和0％(对于铝)。铝和糖脂佐剂组之间的存活差异是统 计上显著的(P＜0.05)(图74C)。总之，糖脂可以增强HA-特异性的抗体 效价，增加IFN-γ生产细胞的数目，并提高H5N1病毒致死攻击后的存 活。

α-GalCer类似物对pCHA5-II疫苗的佐剂活性

因为在2年前从467个H5N1病毒株衍生出pCHA5DNA共有序列， 它可能过时。收集了1192个全长HA序列，并得到一个新的共有的HA 序列，称作pCHA5-II。与pCHA5相比，在pCHA5-II中存在5个突变残 基。对比了糖脂在这2个共有的HA DNA疫苗中的佐剂效应。在有/没 有糖脂作为佐剂存在下，小鼠组接受EP/IM注射30微克pCHA5或 pCHA5-II。以3周间隔，小鼠接受2次疫苗接种，并在最后一次免疫后 2周收集血清。通过ELISA测试了抗HA抗体效价，且在使用或不使用 糖脂作为佐剂时，在pCHA5和pCHA5-II之间没有观察到显著差异(图 75A)。但是，当用高度致病的野生型H5N1流感病毒(E319)攻击时，在 pCHA5和pCHA5-II之间存在显著差异。无论加入何种糖脂作为佐剂， 由pCHA5赋予的保护不是显著的(图75B)。在仅pCHA5的组中没有小 鼠存活，而在7DW8-5和C34佐剂化的组中，分别有约10％和约20％ 的小鼠存活。在pCHA5-II接种的组中，C34和7DW8-5糖脂分别使存 活率从约20％增加至约50％和约40％(图75C)。总之，尽管pCHA5和 pCHA5-II(使用或不使用糖脂)之间的抗体效价是类似的，pCHA5-II 赋予比pCHA5更好的保护，并且糖脂佐剂增强了pCHA5-II的保护能力。

此外，在某些实施方案中，在某些条件下评价了最佳剂量，并表明 在某些条件下作为一次性疫苗接种通过IM递送的pCHA5-II和C34的剂 量是最佳的。在确定用于pCHA5-II/C34疫苗的制剂中，使用了不同剂 量的pCHA5-II(50、75和100μg)和C34(0.5、1、2和4μg)。在疫苗接 种后3周，收集血清，并通过ELISA测试抗HA抗体效价。在pCHA5-II 处理的组中，仅检测到弱抗HA抗体，没有观察到明显的剂量效应。通 过加入2μg C34作为佐剂，使抗HA应答增强到约8-9倍。在100μg pCHA5-II，0.5和2μg C34引起比1和4μg更高的抗体效价(图76A)(p ＜0.01)。此外，在功能性IFN-γ分泌ELISPOT检验中，与50(31.33±11.95) 或75μg(40±3.67)的pCHA5-II相比(p＜0.01)，100μg pCHA5-II诱导 更大数目的IFN-γ产生细胞(136.5±11.26)。通过加入C34作为佐剂，增 加了这样的细胞-介导的免疫应答。在1μg(151.2±22.58)和4μg(146.5± 19.41)的C34佐剂化的组中的IFN-γ分泌细胞比0.5μg(106.7±19.31) 和2μg(95.56±10.06)的C34组更好，但是差异不是统计上显著的(图 76B)。在用致死量NIBRG-14鼻内攻击后，在保护小鼠对抗病毒攻击中 证实了pCHA5-II的剂量效应。在pCHA5-II组中，小鼠的存活率从10％ (50μg)增加至40％(75μg)和70％(100μg)。此外，将2μg C34加入50μg 和75μg pCHA5-II组可以分别使小鼠的存活率从10％增加至100％和从 40％增加至100％(图76C)。尽管在0.5μg(80％)和2μg(75％)C34中， 小鼠的存活率不好，但是基于这些检验，在实验条件下，差异没有表现 出统计上的显著性(图76D)。将1μg C34作为佐剂加入100μg pCHA5-II， 使小鼠的存活率从70％增加至100％。这些数据表明在一次性疫苗接种 方案中，50μg pCHA5-II和2μg C34可以提供良好的抗病毒攻击的保护。 为了确保保护作用，在某些实施方案中，约100μg pCHA5-II和约1-2μg C34看起来会提供安全的制剂。

