一种利用废渣固态发酵生产脂肪水解酶的制备方法

摘要

本发明公开了一种利用废渣固态发酵生产脂肪水解酶的制备方法，属于微生物发酵领域。发明将黑曲霉RFW-5接种到发酵培养基中，在接触空气条件下，于温度35~42°C，环境相对湿度75~80%固态发酵，培养3天达到产酶高峰。用pH为7.0，100mM的磷酸缓冲液浸提培养物，离心，上清液即脂肪水解酶溶液。经滴定法测定酶活，脂肪水解酶活达到32.3单位/克干固体。本发明制备的脂肪水解酶所用原料价廉，酶产率高，发酵周期短，工艺简单，具有很高的工业化开发价值；并且为高浓度油脂污水的处理提供了一条新途径。

说明书

技术领域

本发明涉及一种利用废渣固态发酵生产脂肪水解酶的制备方法，更确切地说是涉及一种采用黑曲霉菌RFW-5作为菌种对废渣进行固态发酵生产脂肪水解酶的方法。

背景技术

来自屠宰场，奶制品加工厂和餐饮业污水中含有大量难生物降解的油脂。高浓度的油脂会对后续处理产生一系列问题，如降低传质效率、丝状细菌大量繁殖进而导致沉降困难、污泥上浮、堵塞管网和产生恶臭气体等。

脂肪水解酶是一种酶制剂，它的主要作用是水解脂肪，将脂肪水解为甘油和脂肪酸。大量学者(如巴西的Denise M.G. Freire、Magali C. Cammarota、Daniela R. Rosa等人)研究发现，利用脂肪水解酶处理油脂污水会提高整个反应系统的去除效率，进而得到较好的出水。巴西的学者Denise M.G. Freire，利用棕榈油饼废弃物为底物，经从环境中分离的黑曲霉菌(Penicillium sp. fungus)在温度35°C、环境相对湿度75%条件下发酵，得到了20U/g的酶活。然后将发酵物以0.1%(w/v)的接种量接种到1200mg/L的油脂污水中，30°C处理24小时后，游离脂肪酸浓度比初始时高了8倍。将经发酵物处理过的油脂污水用厌氧反应器继续处理，发现COD去除率90%左右，而该厌氧反应器对原水的COD去除率只有32%。因此，脂肪水解酶在油脂污水的生物降解中有重要应用。

目前商业化的脂肪水解酶使用液体深层发酵获得的比较多，虽然纯度高，但价格昂贵限制了其广泛应用。与液体深层发酵相比，通过固态发酵生产脂肪水解酶可能更为合适(Mitchell et al., 2002; Pandey, 2003)。固态发酵(SSF)过程中使用的水较少，从而有以下优点：首先，发酵罐的体积大幅度缩小，容积利用率更高；发酵结束后，产品浓度高，产物干燥后就可以直接使用；污水产生量少，进而处理费用低(Castilho et al., 2000)。微生物，特别是丝状真菌，固态发酵(SSF)条件与它们的自然生境相似，所以可以获得最大数量的酶。另外，固态发酵所用培养基可以是糠，麸和其它来自于植物的复合物质。因此，发酵培养基几乎不需要其它添加的营养物质。上面所述的物质都是工农业废弃物，所以廉价充足。

发明内容

    本发明的目的是克服现有技术的不足，提供一种利用废渣固态发酵生产脂肪水解酶的制备方法。

利用废渣固态发酵生产脂肪水解酶的制备方法是：将黑曲霉RFW-5接种到发酵培养基中，在接触空气条件下，于温度35~42°C，环境相对湿度75~80%固态发酵，培养3天达到产酶高峰，用pH为7.0，100mM的磷酸缓冲液浸提培养物，离心，上清液即脂肪水解酶溶液；所述的的发酵培养基组成为：重量百分比为10.0～14.0%的豆饼，重量百分比为8.0～11.0%的甘蔗渣，重量百分比为10.0～14.0%的花生饼，补充溶液61.0～72.0 %L/kg。

所述的黑曲霉RFW-5保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏日期：2010年12月10日；保藏编号：CGMCC No. 4450；分类命名：黑曲霉Aspergillus niger。所述的大豆饼为大豆油生产过程中产生的废渣，经脱水干燥加工成含水率在12%以下，再经粉碎处理能过20目筛的颗粒。所述的甘蔗渣为甘蔗在经人类食用后产生的甘蔗废渣，经脱水干燥加工成含水率在12%以下，再经粉碎处理能过100目筛的颗粒。所述的花生饼为花生油生产过程中产生的废渣，经脱水干燥加工成含水率在13%以下，再经粉碎处理能过20目筛的颗粒。所述的的补充溶液成份为：NaCl 3.0～5.0g，KH₂PO₄ 0.1～0.3g，MgSO₄·7H₂0 0.05～0.1g，K₂HPO₄ 1.2～1.5g，(NH₄)₂SO₄ 0.8～1.0g，Tween80 15～20mL，食用油 4～5mL，蒸馏水1000mL。

本发明制备的脂肪水解酶所用原料价廉，酶产率高，发酵周期短，工艺简单，具有很高的工业化开发价值；并且为高浓度油脂污水的处理提供了一条新途径。

具体实施方式

实施例1：固态发酵生产脂肪水解酶实验1

本发明所用黑曲霉菌RFW-5是从环境中分离、筛选获得，目前已将其保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏日期：2010年12月10日；保藏编号：CGMCC No. 4450；分类命名：黑曲霉Aspergillus niger。

