一种四联菌片的菌种的活菌数检测方法

摘要

本发明涉及一种检测方法，尤其是一种四联菌片的菌种的活菌数检测方法，属于保健食品领域；本发明的四联菌片的菌种的活菌数检测方法，其中，分别用双歧杆菌筛选培养基、干酪乳杆菌和嗜酸乳杆菌筛选培养基、嗜热链球菌筛选培养基对处理过的四联菌片进行培养，并进行计数；双歧杆菌筛选培养基中添加抗菌素；双歧杆菌筛选培养基在厌氧条件下使用；干酪乳杆菌、嗜酸乳杆菌和嗜热链球菌筛选培养基均需在需氧条件下使用；本发明所述的四联菌片的选择性计数方法，具有很好的鉴别性；能够完成四联菌片中长双歧杆菌、干酪乳杆菌、嗜酸乳杆菌、嗜热链球菌等益生菌的选择性计数；方法简便，结果准确可靠。

说明书

技术领域

本发明涉及一种检测方法，尤其是一种四联菌片的菌种的活菌数检测方 法。属于保健食品领域，具体涉及四联菌片中长双歧杆菌、干酪乳杆菌、嗜 酸乳杆菌、嗜热链球菌等益生菌的选择性计数检测方法。

背景技术

健康有益的益生菌如嗜酸乳杆菌、双歧杆菌、干酪乳杆菌、嗜热链球菌 等被越来越多地添加到保健食品中，通过其中活菌的作用可以改善胃功能、 调整肠道菌群、抑制病原菌的生长、提高蛋白质和维生素的代谢、防止便秘、 缓解乳糖不耐症、抗肿瘤、增强免疫系统、降低胆固醇等，从而促进身体健 康。为了确保此类益生菌能在体内发挥正常的生理保健功能，一些世界性的食 品组织已经提出标准，要求在食品中双歧杆菌等益生菌的最低值为10⁶～ 10⁷CFU/g。因此，研究简便易行的选择性计数方法，加强此类产品的监控，对于提 高产品质量，保护消费者的利益及健康，都具有极其重要的意义。如果产品中只 有单一的菌株，易于计数，至于两株及两株以上的益生菌混合在保健产品中 时分别计出活菌数比较困难，需要通过了解不同菌株的生理特性来选择鉴别 培养基再进行计数。

国内外关于微生物选择性计数的研究主要集中在培养基的设计上，即利用 选择性培养基，使益生菌表现出易于鉴别特征，便于区分计数。这些选择性 鉴别培养基抑制其它菌的生长或者通过在此培养基上形成菌落的形态、大小 及颜色易与其他菌区别，从而可单独的计数出目标菌株的活菌数。细菌计数 常规用的方法主要有涂布法和倾注法，应用于乳酸菌计数，二者结果无差异， 但涂布法由于菌落生长在平板表面，易于从形态上辨认和挑取菌落进行进一 步分离和鉴定，提高计数结果的准确度，更真实反映样品中的乳酸菌数量。

目前已有一些关于混合菌乳制品的选择性计数方法。1978年Teraguch i等 将新霉素-巴龙霉素-萘啶酮酸-氯化锂培养基(NNLP培养基)用于双歧杆菌的 选择计数，该培养基在后来双歧杆菌计数培养基的发展中一直作为一种参考 培养基。Lap ierre等的LP培养基，Chevalier等的改良MRS培养基均用于双歧 杆菌的选择性计数；吕嘉枥等人研究的MRS-柳醇琼脂或MRS-山梨醇琼脂、 添加麦芽糖的MRS-IM培养基，MRS-氯洁霉素用于嗜酸乳杆菌的选择性计数； MRS-万古霉素、LC培养基选择性计数干酪乳杆菌；ST培养基、M17培养基选 择性计数嗜热链球菌。这些培养基虽然可以选择性计数混合益生菌，但由于 菌种的差异性，这些培养基不一定适合于所有的菌株的选择性计数，而且有 些培养基不具有很好的鉴别性，有些培养基配制繁琐成本高，所以有待于更 简便的选择性计数培养基可以准确的计数这些益生菌。

本发明为了对四联菌片等保健食品中的不同益生菌包括长双歧杆菌、干 酪乳杆菌、嗜酸乳杆菌、嗜热链球菌等分别进行可靠计数，研制和开发出简便、 成本低、计数效果显著的鉴别性培养基。