为了研究用pCHA5(含有/不含有C34)免疫的小鼠中的抗血清的 交叉中和能力，使用了亚适剂量的pCHA5，并应用相同的疫苗接种方案。 在最后一次疫苗接种后2周，采集小鼠血清，并通过HA-假型病毒中和 试验进行评估。从进化枝1(VN1194)、2.1(ID05)、2.2(TK05)和2.3.4 (AnhuiO5)选择了4株H5N1流感病毒。将不同的HA-假型病毒与来自对 照、仅pCHA5和用C34佐剂化的pCHA5的小鼠的抗血清一起温育。 通过萤光素酶活性测量中和效价，并将数据报告为产生50％的HA-假型 病毒中和时的血清稀释度(ID₅₀)。如通过ID₅₀证实的(图77)，仅pCHA5 组的抗血清表现出比pVAX组(分别ID₅₀＝0.0277和0.02668)更大的针对 VN1194(ID₅₀＝0.005862)和TK05(ID₅₀＝0.005953)HA-假型病毒的中和 抗体。此外，显著增加了C34佐剂化的组对VN1194(ID₅₀＝0.00408) 和TK(ID₅₀＝0.003054)的中和效力。在pVAX和pCHA5(含有/不含有 C34)组之间没有观察到对ID05和Anhui05HA-假型病毒中和的差异。 这些结果表明在某些实施方案中，C34作为佐剂可以起增加亚适量 pCHA5疫苗对不同病毒株的中和能力的作用。

通过IM/EP途径的C34的佐剂效应的机理仍然不明。为了研究C34 的佐剂效应的机理，在加强后0小时和20小时收集血清，并通过luminex 测定细胞因子。分析表明(图78)在pCHA5(含有或不含C34佐剂)组中 发现了非常低至不可检出水平的IL-1α、IL-3、IL-4、IL-6、IL-10、IL-12p70、 IL-15和TNF-α。在C34佐剂化的组中，IFN-γ、G-CSF、IL-5、IL-17、 KC、MIP-1β和RANTES的血清水平在加强后显著增加。此外，发现与 仅pCHA5组相比，C34佐剂化的组中的IL-2、IL-5、IL-12p40、IL-13、 IL-17、IFN-γ、MIP-1α、MIP-1β、KC、RNATES和G-CSF明显更高。 另外，与仅pCHA5组相比，在含有C34的pCHA5组中发现了降低的 IL-1β水平。数据证实，在某些示例性的实施方案中，C34的佐剂效应与 促炎症细胞因子、T辅助I型和II型细胞因子和参与细胞增殖和趋化性 的趋化因子的更高产生相关联。

也测试了用pCHA5-II(含有/不含有C34)免疫的小鼠中的抗血清 的交叉中和能力，其中使用50μg pCHA5，并应用仅单次疫苗接种。在 疫苗接种后3周，采集小鼠血清，并通过HA-假型病毒中和试验进行评 估。使用了4株H5N1流感病毒，并测定了来自对照、仅pCHA5-II和用 C34佐剂化的pCHA5-II的小鼠的抗血清。数据显示在图79中，与pVAX 组(ID₅₀＝0.144)相比，仅pCHA5-II组的抗血清表现出更大的针对TK05 (ID₅₀＝0.05376)HA-假型病毒的中和抗体。不同于仅pCHA5-II组，C34 佐剂化的组针对VN1194(0.003)、TK05(0.004)、Anhui05(0.0027)和ID05 (0.002)的中和效力(ID₅₀)显著增加。总之，这些结果表明C34佐剂不仅 增加中和效价，而且可以起扩宽针对的不同病毒的范围的作用。

实施例

α-GalCer的糖脂类似物、试剂和小鼠

通过以前在下述文献中描述的技术，合成了α-GalCer(C1)和本公开 内容的合成的α-GalCer类似物，并通过柱色谱法纯化：Fujio等人(2006) J.Am.Chem.Soc.128：9022-9023；Xing等人(2005)Bioorg.Med.Chem. 13：2907-2916；Kinjo等人(2005)Nature 434：520-525；Wu等人(2006) Natl.Acad.Sci.U.S.A 103：3972-3977；和Wu等人(2005)Proc.Natl. Acad.Sci.U.S.A 102：1351-1356；其中各个于此通过引用并入本文。

基于它们的化学结构，将图2所示的本公开内容的合成的α-GalCer 类似物分成4组。第I组：C2、C3和C14属于细菌起源，第II组：C4、 C5和C9含有与神经酰胺的O-连接的硫修饰(C4)或在半乳糖部分的 3”-OH处的硫酸盐基团(C5、C9)，第III组：C6-C8、C8-5、C8-6、C10-C11、 C15-C16和C18-C34，它们的酰基尾被芳族环修饰，和第IV组：C12、 C13和C17含有截短的植物鞘氨醇。在这些新的类似物中，C10、C11、 C16、C27、C28、C29在不同长度的脂肪酰胺链中被苯基(Ph)修饰；C18、 C22在苯基环处被甲氧基(-OMe)修饰；C19、C23、7DW8-5在苯基环 处被氟化物基团(-F)修饰；C20、C24、7DW8-6在苯基环处被三氟甲基 (-CF3)修饰；C21、C25、C26在苯基环处被苯基(-Ph)修饰；C34在苯基 环处被1′-氧-4′-氟苯基(O-Ph-F)修饰。但是，用氧-氟苯基 (其中F基在非对位)或二氟、三氟、四氟和五氟苯基之一取代在苯基 环处的对-氧-氟苯基(1′-氧-4′-氟苯基)，也可以产生有用的性质；且C17 含有截短的植物鞘氨醇。

