一种土壤环境中痕量天然及合成雌激素含量的检测方法

摘要

本发明涉及一种土壤中痕量天然及合成雌激素的检测技术，特别是涉及一种采用液相色谱-串联质谱联用技术对土壤样品中痕量天然和合成雌激素含量的检测方法。本方法将采集好的土壤品进行冷冻干燥，采用丙酮进行快速溶剂萃取，得到萃取液，采用固相萃取柱浓缩富集其中的雌激素，采用乙酸乙酯将雌激素从固相萃取柱上洗脱下来，利用液相色谱-串联质谱联用分析雌激素浓度。该方法环境友好、易于操作、且回收率较高，能够快速分析土壤样品中痕量天然和合成雌激素的含量。

说明书

技术领域

本发明涉及一种土壤中痕量雌激素的检测技术，特别是涉及一种采用液相色谱-串联质谱联用技术对土壤样品中痕量天然和合成雌激素含量的检测方法。 

背景技术

由人与动物卵巢分泌的天然雌激素雌酮(Estrone，E1)、17β-雌二醇(17β-Estradiol，E2)和雌三醇(Estriol，E3)，以及作为口服避孕药主要成分的合成雌激素17α-乙炔基雌二醇(17α-Ethinyl Estradiol，EE2)，会随着粪尿排放进入污水处理系统或农田土壤中。雌激素的排放是不可避免的，近十年来雌激素作为典型的内分泌干扰物受到广泛关注。欧美等国对多家污水处理厂雌激素浓度及去除效率的调查结果显示，在污水处理厂出水及受纳水体中残留着ng/L浓度水平的雌激素，表明污水处理厂不能有效去除进水中的雌激素。畜禽养殖业排放的雌激素会通过堆肥施用或地表径流进入土壤及水体中。有关鱼类生殖异常现象的研究结果表明，污水处理厂受纳水体中所含ng/L浓度水平的雌激素是导致鱼类雌性化生殖异常现象的主要原因物质。 

近年来，食品安全问题受到人们的广泛关注，在有机粮食和有机蔬菜种植中，农家肥得到广泛应用。土壤施肥是雌激素在土壤环境中残留与增加的主要原因。研究结果表明，当牧场施用鸡粪肥后，其地表径流中17β-雌二醇的浓度为20～2530ng/L，而其土壤中的含量由0.055ng/g增至0.675ng/g，且取决于粪肥施用率及已施用时间。测定土壤中雌激素的含量，对于食品安全风险控制与评价具有重要意义。土壤中雌激素的含量与土壤的性质、深度、有机质含量等因素有关，不同土壤的雌激素含量可能相差很大。 

近年来，雌激素的仪器检测技术有了很大的提高，如气相色谱-质谱联用(GC/MS)、气相色谱-串联质谱联用(GC/MS/MS)、液相色谱-质谱联用(LC/MS)、液相色谱-串联质谱联用(LC/MS/MS)等，具有较高的灵敏度和精确度。由于土壤样品基体复杂，样品前处理技术在雌激素检测中起着重要的作用，如何高效地从土壤样品中提取雌激素，建立回收率高、重现性好、精确度及精密度高的土壤中痕量天然和合成雌激素分析方法，成为研究的关键。 

发明内容

本发明的目的是针对土壤样品基体复杂，土壤中雌激素痕量存在，前处理技术难度大等问题，拟开发一种回收率高、灵敏度高、准确、快速的分析技术，实现对土壤样品中痕量天然和合成雌激素的定量测定。 

本发明的技术方案如下： 

一种土壤中痕量雌激素含量的检测方法，该方法包括如下步骤： 

(1)土壤样品预处理 

取5g经冷冻干燥后土壤样品，采用快速溶剂萃取仪进行萃取，萃取剂为丙酮，其溶剂量为120-140mL，所采用的快速溶剂萃取条件为：温度60℃，压力1500pis，静态提取2次，各8min。Waters公司的HLB固相萃取柱的活化顺序为：5mL色谱纯乙酸乙酯、5mL色谱纯甲醇及10mL超纯水，流速为1mL/min；取上述快速溶剂萃取仪的萃取液30mL，加入600mL蒸馏水后混匀，采用已活化的固相萃取柱对该混合液进行固相萃取富集，控制流速为3mL/min；萃取结束后真空抽干HLB柱5min，以去除水分；利用2×3mL乙酸乙酯洗脱HLB柱，控制流速为1mL/min，洗脱液收集于10mL玻璃离心管中；洗脱液在氮气流下缓慢吹干，加入200μL乙腈/水(v/v)＝1∶1，漩涡混合；冷藏等待浓度测定。 

