一种虫草菌丝体中粗多糖含量的测定方法

摘要

本发明公开了一种虫草菌丝体中粗多糖的测定方法，包括如下步骤：(1)供试品溶液的制备；(2)标准曲线的制备；(3)虫草菌丝体中粗多糖吸收系数的确定；(4)按步骤(1)-(3)重复n次，获得多个供试品待测液的吸收系数E

说明书

技术领域

本发明涉及一种粗多糖的测定方法，特别是涉及一种虫草菌丝中粗多糖含量的测定方 法。

背景技术

虫草多糖是虫草体内含量最丰富、最重要的生物活性物质之一，虫草多糖是由甘露糖、 虫草素、腺苷、半乳糖、阿拉伯糖、木糖精、葡萄糖、岩藻糖组成的多聚糖。大量医学实验 证实，虫草多糖可活化巨噬细胞，刺激抗体产生，提高人体免疫能力，升高白细胞抑制肿瘤 生长，并具有抗肿瘤、抗辐射、降血糖和脂蛋白、止咳、化痰、润肺和延缓衰老等药理作用， 此外，虫草多糖还能抗心律失常，抗心肌缺血，扩张外周血管，降压，降血脂，抑制血小板 聚集。

目前，虫草菌丝体中的粗多糖含量的测定方法通常采用苯酚-硫酸法或蒽酮-硫酸法，均 是以葡萄糖或葡聚糖为标准品，通过绘制标准曲线，进而对虫草菌丝体样品中的粗多糖含量 进行定量。其步骤主要包括：1、对样品进行预处理；2、绘制葡萄糖或葡聚糖标准曲线；3、 通过标准曲线测定样品的含量；为了使得测定的结果能够反应虫草菌丝体中粗多糖的真实含 量，对不同批次样品进行含量测定时，均需绘制标准曲线。这种方法即耗时又消耗实验试剂； 另外在配制标准溶液和绘制标准曲线时还会因称量、定容、稀释等操作步骤产生人为误差， 影响结果的准确性。

发明内容

本发明的目的是克服现有技术中的不足，提供一种能够快速、准确地测定虫草菌丝体中 粗多糖的含量，操作方法简便、人为误差少的虫草菌丝中粗多糖含量的测定方法。

本发明的技术方案概述如下：

一种虫草菌丝体中粗多糖的测定方法，包括如下步骤：

(1)供试品溶液的制备：

a、称取m克的虫草菌丝体供试品，置于体积为V₁mL的容量瓶中，加入所述V₁mL容量 瓶体积的2/3的蒸馏水，在100℃恒温水浴中浸提3-8小时，定容至V₁mL，过滤，除去不 溶杂质，收集滤液；

b、吸取滤液V₂mL，加入4倍于V₂ml的无水乙醇，用于沉淀滤液中的多糖，醇沉6-8 小时，离心，收集多糖沉淀；

c、将所述多糖沉淀溶于V₃mL蒸馏水中，使沉淀溶解，即得到供试品溶液；

(2)标准曲线的制备：

a、将纯度大于99.0％的葡萄糖标准品于80℃干燥至恒重，精确称取0.01g，置于100ml 容量瓶中，加入80ml蒸馏水，超声15分钟，使葡萄糖充分溶解，放冷至室温，定容摇匀， 即得0.10mg/mL葡萄糖标准溶液；

b、精密吸取所述葡萄糖标准溶液0ml、0.20ml、0.40ml、0.60ml、0.80ml、1.0ml， 分别置于6个10ml具塞试管中，分别加蒸馏水使体积为1.0ml，再加质量浓度为5％的苯酚 水溶液1.0ml，摇匀，滴加浓硫酸5.0ml，振荡摇匀后置沸水浴中加热15min，冷却至室温， 得到标准待测液；用光程为1cm的比色皿，在490nm波长处测定各个标准待测液的吸光度， 以标准待测液中葡萄糖的浓度为横坐标，以吸光度为纵坐标，绘制出标准曲线；