在线路图1中总结了鞘糖脂化合物C12和C13的合成(图3)。下 面描述了这些化合物的鉴定数据。

化合物C13(批号MFJ3-017-1)：¹H NMR(500MHz，CDCl₃-MeOH 4∶1) δ：7.26(m，2H)，7.23-7.19(m，2H)，7.18-7.14(m，1H)，4.90(d，J＝3.9Hz， 1H)，4.24-4.19(m，1H)，3.86(dd，J＝10.8，5.2Hz，1H)，3.82-3.62(m，7H)， 3.58-3.53(m，2H)，2.92-2.84(m，1H)，2.67(ddd，J＝13.7，9.3，7.5Hz，1H)， 2.16(m，2H)，2.06-1.98(m，1H)，1.74-1.65(m，1H)，1.62-1.53(m，2H)， 1.33-1.19(m，44H)，0.88(t，J＝7.0Hz，3H)。¹³C NMR(125MHz， CDCl₃-MeOH 4∶1)δ：174.06，141.93，128.25，128.01，125.43，99.48，74.60， 70.75，70.44，69.99，69.52，68.66，67.03，61.69，50.15，50.06，36.27，34.13， 31.67，31.59，29.43，29.31，29.15，29.09，25.55，22.41，17.60，13.76。 C₄₄H₈₀NO₉⁺[M+H]⁺的HRMS(ESI-TOF)计算值766.5827，实测值 766.5813。

化合物C12(批号MFJ3-018-1)：¹H NMR(400MHz，CDCl₃-MeOH 4∶1) δ：7.26(m，2H)，7.19-7.13(m，3H)，4.91(d，J＝3.8Hz，1H)，4.20(q，J＝ 4.4Hz，1H)，3.95-3.85(m，2H)，3.83-3.61(m，6H)，3.59-3.50(m，2H)，2.63 (t，J＝7.5Hz，2H)，2.20(t，J＝7.5Hz，2H)，1.78-1.54(m，6H)，1.47-1.17(m， 46H)，0.89(t，J＝6.9Hz，3H)。¹³C NMR(100MHz，CDCl₃-MeOH 4∶1)δ： 174.16，142.27，127.91，127.77，125.14，99.33，74.28，71.38，70.42，69.86， 69.33，68.51，66.84，61.40，50.02，36.04，35.52，31.93，31.51，31.21，29.26， 29.14，28.99，28.94，25.47，25.08，22.25，13.51。C₄₆H₈₄NO₉⁺[M+H]⁺的 HRMS(ESI-TOF)计算值794.6140，实测值794.6129。

最初，将所有合成的α-GalCer类似物溶于100％DMSO中，浓度为 1-2mg/ml。对于体内实验，在即将注射进小鼠中之前，在盐水中稀释合 成的α-GalCer类似物至20或1μg/ml。从National Laboratory Animal Center，Taipei，Taiwan·得到6-10周龄的无病原体的BALB/c(野生型或 CD1d敲除的)和C57BL/6雌性小鼠。分别从Jackson实验室 (C.129S2-CD1tm1Gru/J，U.S)得到CD1d-缺陷的BALB/c和C57BL/6，并 由Steve R.Roffler博士(Academia Sinica，Taiwan)提供。所有小鼠维持 在无病原体的动物设施中。

在线路图2中总结了鞘糖脂化合物C34的合成(图80)。从D-来苏 糖合成了植物鞘氨醇衍生物。在酸存在下，用2-甲氧基丙烯选择性地保 护D-来苏糖的2，3-二羟基，得到丙酮化合物中间体，然后使该中间体的 伯羟基处于三苯甲基氯和碱性条件下，得到三苯甲基醚。然后进行Wittig 烯化作用，随后中间体在六甲基二硅基氨基锂(LHMDS)存在下与 C₁₃H₂₇⁺PPh₃^-Br反应，产生烯烃，通过¹H NMR光谱测定法表征具有2∶1 的E/Z比。在不饱和的烯烃中间体的催化氢化后，得到烷烃，用三氟甲 基磺酸酐和2，6-二甲基吡啶活化羟基，得到三氟甲基磺酸酯中间体。三 氟甲基磺酸酯中间体与四甲基胍叠氮化物(TMGA)进行S_N2反应，得到 具有反向构型的叠氮基化合物。使用三氟醋酸(TFA)，选择性地去除 C1的三苯甲基。

使用三氟甲磺酸酐(Tf₂O)和二甲硫(Me₂S)作为促进剂，进行供体- 半乳糖衍生物和受体植物鞘氨醇的糖基化，得到关键的中间体。然后， 使用Staudinger反应，还原该关键中间体的叠氮基，得到胺中间体。使 用EDC和HBTU，用新鲜制备的脂肪酸偶联该胺，然后完全去保护，得 到化合物C34。