(2)利用液相色谱-串联质谱联用分析雌激素浓度 

色谱柱：Nova-Pak C18，3.9mm×150mm×4μm； 

梯度洗脱：采用甲醇和pH＝10的氨水为流动相，甲醇的比例在0-1.2min内由15％升到70％，1.2-2.0min内升到90％，2.0-3.0min内升到98％，3.0-6.1min维持在98％，6.1-6.2min内降至15％，6.2-10min内维持在15％，以上百分比均为体积百分比； 

(3)标准曲线的绘制，以外标法进行定量测定 

(4)样品的测定 

采集待测土壤样品，按步骤(1)对土壤样品进行预处理，再按步骤(2)进行液相色谱-串联质谱联用检测，并与步骤(3)得到的标准曲线比较，通过换算最终得到待测土壤样品中天然和合成雌激素的含量。 

本发明所述的方法还包括：采用同样的土壤样品，采用浸泡加标方式按0.5ng/g的添加量加入标准溶液，进行上述预处理并测定天然和合成雌激含量，进 行回收率计算； 

本发明中所述的天然雌激素为雌酮、17β-雌二醇和雌三醇，合成雌激素为17α-乙炔基雌二醇。 

本发明的有益效果是采用快速溶剂萃取仪进行提取，操作简单，萃取速度快，安全可靠；采用固相萃取柱进行富集，有机溶剂用量少，富集倍数高，操作简单；采用液相色谱-串联质谱联用进行检测，检测限低，具有较高的灵敏度和精确度。本发明提供一种检测限低、重现性好、灵敏度高、回收率较好、操作简单易行的分析方法，能够快速分析土壤中痕量天然和合成雌激素的含量。 

附图说明

图1为200ng/L标准品溶液的色谱图，出峰顺序为E1：5.48min；E2：5.45min；E3：4.75min；EE2：5.37min。 

图2为采用本发明的方法测定回收率的色谱图。 

具体实施方式

下面结合实施例及附图对本发明的技术方案作进一步的描述。 

(1)土壤样品预处理 

采集好的土壤样品先进行冷冻干燥处理。取5g冷冻干燥后的样品，以丙酮为萃取剂进行快速溶剂萃取，其溶剂量为120-140mL，得到丙酮萃取液并测量其体积。所采用的快速溶剂萃取条件为：温度60℃，压力1500pis，静态提取2次，各8min。Waters公司的HLB固相萃取柱的活化顺序为：5mL色谱纯乙酸乙酯、5mL色谱纯甲醇及10mL超纯水，流速为1mL/min。取30Ml上述丙酮提取液加入600mL蒸馏水后混匀，采用已活化的固相萃取柱对该混合液进行固相萃取富集，控制流速为3mL/min。萃取结束后真空抽干5min，以去除水分，利用2×3mL乙酸乙酯洗脱HLB柱，洗脱液收集于10mL玻璃离心管中，控制流速为1mL/min。洗脱液在氮气流下缓慢吹干，加入200μL乙腈/水(v/v)＝1∶1，漩涡混合后，待测。 

(2)利用液相色谱-串联质谱联用分析雌激素浓度 

液相色谱-串联质谱联用选择的条件：3200Qtrap^TM型液相色谱-串联质谱仪，配有电喷雾离子化源(ESI)以及Analyst 1.4.1数据处理软件，美国AppliedBiosystem公司；Agilent 1100高效液相色谱系统，包括四元输液泵，自动进样 器，美国Agilent公司。 