技术方案

本发明的目的在于提供四联菌片中长双歧杆菌、干酪乳杆菌、嗜酸乳杆 菌、嗜热链球菌等益生菌的选择性计数的准确简便的检测方法

本发明是采用三种不同培养基对四联菌片中的不同的四株益生菌(长双 歧杆菌、干酪乳杆菌、嗜酸乳杆菌、嗜热链球菌)进行计数。长双歧杆菌活 菌数的检测是通过在培养基中添加抗生素或其他试剂，使得培养基对其他益生 菌有一定程度的抑制作用，而对长双歧杆菌抑制作用很小或没有抑制作用。 干酪乳杆菌和嗜酸乳杆菌的活菌数检测采用了MRS培养基，需氧培养。在此 培养基上需氧条件下培养42-50h只有干酪乳杆菌和嗜酸乳杆菌生长，且可以通 过菌落形态的不同，能分辨出这两株菌。

本发明是提供了四联菌片的选择性计数检测方法，其特点在于培养基中 添加抗生素抑制其它菌或通过菌落形态分辨出目标菌株。其中检测培养基有 双歧杆菌检测培养基、干酪乳杆菌和嗜酸乳杆菌检测培养基、嗜热链球菌检 测培养基。

本发明的一种四联菌片的菌种的活菌数检测方法，其中，分别用双歧杆 菌筛选培养基、干酪乳杆菌和嗜酸乳杆菌筛选培养基、嗜热链球菌筛选培养 基对处理过的四联菌片进行培养，并进行计数；

其中，双歧杆菌筛选培养基中添加抗菌素；

双歧杆菌筛选培养基在厌氧条件下使用；

干酪乳杆菌、嗜酸乳杆菌和嗜热链球菌筛选培养基需在需氧条件下使用。

其中，利用培养基进行培养的四联菌片包括：均具有菌种活性的四联菌 片和非定向检测的菌失活的四联菌片。

上述的抗菌素为：浓度为0.1-0.3mg/mL的牛胆盐溶液和浓度为 12-18μg/mL的硫酸庆大霉素。

其中双歧杆菌检测培养基的配方为：

其中培养基的配方组份的重量份为：

蛋白胨          6.0-12.0g，

胰胨            6.0-12.0g，

大豆胨          2.0-5.0g，

酵母粉          1.0-3.0g，

牛肉粉          2.0-5.0g，

牛肝粉          2.0-5.0g，

葡萄糖          5-20g，

可溶性淀粉      0.2-0.8g，

磷酸氢二钾      0.5-2g，

磷酸二氢钾      0.5-2g，

硫酸镁          0.1-0.3g，

硫酸亚铁        0.01-0.03g，

L-半胱氨酸       0.2-0.6g，

硫酸锰           0.001-0.002g，

吐温80           0.5-2.0g，

琼脂             15.0-20g。

添加抗菌素牛胆盐和硫酸庆大霉素的终浓度为牛胆盐溶液0.1-0.3mg/mL， 硫酸庆大霉素终浓度12-18μg/mL，培养基的处理方法和使用条件为灭菌 114-116℃，15-20min，pH7.2-7.4±0.1。其中±0.1为可接受的误差范围。

干酪乳杆菌和嗜酸乳杆菌筛选培养基组份的重量份为：

蛋白胨           5-20g，

牛肉粉           4-8g，

酵母粉           4-8g，

葡萄糖           10-30g，

吐温80           0.5-1.5mL，

K₂HPO₃·7H₂O(即，磷酸氢二钾(7H₂O))     1.0-3.0g，

CH₃COONa·3H₂O(即，乙酸钠(3H₂O))       2.0-6.0g，

柠檬酸三铵                             1.0-3.0g，

MgSO₄·7H₂O(即，硫酸镁(7H₂O))          0.1-0.3g，

MnSO₄·4H₂O(即，硫酸锰(4H₂O))          0.03-0.06g，

琼脂           15.0-20g，

蒸馏水         1000mL。

上述的培养基的处理方法和使用条件为：灭菌120-122℃，15-17min；pH 6.4-6.6，考虑到误差，可将pH 6.4-6.6表示为pH 6.4-6.6±0.1。±0.1为误差。