下面描述了该化合物的鉴定数据。

化合物C34：¹H NMR(600MHz，吡啶-d⁵)δ：8.53(d，J＝8.6Hz，1H)， 7.27(d，J＝8.4Hz，2H)，7.14(t，J＝8.4Hz，2H)，7.05-7.09(m，4H)，5.59(d， J＝3.8Hz，1H)，5.27(m，1H)，4.70-4.65(m，2H)，4.55(d，J＝2.6Hz，1H)， 4.52(t，J＝6.0Hz，1H)，4.45-4.39(m，4H)，4.35-4.30(m，1H)，2.59(t，J＝ 7.6Hz，2H)，2.45(t，2H)，2.30(m，1H)，1.91(m，2H)，1.81(m，2H)，1.68 (m，2H)，1.59(m，2H)，1.47-1.15(m，42H)，0.87(t，J＝6.9Hz，3H)。¹³C NMR(150MHz，吡啶-d⁵)δ：173.79，160.19，158.60，156.32，154.53， 138.89，130.73，123.65，121.06，121.01，119.46，117.25，117.09，102.00， 77.17，73.53，72.96，72.09，71.46，71.29，70.79，69.07，63.12，51.95，37.27， 35.86，34.82，32.60，32.47，30.84，30.63，30.48，30.41，30.35，30.28，30.25， 30.20，30.10，30.03，26.99，26.87，23.42，14.77。C₄₇H₇₆FNO₁₀Na⁺[M+Na]⁺的HRMS(ESI-TOF)计算值856.5345，实测值856.5362。

人NK细胞系、未成熟的单核细胞-衍生的树突细胞和NK/NKT的分离和生产

使用间接缀合的抗-Vα24iTCR微珠子(Miltenyi Biotec，USA)，分离 幼稚Vα24i NKT细胞。在50U/ml IL-2(R&D system)存在下温育分离的 细胞，每3天更换新鲜培养基。如下生产α-GalCer-脉冲的或苯基糖脂- 脉冲的Vα24i NKT。先后使用抗-Vα24i TCR mAb和抗-CD14mAb(各 自偶联到磁珠(Miltenyi Biotec，Auburn，CA)上)来从leukopaks分离 Vα24i NKT细胞和CD14细胞。在300U/ml GM-CSF(R&D Systems)和 100U/ml IL-4(R&D Systems)存在下温育2天后，从CD14细胞产生未 成熟的树突细胞。用2,000rad照射后，在100ng/ml α-GalCer或C11和 50U/ml IL-2(Invitrogen)存在下，与同基因的CD161细胞一起共培养未 成熟的树突细胞10-14天。用100ng/ml α-GalCer或C11-脉冲的照射过 的未成熟的树突细胞第二次刺激Vα24i NKT细胞后，分别产生α-GalCer 脉冲的或苯基-糖脂脉冲的iNKT细胞。流式细胞术证实所有iNKT细胞 系(幼稚的、α-GalCer脉冲的或苯基-糖脂脉冲的)都表达Vα24i T细胞 抗原受体(95％纯度)。使用抗-CD56微珠子(Miltenyi Biotec，USA)，从 人leukopaks分离NK和NKT细胞。

根据Fujio等人的方法，产生α-GalCer类似物-脉冲的人NKT细胞 系，并使用这些细胞来评估对研究的α-GalCer类似物的细胞因子应答(参 见图5和6)。在与300U/ml GM-CSF和100U/mlIL-4一起温育2天后， 从在leukopaks中的CD 14⁺细胞衍生出未成熟的DC。照射(3,000rad)后， 在100ng/ml α-GalCer和10U/mlIL-2存在下与自体的CD161⁺细胞一起 培养iDC 10天。重复该刺激后，产生NK细胞系，并证实表达 CD161⁺/CD3₊Vα24iTCR⁺(99％纯度)。为了生产未成熟的人单核细胞- 衍生的DC，在300U/ml GM-CSF和100U/ml IL-4存在下培养在 leukopaks中的CD14⁺细胞6天。这些树突细胞具有未成熟的表型 (CD14℃D80⁺CD86⁺CD83^弱HLA^-DR⁺)，且表现出比成熟的DC更高的 CD1d表达。用3μg/ml的不同的α-GalCer类似物脉冲处理iDC，并在 48小时后检查它们的表型和形态学。

使用间接缀合的抗-CD161多类微珠子，分离用于TCR活化实验 (参见图19)的幼稚NKT(CD161⁺/CD3⁺)，并通过抗-CD3微珠子进一步分 离。在100U/ml IL-2存在下，温育分离的细胞，并每3天更换新鲜的培 养基。