发酵培养基组成为：重量百分比为10.0%的豆饼，重量百分比为8.0%的甘蔗渣，重量百分比为10.0%的花生饼，补充溶液72.0 %（L/kg）。大豆饼为大豆油生产过程中产生的废渣，经脱水干燥加工成含水率在12%，再经粉碎处理能过20目筛的颗粒；甘蔗渣为甘蔗在经人类食用后产生的甘蔗废渣，经脱水干燥加工成含水率在12%，再经粉碎处理能过100目筛的颗粒；花生饼为花生油生产过程中产生的废渣，经脱水干燥加工成含水率在13%，再经粉碎处理能过20目筛的颗粒；补充溶液成份为：NaCl 3.0g，KH₂PO₄ 0.1g，MgSO₄·7H₂0 0.05g，K₂HPO₄ 1.2g，(NH₄)₂SO₄ 0.8g，Tween80 15mL，食用油 4mL，蒸馏水1000mL。

固态发酵操作方法如下：按发酵培养基所述的原料比配制培养基，培养基分装于100mL的三角瓶中，每瓶30g，于121°C高压灭菌30分钟；接种黑曲霉菌RFW-5，于温度35°C，环境相对湿度75%、接触空气条件下，静置培养3天；用pH为7.0，100mM的磷酸缓冲液浸提培养物(在200rpm，37°C振摇30min)，1600×g离心2min，上清液即脂肪水解酶溶液。

脂肪水解酶酶活测定采用滴定法。测定方法具体如下：取18mL的含有5%(w/v)阿拉伯胶和5%(w/v)橄榄油的pH 7.0、100mM的磷酸缓冲溶液于100mL三角瓶中，加入2mL脂肪水解酶液。置于200rpm，37°C摇床中振摇15min。通过添加20mL丙酮和乙醇 (1:1 v/v)的混合物终止反应。然后再次将其放入200rpm、37°C摇床中振摇10min以使游离脂肪酸分离出来。添加2低酚酞试剂，然后使用0.01mol/L的NaOH滴定至红色pH 10.0。空白对照为先将2mL脂肪水解酶液加入到20mL丙酮和乙醇 (1:1 v/v)的混合物中，再将该混合物加入到含有相同底物的100mL三角瓶中。1单位酶活定义为：实验条件下，每分钟能催化产生1μmol脂肪酸的酶数量。

经测定本次固体发酵实验获得的脂肪水解酶酶活为27.5单位/克干固体。

实施例2：固态发酵生产脂肪水解酶实验2

本发明所用黑曲霉菌RFW-5是从环境中分离、筛选获得，目前已将其保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏日期：2010年12月10日；保藏编号：CGMCC No. 4450；分类命名：黑曲霉Aspergillus niger。

发酵培养基组成为：重量百分比为14.0%的豆饼，重量百分比为11.0%的甘蔗渣，重量百分比为14.0%的花生饼，补充溶液61.0 %（L/kg）。大豆饼为大豆油生产过程中产生的废渣，经脱水干燥加工成含水率在12%，再经粉碎处理能过20目筛的颗粒；甘蔗渣为甘蔗在经人类食用后产生的甘蔗废渣，经脱水干燥加工成含水率在12%，再经粉碎处理能过100目筛的颗粒；花生饼为花生油生产过程中产生的废渣，经脱水干燥加工成含水率在13%，再经粉碎处理能过20目筛的颗粒；补充溶液成份为：NaCl 5.0g，KH₂PO₄ 0.3g，MgSO₄·7H₂0 0.1g，K₂HPO₄ 1.5g，(NH₄)₂SO₄ 1.0g，Tween80 20mL，食用油 5mL，蒸馏水1000mL。

固态发酵操作方法如下：按发酵培养基所述的原料比配制培养基，培养基分装于100mL的三角瓶中，每瓶40g，于121°C高压灭菌30分钟；接种黑曲霉菌RFW-5，于温度42°C，环境相对湿度80%、接触空气条件下，静置培养3天；用pH为7.0，100mM的磷酸缓冲液浸提培养物(在200rpm，37°C振摇30min)，1600×g离心2min，上清液即脂肪水解酶溶液。

脂肪水解酶酶活测定采用滴定法。测定方法具体如下：取18mL的含有5%(w/v)阿拉伯胶和5%(w/v)橄榄油的pH 7.0、100mM的磷酸缓冲溶液于100mL三角瓶中，加入2mL脂肪水解酶液。置于200rpm，37°C摇床中振摇15min。通过添加20mL丙酮和乙醇 (1:1 v/v)的混合物终止反应。然后再次将其放入200rpm、37°C摇床中振摇10min以使游离脂肪酸分离出来。添加2低酚酞试剂，然后使用0.01mol/L的NaOH滴定至红色pH 10.0。空白对照为先将2mL脂肪水解酶液加入到20mL丙酮和乙醇 (1:1 v/v)的混合物中，再将该混合物加入到含有相同底物的100mL三角瓶中。1单位酶活定义为：实验条件下，每分钟能催化产生1μmol脂肪酸的酶数量。

经测定本次固体发酵实验获得的脂肪水解酶酶活为22.7单位/克干固体。