嗜热链球菌培养基培养基的配方组份的重量份为：

上述的培养基的处理方法和使用条件为：灭菌120-122℃，15-17min；pH 6.2-6.4±0.2。

本发明所述方法详述如下：

1、主要设备

恒温培养箱：36℃±1℃

恒温水浴锅：46℃±1℃

厌氧培养装置：厌氧罐

电子天平：感量0.001g

无菌锥形瓶：500mL

无菌平皿：直径90mm

无菌试管(含塞子)15mm×150mm

移液枪(含灭菌枪头)：100μL，1mL

滤菌器：直径0.45μm

微型旋涡混匀器、摇床等。

2、培养基和试剂

双歧杆菌检测培养基；干酪乳杆菌和嗜酸乳杆菌检测培养基

嗜热链球菌检测培养基；PBS溶液。

3、抗菌素

牛胆盐溶液：终浓度为0.1-0.3mg/mL

硫酸庆大霉素：终浓度为12-18μg/mL。

4、按GB/T 4789.35-2008食品中乳酸菌检验、GB/T 4789.34-2008双歧 杆菌检验的操作步骤和菌种鉴定方法进行检测。

5、三种培养基对四联菌片的选择性计数结果表明，双歧杆菌检测培养基 厌氧培养条件下只能选择性计数双歧杆菌，其它三株菌都被抑制，对于双歧 杆菌生长几乎没有抑制作用。在干酪乳杆菌和嗜酸乳杆菌培养基需氧培养条 件下有干酪乳杆菌和嗜酸乳杆菌生长，因此这两株菌的菌落形态差异较显著， 所以通过菌落形态易于分辨。嗜热链球菌培养基需氧培养条件下抑制其它三 株菌，只有嗜热链球菌生长。

本发明所述的四联菌片的选择性计数方法，具有很好的鉴别性。能够完 成四联菌片中长双歧杆菌、干酪乳杆菌、嗜酸乳杆菌、嗜热链球菌等益生菌 的选择性计数；方法简便，结果准确可靠，这些培养基相对于MRS-NNLP培 养基、M17培养基成本低，配置简便，不仅节约成本而且大大降低了工作量。

例如，测嗜酸乳杆菌和干酪乳杆菌活菌数时，其中，嗜酸乳杆菌(NM)和 干酪乳杆菌(LC)在检测培养基上35-38℃需氧培养42-50h后的菌落形态不同。

对于嗜酸乳杆菌和干酪乳杆菌在混合菌中的计数使用MRS培养基，并在 有氧的条件下进行培养42-50h，通过菌落形态来进行分辨这两株菌。嗜酸乳 杆菌在检测培养基上形成不规则形状，不凸起，不湿润，白色或者透明色小 菌落；干酪乳杆菌在检测培养基上形成有规则的圆形，隆起，湿润，光滑的 乳白色大菌落。

又例如，双歧杆菌活菌数的检测，其中，双歧杆菌在双歧杆菌检测培养 基上35-38℃厌氧培养72h后的菌落形态为，在双歧杆菌检测培养基上厌氧培 养48-72h，长双歧杆菌生长。长双歧杆菌在双歧杆菌检测培养基上形成乳白 色圆的隆起的小菌落。

又例如，嗜热链球菌活菌数检测，其中，在嗜热链球菌培养基上需氧培 养18-26h，有嗜热链球菌生长。在培养基上清晰可见红色圆形小菌落为嗜热 链球菌。干酪乳杆菌在此培养基上也生长，但是很难看清，将平皿倾斜才能 看见透明状，模糊的小菌落，所以干酪乳杆菌在嗜热链球菌培养基上的生长 对于嗜热链球菌的计数毫无影响。

本发明检测方法中涉及菌种的分类学特征和其他形态学特征公开如下：

长双歧杆菌(BB20071001)，为分离自内蒙古地区健康人体肠道，筛选出 适合人体之菌株，该长双歧杆菌已于2010年12月14日在国家知识产权局 指定专利微生物保藏中心保藏，保藏号为CGMCC No.4470。

样品的采集与保存：内蒙古锡盟西乌珠穆沁旗12名健康儿童，男女各6 名，年龄3～5岁，均无胃肠病史，采样前两周内未服用任何抗菌类药物。

用无菌玻璃棒挑取自然排出的新鲜粪便5～10g，置入无菌平皿中，迅速 放入厌氧罐中，带回实验室进行分离。

菌株筛选

1、菌株的分离纯化与保存：

取厌氧冻存的样品3g加入有玻璃珠的三角瓶中，加入30mLPBS稀释液 摇床振荡(250rpm)15min，然后吸取1mL便液加入一支装有9mLPBS稀释液 的试管中，漩涡混匀，作为10^-2稀释液，同样方法稀释至10^-4。

取厌氧罐中充分预厌氧的TPY固体平板，将粪便原液、10^-2稀释液、10^-3稀释液、10^-4稀释液各取0.1mL，均匀涂布平板，置厌氧罐中37℃厌氧培养24h。

在选择性TPY培养基上，双歧杆菌的菌落特征较为典型，易与其它菌落 区分开来。双歧杆菌的菌落一般为光滑，凸圆，边缘完整，颜色呈乳褐色或 乳白色，直径2-5mm，具有这些形态特征的菌落被认为是双歧杆菌可疑菌落， 进一步分离纯化得到双岐杆菌纯菌株。