体外人NKT细胞的细胞因子分泌试验

在96孔平底板中，在10μg/ml的本公开内容的α-GalCer类似物存 在下，与5x10⁴照射过的未成熟的CD14⁺DC共培养Vα24i人NKT细 胞(1x10⁵)。用人22-plex多细胞因子检测系统，定量在18h 收集的上清液中的细胞因子/趋化因子，并通过100TM系统 测定。

iNKT的体外增殖

使用抗-CD56微珠子，从人leukopaks分离用于iNKT细胞增殖实验 (参见图13和14)的人CD56⁺细胞(NK/NKT混合物)。在第2天与用3 μg/ml的指示的α-GalCer类似物或0.3％DMSO脉冲处理过的4x10⁵自 体未成熟的CD14⁺DC培养人CD56⁺细胞(NK/NKT混合物)18小时(参 见图13和14)，或在第2天以10或100ng/ml培养18小时(参见图15)。 在第3天，将悬浮细胞转移至新盘，在100U/ml IL-2存在下培养，并每 3天更换新鲜的培养基。在第9天，通过流式细胞术门控(gate)NK/NKT 混合物中的CD161⁺/Vα24TCR⁺细胞群体，并计数Vα24i NKT的总数。

人NKT TCR活化

在一个示例性的实施方案中，在24孔板上，用10μg/ml的C1、C11、 C13或C17或DMSO温育HeLa、HeLa-CD1d或自体的iDC 2h，然后加 入3x10⁵幼稚CD161⁺/CD3⁺NKT(参见图19)。在另一个示例性的实施 方案中，给HeLa或HeLa-CD1d细胞装载100ng/ml的C1、C16、C23、 C8-5、C8-6或C26或DMSO 2小时，然后加入3x10⁵幼稚CD161⁺/CD3⁺NKT(参见图20)。5-10min刺激后，将悬浮细胞转移至试管，用PBS 洗涤，并在4℃用细胞信号传递通用裂解缓冲液(Cell Signaling Universal Lysis Buffer)裂解。根据试验方案，通过磷酸蛋白检测系统，评估在裂解物中的磷酸-CD3ε(磷酸-酪氨酸)、磷酸 -ERK1/2(Thr185/Tyr187)、磷酸-CREB(Ser133)、磷酸-Syk(磷酸-酪氨 酸)、磷酸-p38(THr180/Tyr 182)、磷酸-IκBα(Ser32)、磷酸-Lck、磷酸-Lat、 磷酸-STAT3(Ser727)、磷酸-STAT5A/B(Tyr 694/699)和磷酸-Dap-70(磷 酸-酪氨酸)的浓度，并通过Luminex100系统测定。用总输入蛋白的量将 数值标准化。

体外CD1d-四聚体试验

根据生产商的手册，在37℃和在中性pH，用10摩尔的每种 α-GalCer类似物温育1μg可溶的二价小鼠CD1d-IgG1融合蛋白(小鼠 CD1d-IgG1四聚体，BD Pharmingen)过夜。在4℃用小鼠NKT温育糖脂- 负载的CD1d-IgG1四聚体60min，随后用FITC-偶联的抗-小鼠IgG1mAb (A85-1)温育。还用PE偶联的抗-NK和APC偶联的抗-CD3mAb(BD Pharmingen)，对细胞进行表面染色。

小鼠脾细胞的制备

在注射后72h，处死用指示的本公开内容的α-GalCer类似物或载体 处理过的BALB/c小鼠。收获脾。简而言之，在将脾压过70μm粗滤器 和裂解红细胞后，将有核细胞重新悬浮于Hahk’s平衡盐溶液中，并在 4℃在300g离心5min，然后进行FACS分析。

小鼠脾细胞亚群的测定

用指示的本公开内容的α-GalCer类似物(2ug/小鼠)或载体(在PBS 中1％DMSO)处理BALB/c小鼠，并在72h时处死，收获脾。简而言之， 在将脾压过70μm粗滤器和裂解红细胞后，将有核细胞重新悬浮于 Hank’s平衡盐溶液中，并在4℃在300g离心5min，然后进行FACS分 析。从BD Bioscience-Pharmingen得到抗-CD3e-别藻蓝蛋白、抗-CD4-PE、 抗-CD8α-别藻蓝蛋白-氰化物-染料7、抗-CD11c-别藻蓝蛋白、抗 -CD23-PE、抗-45R-别藻蓝蛋白、抗-CD69-FITC、抗-CD80-FITC、抗 -CD86-PE、抗-Ly6G-PE和U5A2-13Ag+-PE。

小鼠脾细胞NKT和NK亚群的测定

用本公开内容的α-GalCer类似物(0.1ug/小鼠)或载体(0.1％DMSO 在PBS中)处理BALB/c小鼠，并在72h处死，收获脾。简而言之，在 将脾压过70μm粗滤器和裂解红细胞后，将有核细胞重新悬浮于Hank’s 平衡盐溶液中，并在4℃在300g离心5min，然后进行FACS分析。 从BD Bioscience-Pharmingen得到抗-CD3e-别藻蓝蛋白和NK标记 U5A2-13Ag+-PE。