(3)虫草菌丝体中粗多糖吸收系数的确定：

a、供试品待测液的制备：取步骤(1)获得的供试品溶液V₄mL，加蒸馏水使体积为1.0ml， 加质量浓度为5％的苯酚水溶液1.0ml，摇匀，滴加浓硫酸5.0ml，振荡摇匀后置沸水浴中加 热15min，冷却至室温，得到供试品待测液，体积记为V₅；

b、吸收系数的确定：用光程为1cm的比色皿，在490nm波长处测定所述供试品待测液 的吸光度；由步骤(2)所得标准曲线中吸光度A与浓度C的对应关系，得到供试品待测液 中粗多糖的浓度C，根据朗伯-比尔定律A＝ECL，计算出供试品待测液中粗多糖的吸收系数 E₁；

(4)按步骤(1)-(3)重复n次，获得多个供试品待测液的吸收系数E₂、E₃、E₄……En， 计算E₁、E₂、E₃、E₄……En的平均值E，即为虫草菌丝体中粗多糖的吸收系数；

(5)利用确定的吸收系数E根据下述公式计算虫草菌丝体中粗多糖的含量：

a、按照步骤(1)所述的方法另取M克虫草菌丝体，制备虫草菌丝体溶液，获得该溶液 的V₁、V₂、V₃值；

b、按照步骤(3)中a所述的方法制备体积为V₅的虫草菌丝体溶液，获得该溶液的V₄和V₅值；

c、用光程为1cm的比色皿，在490nm波长处测定步骤b所得虫草菌丝体溶液的吸光度 A；

d、根据步骤(4)得到的吸收系数E，按下式计算虫草菌丝体中粗多糖含量，

$X=\frac{A\times V_5\times V_3\times V_1}{E\times 100\times V_4\times V_2\times M}\times 100\%$

式中：X——虫草菌丝体中粗多糖含量，以葡萄计；

A——供试品待测液的吸光度；

E——吸收系数

M——虫草菌丝体质量，单位为g。

本发明的方法只需对样品进行预处理，无需进行标准曲线的绘制，根据公式即可获得虫 草菌丝体中的粗多糖含量。省去了标准曲线法中，配置标准溶液和绘制标准曲线法的步骤， 减少了实验步骤，从而减少实验过程中的人为误差。同时，由于实验步骤的减少，还缩短了 实验时间，节约了实验试剂，既提高了工作效率又节约了成本。

附图说明

图1是虫草菌丝体粗多糖含量测定标准曲线的制备。

具体实施方式

下面通过具体实施例对本发明作进一步的说明。

实施例1

一种虫草菌丝体中粗多糖的测定方法，包括如下步骤：

(1)供试品溶液的制备：

a、称取1.0g的虫草菌丝体供试品，置于体积为100mL(V₁mL)的容量瓶中，加入所 述100mL容量瓶体积的2/3的蒸馏水，在100℃恒温水浴中浸提5小时，定容至100mL，过 滤，除去不溶杂质，收集滤液；

b、吸取滤液5mL(V₂mL)，加入20mL(4倍于V₂ml)的无水乙醇，用于沉淀滤液中的 多糖，4℃静置醇沉6小时，3000rpm离心，收集多糖沉淀；

c、将所述多糖沉淀溶于25mL(V₃mL)蒸馏水中，使沉淀溶解，即得到供试品溶液；

(2)标准曲线的制备：

a、将纯度大于99.0％的葡萄糖标准品于80℃干燥至恒重，精确称取0.010g，置于100ml 容量瓶中，加入80ml蒸馏水，超声15分钟，使葡萄糖充分溶解，放冷至室温，定容摇匀， 即得0.10mg/mL葡萄糖标准溶液；

b、精密吸取所述葡萄糖标准溶液0ml、0.20ml、0.40ml、0.60ml、0.80ml、1.0ml， 分别置于6个10ml具塞试管中，分别加蒸馏水使体积为1.0ml，再加质量浓度为5％的苯酚 水溶液1.0ml，摇匀，滴加浓硫酸5.0ml，振荡摇匀后置沸水浴中加热15min，冷却至室温， 得到标准待测液；用光程为1cm的比色皿，在490nm波长处测定各个标准待测液的吸光度， 以标准待测液中葡萄糖的浓度为横坐标，以吸光度为纵坐标，绘制出标准曲线，结果见表1 和图1；