将双歧杆菌纯菌株扩培后用PBS离心洗涤两遍后，悬于保护剂(12％脱 脂乳+0.1％谷氨酸钠)中，真空冷冻干燥，-18℃保存。

2、双歧杆菌的人工胃液耐受性筛选试验结果：

将供试菌株接入pH 2.0、pH 2.5、pH 3.0人工胃液中，37℃厌氧培养3h 对其进行活菌计数，并计算存活率。结果看出，不同菌株在不同pH的人工胃 液中耐受性有显著差异(p＜0.01)。菌株对人工胃液耐受性随pH降低而降低， 其中长双歧杆菌对人工胃液耐受性最强，在pH2.0人工胃液中37℃厌氧保温 3h后存活率达到92.4％，而其它10株菌在此条件下的存活率均小于31.25％， 说明这10株菌对模拟胃液特别敏感，没有进一步筛选的价值，所以仅选择具 有良好耐酸特性的长双歧杆菌作为进一步试验的对象。

3、长双歧杆菌对pH 8.0人工肠液的耐受结果：

将具有良好耐酸特性的长双歧杆菌在pH2.0的人工胃液中厌氧消化3h后， 接入pH8.0的人工肠液中继续37℃厌氧保温消化，分别在不同时间取样计数 并计算其存活率，结果可以看出，长双歧杆菌在pH8.0的人工肠液中37℃厌 氧保温8h后，活菌数与存活率均无明显差异(p＜0.05)，该菌株具有良好的耐 受肠液特性。

分离至儿童粪便中的双歧杆菌的鉴定结果

1、形态及菌落特征

G+，菌体长而弯曲，棍棒状，膨胀或哑铃形的杆菌可分叉，菌落一般为 光滑，凸圆，边缘完整，颜色呈乳褐色或乳白色，直径2-5mm。

2、生理生化学特性，见表1

表1 双歧杆菌的生理生化鉴定结果

注：+表示待测菌株阳性 (+)表示待测菌株弱阳性 -表示待测菌株阴性

根据上表，参照《伯杰氏细菌鉴定手册》，上述得到的菌株为长双歧杆菌。

长双歧杆菌的制备方法(以上为重量百分比)：

1、种子培养基：牛肉膏0.25％、乳糖0.8％、酪蛋白胨1％、大豆蛋白胨0.2％、 酵母粉0.3％、磷酸氢二钠0.20％、磷酸二氢钾0.25％、硫酸镁0.01％、L-半胱氨 酸盐酸盐0.025％、吐温-800.02％、溶解后用25％的氢氧化钠溶液调节 pH7.2-7.4。(注：硫酸镁单独溶解后加入)。

2、发酵液培养基：牛肉膏0.5％、乳糖1％、酪蛋白胨1％、大豆蛋白胨0.5％、 酵母粉0.5％、磷酸氢二钠0.25％、磷酸二氢钾0.25％、硫酸镁0.01％、L-半胱氨 酸盐酸盐0.05％、吐温-800.025％、溶解后用25％的氢氧化钠溶液调pH7.2-7.4。 (注：硫酸镁单独溶解后加入)。121℃15分钟灭菌。

3、发酵及真空冷冻干燥：

一级、二级、三级种子接种量为1-7％，37℃进行发酵，搅拌速度为60 转/分，发酵液PH恒定在5.8，OD₆₀₀2.0以上镜检长双歧杆菌形态正常，无杂 菌，终止发酵。得到的发酵液进行离心，转速为10000转/分，要求上清液清 澈，得到菌泥。再按照菌泥与保护剂为1∶10的比例进行混合为上机液。保护 剂配方各组份重量百分比为谷氨酸钠1％、乳糖8％海藻糖4％、脱脂奶粉 10％、甘油0.1％，其余为水，115℃灭菌15分钟后冷却至10℃。

上机液真空冷冻干燥工艺为：干燥条件-60--40℃预冻1-5h后进行真空 冷冻干燥，冷冻干燥温度为-60℃，真空度为1-8pa，真空冷冻干燥10-28h， 再进行粉碎、混合：粉碎粒度为0.4mm，均可通过40目筛，混合均匀后包装。

嗜热链球菌(QH10-4-1)，一种传统酸奶中分离得到嗜热链球菌，该嗜热 链球菌已于2010年12月14日，在国家知识产权局指定专利微生物保藏中心 保藏，保藏号为CGMCC No.4471。