血清细胞因子/趋化因子

在施用载体或本公开内容的合成的α-GalCer类似物后0、2、18、 36、48和72h，收集小鼠血清样品。通过小鼠21-plex细胞 因子检测系统，测量不同的细胞因子/趋化因子的血清浓度，并通过 100TM系统读出。

小鼠中的肺癌模型

给C57BL/6小鼠(6-8周，雌性)IV注射悬浮于0.1ml PBS中的2X 10⁵同基因的肺癌(TC1)细胞。在1小时，用指示的本公开内容的 α-GalCer类似物(每只小鼠2μg)或载体IV处理C57BL/6小鼠组(n＝5)， 每周2次，持续4周。记录体重1个月，并监测存活50天。

小鼠中的乳腺癌模型

给BALB/C小鼠(6-8周，雌性)在右背下部SubQ接种2X10⁵同基 因的乳腺癌(4T1)。在肿瘤接种后3天，用指示的本公开内容的α-GalCer 类似物或载体IV或SubQ处理BALB/c小鼠组(n＝6)，每周2次，持续4 周。将α-GalCer类似物注射在远离肿瘤接种部位的位置。通过用测径器 沿着长轴(a)、短轴(b)和高度(c)进行测量，每3天记录肿瘤体积，持续1 个月。通过公式a x b x c，计算肿瘤体积(mm³)，并监测存活70天。

小鼠中肿瘤生长的实时评估

通过Xenogen′s200Series和Living软件(Xenogen， U.S.)得到和分析小鼠图像。在黑素瘤模型中，给C57BL/6小鼠(6-8周， 雌性)静脉内注射悬浮于0.1ml PBS中的2X10⁵同基因的黑素瘤(B16) 细胞。3天后，在指示的治疗方案下，用指示的糖脂静脉内处理C57BL/6 小鼠组(n＝5)。每3天记录肿瘤体积，持续24天。

通过流式细胞计分析淋巴细胞的浸润

在肿瘤植入后第21天，无菌地从对照和糖脂处理过的小鼠中取出 肿瘤，并在培养皿中手工地切成2-3-mm碎片。然后在连续搅拌下，用 在RPMI 1640中的0.01％DNase、0.01％透明质酸酶和0.1％胶原酶 (都来自Sigma Chemical Co.)在37℃消化小组织碎片2-3h。然后用在 PBS中的0.1％FCS洗涤得到的单细胞悬浮液2次，并通过标准的流式 细胞术方法染色。为了检测浸润这些组织的淋巴细胞亚群，将下述缀合 的抗体用于FACS：FITC-抗-CD3、PE-抗-NK、APCCy7-抗-CD8(BD Biosciences PharMingen，San Diego，CA)。

免疫组织化学染色

从静脉内注射2X10⁵TC1肿瘤细胞3周的B6小鼠取出肺结，然后 处死，制成石蜡包埋的切片。在56℃烘箱中处理3μm厚切片过夜，然 后脱石蜡，并进行热介导的抗原提取(在pH 9Tris-EDTA缓冲液中， 121℃，7.5min)，并以1∶100的滴定与作为共同淋巴细胞抗原的指示剂 的抗-CD45RA抗体(克隆RA3-6B2；BD Biosciences PharMingen，San Diego，CA)一起在4℃温育过夜。通过加入与辣根过氧化物酶缀合的第 二抗体和DAB底物，检测结合的第一抗体。在计数之前，用苏木精复 染色所有切片。

统计分析

使用PRISM软件，使用不成对的双尾Student’s t检验进行数据分 析。图形显示了三次重复实验的平均值，误差棒表示SD。使用时序检 验，分析每个组中的肿瘤保护的差异。P＜0.05认为统计上显著的。

抗细菌效力研究

α-GalCer的糖脂类似物

在图2中显示了在抗细菌研究中使用的α-GalCer类似物C3、C9、 C11和C14-C17的结构。将α-GalCer类似物储液制成1mg/ml DMSO溶 液。在使用前，用磷酸盐缓冲盐水(PBS)将α-GalCer类似物稀释至10 μg/ml。

动物和细菌

使用6-8周龄的雌性C57L/6和BALB/c-Byl小鼠进行研究。将小鼠 圈养在塑料笼中，自由获取食物和水，并在开始实验之前使其适应至少 1周。从BCRC，Taiwan得到细菌株荚膜鞘氨醇单胞菌(ATCC 14666)。 细菌株肺炎克雷伯菌(NTUH-KP2044)由National Taiwan University Hospital，Taiwan的J.T.Wang赠送。