色谱柱：Nova-Pak C18(3.9mm×150mm×4μm)，Waters公司。离子源：电喷雾离子化源(ESI)，负离子方式检测；离子喷射电压：-4500V；温度：450℃；源内气体1(GS1，N₂)压力：45psi；气体2(GS2，N₂)压力：45psi；气帘气体(N₂)压力：20psi；扫描方式为多重反应监测(MRM)；碰撞气(N₂)压力：Medium。采用甲醇和pH＝10的氨水为流动相，梯度洗脱条件详见表1。 

表1流动相梯度条件 

液相色谱-串联质谱联用对4种天然和合成雌激素的最低检测限为200ng/L。 

(3)标准曲线的绘制，以外标法进行定量测定 

所述的外标法标准曲线的绘制：利用分析天平准确称量4种雌激素，溶于色谱纯乙腈内，配置成系列浓度的标准溶液，采用液相色谱-串联质谱联用进行分析，分别以雌激素浓度为横坐标，峰面积为纵坐标进行回归，得到4条标准曲线，用于测定样品中分析物的量。图1为200ng/L标准品溶液的色谱图。 

(4)样品及回收率的测定 

采集待测土壤样品，按步骤(1)对土壤样品进行预处理，再按步骤(2)进行液相色谱-串联质谱联用检测，并与上述得到的标准曲线比较，通过换算最终得到待测土壤样品中痕量天然和合成雌激素的含量。 

采用同样的土壤样品进行冷冻干燥，取5g冷冻干燥后的土壤样品，采用浸泡加标方式按0.5ng/g的添加量加入标准溶液，进行预处理并测定雌激素含量，并按照下式进行回收率计算： 

$R=\frac{{C-C}_0}{0.5}\times 100\%---\left(1\right)$

R-回收率，％； 

C-添加标准溶液土壤样品的雌激素含量，ng/g； 

C₀-未添加标准溶液土壤样品的雌激素含量，ng/g。 

本方法的回收率与最低检测限，如表2所示。图2为采用本发明的方法测定回收率的色谱图。 

表2本方法的回收率和最低检测限 

以下为利用本发明检测农田土壤中痕量雌激素的实施例： 

选取农田土壤，现场分层次(0～10cm、10～20cm、20～30cm)采集新鲜土壤样品，迅速装入密封袋中带回实验室进行处理分析。土壤样品先进行冷冻干燥处理。取5g冷冻干燥后的样品，以丙酮为萃取剂进行快速溶剂萃取，其溶剂量为120-140mL，得到丙酮萃取液并测量其体积。采用快速溶剂萃取条件为：温度60℃，压力1500pis，静态提取2次，各8min。Waters公司的HLB固相萃取柱的活化顺序为：5mL色谱纯乙酸乙酯、5mL色谱纯甲醇及10mL超纯水，流速为1mL/min。取30mL上述丙酮提取液，加入600mL蒸馏水后混匀，采用已活化的固相萃取柱对该混合液进行固相萃取富集，控制流速为3mL/min。萃取结束后真空抽干5min，以去除水分，利用2×3mL乙酸乙酯洗脱HLB柱，洗脱液收集于10mL玻璃离心管中，控制流速为1mL/min。洗脱液在氮气流下缓慢吹干，加入200μL乙腈/水(v/v)＝1∶1，漩涡混合后，待测。 

利用液相色谱-串联质谱联用测定上述待测样品的雌激素浓度。液相色谱-串联质谱联用选择的条件：3200Qtrap^TM型液相色谱-串联质谱仪，配有电喷雾离子化源(ESI)以及Analyst 1.4.1数据处理软件，美国Applied Biosystem公司；Agilent1100高效液相色谱系统，包括四元输液泵，自动进样器，美国Agilent公司。色谱柱：Nova-Pak C18(3.9mm×150mm×4μm)，Waters公司。离子源：电喷雾离子化源(ESI)，负离子方式检测；离子喷射电压：-4500V；温度：450℃；源内 气体1(GS1，N₂)压力：45psi；气体2(GS2，N₂)压力：45psi；气帘气体(N₂)压力：20psi；扫描方式为多重反应监测(MRM)；碰撞气(N₂)压力：Medium。采用甲醇和pH＝10的氨水为流动相，梯度洗脱条件详见表1。计算结果如表3所示。 

表3不同深度农田土壤中雌激素含量(ng/g) 

注：n.d.表示未检出。