表1虫草菌丝体粗多糖含量测定标准曲线的制备

(3)虫草菌丝体中粗多糖吸收系数的确定：

a、供试品待测液的制备：取步骤(1)获得的供试品溶液0.5mL(V₄mL)，加蒸馏水使 体积为1.0ml，加质量浓度为5％的苯酚水溶液1.0ml，摇匀，滴加浓硫酸5.0ml，振荡摇匀 后置沸水浴中加热15min，冷却至室温，得到供试品待测液，体积记为7mL(V₅mL)；

b、吸收系数的确定：用光程为1cm的比色皿，在490nm波长处测定所述供试品待测液 的吸光度；以蒸馏水进行空白校正，由步骤(2)所得标准曲线中吸光度A与浓度C的对应 关系，得到供试品待测液中以葡萄糖计的粗多糖的浓度C，根据朗伯-比尔定律A＝ECL，计 算出供试品待测液中粗多糖的吸收系数E₁；

(4)按步骤(1)-(3)重复6次，获得多个供试品待测液的吸收系数E₂、E₃、E₄……E₆， 计算E₁、E₂、E₃、E₄……E₆的平均值E，即为虫草菌丝体中粗多糖的吸收系数；结果见表2；

表2、虫草菌丝体粗多糖含量测定吸收系数的测定结果

(5)利用确定的吸收系数E根据下述公式计算虫草菌丝体中粗多糖的含量：

a、按照步骤(1)所述的方法另取M克虫草菌丝体，制备虫草菌丝体溶液，获得该溶液 的V₁、V₂、V₃值；

b、按照步骤(3)中a所述的方法制备体积为V₅的虫草菌丝体溶液，获得该溶液的V₄和V₅值；

c、用光程为1cm的比色皿，在490nm波长处测定步骤b所得虫草菌丝体溶液的吸光度 A；

d、根据步骤(4)得到的吸收系数E，按下式计算虫草菌丝体中粗多糖含量，

$X=\frac{A\times V_5\times V_3\times V_1}{E\times 100\times V_4\times V_2\times M}\times 100\%$

$X=\frac{A\times 7\times 25\times 100}{596\times 100\times 0.5\times 5\times M}\times 100\%$

式中：X——虫草菌丝体中粗多糖以葡萄计的质量含量；

A——虫草菌体体溶液的吸光度；

596——本实施例中前4个步骤确定的吸收系数

M——虫草菌丝体的质量，单位为g。

结论：

1、吸收系数确定以后，每次对虫草菌丝体粗多糖含量的定量则无需制作标准曲线，故 而省去了葡萄糖标准品的购买及使用，同时节省了其他试剂的使用量，既节省了批产品检测 的经费，又简化了操作步骤，节省了批产品检测时间。

2、吸收系数法与标准曲线法结果比对：

选取三份购自不同生产厂家的虫草菌丝体样品，每份样品分别按吸收系数法及标准曲线 法测定其所含粗多糖的量，结果见下表

由上表可知，利用本发明所确定的吸收系数对虫草菌丝体中粗多糖含量进行的定量与标 准曲线法测得的含量，无明显偏差，吸收系数法这一替代方案能实现对样品粗多糖含量的准 确定量。

实验证明：步骤(1)供试品溶液的制备中100℃恒温水浴中浸提3小时或8小时；醇沉 的时间为6小时或8小时，也可以用于本发明。