使用荚膜鞘氨醇单胞菌感染的小鼠的抗细菌效力研究

给6-8周龄雌性C57BL/6小鼠IP注射5x10⁸个荚膜鞘氨醇单胞菌细 胞。将小鼠分成处理组和对照组，每组4-6只小鼠。在感染后4小时， 给处理组中的小鼠IP注射50或100μg/kg的测试α-GalCer类似物，并 给对照组小鼠注射相同体积的PBS。在细菌感染后24小时，处死所有 组的小鼠。从小鼠取出肝，并使用组织匀浆器在0.9％NaCl、0.02％吐温 80中匀浆化。通过将稀释的样品涂布在营养平板上，测定肝匀浆中荚膜 鞘氨醇单胞菌的菌落形成单位(CFU)。在37℃温育48小时后，计数菌 落。

使用肺炎克雷伯氏菌感染的小鼠的抗细菌效力研究

通过经口管饲法，给BALB/c-Byl雌性小鼠(每组10只小鼠)施用单 次剂量(10⁶CFU)的活肺炎克雷伯氏菌。在细菌感染后4和8小时，给 处理组的小鼠注射100μg/kg的测试α-GalCer类似物2次。在4和8小 时，给对照组的小鼠注射PBS。在感染后24小时，处死所有小鼠。从 每只小鼠收集肝和肺，并匀浆化。如上所述类似地测定细菌数。

统计分析

通过对比处理组和对照组的器官CFU值，解释了测试α-GalCer类 似物的对比效力，并分别用＜0.05或＜0.01的p值，指示效力的显著性。

糖脂测试剂

在图64(A-B)中显示了糖脂的结构和它们使用的代码名称。将糖脂 储液制成1mg/mL DMSO溶液。用磷酸盐缓冲盐水(PBS)将化合物稀释 至10-30μg/mL，并用于动物研究。

使用的小鼠、病毒和细菌

将6-8周龄的C57L/6和BALB/c小鼠用于研究。将小鼠圈养在塑料 笼中，自由获取食物和水，并在开始实验之前使其适应至少1周。在该 研究中使用的病毒是如前所述的流感株WSN(A/WSN/1933/H1N1)和日 本脑炎病毒(JEV，RP-9株)。从BCRC，Taiwan得到细菌株荚膜鞘氨醇单 胞菌(ATCC 14666)。发光金黄色葡萄球菌Xen29购自Xenogen Corporation(CA，USA)。所有动物研究得到Academia Sinica动物研究委 员会的批准，并根据指南进行。在研究中使用的免疫缺陷的小鼠如前所 述。

使用荚膜鞘氨醇单胞菌感染的小鼠的抗细菌效力研究

给6-8周龄雌性C57BL/6小鼠腹膜内注射5x10⁸个荚膜鞘氨醇单胞 菌细胞。将小鼠分成处理组和对照组，每组5-10只小鼠。在感染后3-4 小时，给处理组中的小鼠腹膜内注射50或100μg/kg的测试糖脂，并给 对照组小鼠注射相同体积的PBS。在细菌感染后24小时，处死所有组 的小鼠。从小鼠取出肝，并使用组织匀浆器在0.9％NaCl、0.02％吐温 80中匀浆化。通过将稀释的样品涂布在营养平板上，测定肝匀浆中荚膜 鞘氨醇单胞菌的菌落形成单位(CFU)。在37℃温育48小时后，计数菌 落。使用单向方差分析来分析抗细菌结果，以评估处理组中的差异显著 性，然后进行Turkey后检验。

通过图像分析使用发光金黄色葡萄球菌(X29)进行抗细菌效力研究

将Balb/C雌性小鼠称重、分组，并在左后腿的后四头肌中注射200 μl含有3X10⁸CFU的金黄色葡萄球菌Xen29的PBS。在Xen29感染后 的不同时间，给小鼠IP注射所述的载体或糖脂。使用所述的IVIS成像 系统(Xenogen Corporation，CA，USA)，定期采集小鼠图像。使用单向方 差分析来分析图像结果(用相对发光表示)，以评估处理组中的差异显 著性，然后进行Turkey后检验。

日本脑炎病毒(JEV)感染动物模型

将7周龄C57/B56小鼠分组，并在不同的时间给JEV感染的小鼠注 射糖脂。通过IP注射在500μl PBS中的5X10⁵PFU的RP-9株JEV，并 同时在大脑内注射如前所述的50ml PBS(IP+IC途径)，进行感染。每天 监测小鼠的存活。使用Prism软件(GraphPad Software，San Diego，CA)， 将糖脂处理的组的存活曲线与对照组进行对比。

抗流感动物模型研究

为了评价α-GalCer类似物的体内效力，在相对于使用10LD₅₀WSN 病毒的鼻感染的不同时间，用C34处理Balb/c小鼠。在感染后，每天检 查所有组中的小鼠存活率，持续14天。使用Prism软件(GraphPad Software，San Diego，CA)，将糖脂处理的组的存活曲线与对照组进行对 比。

肌肉内注射2个剂量的pCHA5+/-糖脂疫苗的针对禽流感病毒感染 的免疫保护

通过肌肉内途径，用pCHA5(30μg)+/-糖脂(1μg)免疫小鼠，并在 2周后，仅用pCHA5加强。加强注射后2周，收集血清，并通过ELISA 测试HA-特异性的抗体效价(图73A)，用200LD₅₀的NIBRG-14病毒攻 击小鼠，并监测存活(图73B)。

用和不用糖脂的pCHA5的单次肌肉内疫苗接种

使用糖脂作为佐剂，增强单次肌肉内剂量的pCHA5后的免疫应答 和小鼠存活。通过肌肉内途径，用pCHA5(50μg)+/-糖脂(2μg)或铝免 疫小鼠。疫苗接种后3周，收集血清，并通过ELISA测试HA-特异性的 抗体效价(图74A)。同时，处死小鼠，并收获脾细胞用于ELISPOT试 验(图74B)。用200LD₅₀的NIBRG-14病毒攻击另一组小鼠，并监测存 活(图74C)。

糖脂对pCHA5和pCHA5-II疫苗的佐剂效应的对比

在第0周和第3周，通过IM/EP途径，用pCHA5或pCHA5-II(30 μg)+/-糖脂(2μg)免疫小鼠。加强注射后2周，收集血清，并通过ELISA 测试抗HA抗体效价(图75A)，并用E319病毒攻击用pCHA5(图75B) 和pCHA5-II(图75C)免疫过的小鼠，并监测存活。

pCHA5-II和C34对小鼠中HA-特异性的抗体生产和免疫保护的剂 量效应

通过肌肉内途径，用或不用C34(0.5，1，2，4μg)作为佐剂，用单次 剂量的pCHA5-II(100，75，50μg)免疫小鼠。疫苗接种后3周，收集血清， 并通过ELISA测定HA-特异性的抗体效价(图76A)。同时，处死小鼠， 并收获脾细胞用于ELISPOT试验(图76B)。同时，用NIBRG-14病毒攻 击其它组的小鼠，并监测小鼠存活。图76C显示了用不同剂量的 pCHA5-II和2μg C34佐剂处理的小鼠的存活率。图76D显示了用100μg pCHA5-II和不同剂量的C34处理的小鼠的存活率。

C34对针对不同的HA-假型病毒的中和抗体产生的佐剂效应

在第0周和第3周，用0.2μg pCHA5(溶解在含有2μg C34的PBS 中)IM/EP免疫雌性BALB/c小鼠。最后一次疫苗接种后2周，收集血 清，并通过HA-假型病毒中和试验进行检查。将数据报告为产生50％的 HA-假型病毒中和时的血清稀释度(ID₅₀)。在该试验中使用TK(图77A)、 VN1194(图77B)、ID05(图77C)和Anhui05(图77D)HA-假型病毒。使 用非线性回归分析，检查数据拟合。p值是拟合的对比。^*，当对比C34- 佐剂化的组和仅pCHA5组时，p＜0.05，且表示统计显著的。

接受pCHA5(用或不用C34作为佐剂)的小鼠中的血清细胞因子 表达特性

在第0周和第3周，通过IM/EP途径，用0.2μg pCHA5(含有或不 含C34)免疫雌性BALB/c小鼠。在第二次疫苗接种之前(0h)和之后20h， 收集血清。通过Luminex 200系统，测定细胞因子的血清浓度。^*，当 对比C34佐剂化的组和仅pCHA5组时，通过双尾未配对的t检验，p＜ 0.05。#，当对比0h和20h时，通过双尾未配对的t检验，p＜0.05。显 示了关于下列的结果：IL-2(图78A)、IL-5(图78B)、IL-13(图78C)、 RANTES(图78D)、MIP-1α(图78E)、MIP-1β(图78F)、KC(图78G)、 IL-1β(图78H)、IL-17(图78I)、IL-12p40(图78J)、G-CSF(图78K)和IFN-γ (图78L)。

通过单次剂量肌肉内注射C34诱导抗血清的中和能力

用50μg pCHA5-II(溶解在含有2μg C34的PBS中)IM免疫雌性 BALB/c小鼠。3周后，收集血清，并通过HA-假型病毒中和试验进行检 查。在该试验中使用TK、VN1194、ID5和RG5的HA-假型病毒。将数 据记录为ID₅₀。使用非线性回归分析，检查数据拟合。p的值是拟合的 对比。^*，当对比C34-佐剂化的组和仅pCHA5-II组时，p＜0.05，且表 示统计显著的。显示了关于下列的结果：Anhi05(图79A)、TK05(图79B)、 ID05(图79C)和VN1194(图79D)。