菌株的分离纯化：

1.样品的采集：2005年8月12日于内蒙古锡林郭勒盟正蓝旗赛音胡都 嘎苏木采集了3份酸奶样品，样品均来自3个不同家庭。采集样品时将做好 的一桶酸奶，搅拌均匀，用无菌移液器吸取5mL于灭菌离心管中，并封口， 每个样品取三份。将收集到的样品立即放入冰盒内，间隔一定时间更换冰袋， 保持在较低的温度下将样品放入4℃冰箱保存，以进行菌株的筛选。

2.嗜热链球菌的筛选：将酸奶样品进行稀释(10^-4，10^-5，10^-6)，在Elliker 琼脂培养基上进行涂布，37℃培养24-48h。对于在Elliker琼脂培养基上生长 的不同菌落进行革兰氏染色，镜检结果革兰氏阳性菌并且细胞为球形的菌落。

3.菌种分离纯化：用无菌接种针挑取单个菌落接种于Elliker液体培养基 中，放入相应的恒温箱中37℃培养18h～24h。连续培养三代后，将菌液振 荡混匀，离心洗涤菌体10min，弃上清液，在沉淀中加入5mL灭菌生理盐 水，振荡混匀，如此重复两次后即将菌液制成供试菌液。将供试菌液振荡混 匀，涂片，固定，革兰氏染色，在显微镜下仔细观察并记录细胞形态和细菌 排列方式。菌落形态一样、革兰氏阳性、球菌分离株进行保存。

4.乳酸菌分离株的保存：分离纯化得到的5株菌在Elliker液体培养基中， 37℃、24h培养2代。4000rpm，离心10min(4℃)，弃上清液，菌体中加入等 量的灭菌生理盐水，振荡混匀，4000rpm离心10min(4℃)离心洗涤菌体，反复 3次，弃上清液，加菌体保护液(含8％乳糖、1％L-谷氨酰胺钠、10％脱脂乳、 1％L-半胱氨酸)约2mL，充分混匀，分装于冻存管中，封口-40℃冷冻保存。

5.耐酸耐胆盐菌株的筛选：向Elliker培养基中加入质量分数为0.3％的胆 盐，并调pH值至3.0，将活化好的菌种按5％接种量接于加胆盐的培养基中； 同时，用不加胆盐、不调pH值的Elliker培养基作对照，培养24h后，涂于 Elliker固体培养基上培养24h后，挑出单个菌落接于斜面上备用。

表2 耐酸耐胆盐菌株的筛选结果

注：+表示生长良好 ±表示生长情况一般 -表示未生长

将分离得到的耐酸耐胆盐的1株菌株St-3进行鉴定。得到鉴定结果如下：

1、形态及菌落特征：圆形菌体，直径0.7～0.9μm。镜检革兰氏阳性成长链状 球菌。

2、生理生化特征：

表3 生理生化鉴定结果表

嗜热链球菌菌粉的制备方法

1、种子培养基：大豆蛋白胨0.25％、牛肉蛋白胨0.15％、乳酪蛋白胨 0.2％、酵母浸膏0.3％、牛肉浸膏0.35％、抗坏血酸0.4％、β-甘油磷酸钠1％、 硫酸镁0.025％、pH 7.2±0.2，再加2％左右琼脂，121℃15min。

2、发酵液培养基：大豆蛋白胨0.5％、牛肉蛋白胨0.25％、乳酪蛋白胨 0.25％、酵母浸膏0.5％、牛肉浸膏0.5％、抗坏血酸0.5％、β-甘油磷酸钠1％、 硫酸镁0.025％、pH 7.2±0.2，再加2％左右琼脂，121℃15min。

3、发酵及真空冷冻干燥：

一级、二级、三级种子接种量为1-7％，37℃进行发酵，搅拌速度为60 转/分，发酵液pH恒定在5.6，OD₆₀₀2.0以上镜检嗜酸乳杆菌形态正常，无杂 菌，终止发酵。得到的发酵液进行离心，转速为10000转/分，要求上清液清 澈，得到菌泥。再按照菌泥与保护剂为1∶10的比例进行混合为上机液。保护 剂配方各组份重量百分比为8％乳糖、1％L-谷氨酰胺钠、10％脱脂乳、1％L- 半胱氨酸其余为水，115℃灭菌15分钟后冷却至10℃。

上机液真空冷冻干燥工艺为：干燥条件-60～-40℃预冻1-5h后进行真空冷 冻干燥，冷冻干燥温度为-60℃，真空度为1-8pa，真空冷冻干燥10-28h，再 进行粉碎、混合：粉碎粒度为0.4mm，即均可通过40目筛，混合均匀后包装。

嗜酸乳杆菌(NM)，从一种传统特色发酵食品-酸粥中分离得到嗜酸乳 杆菌，该嗜酸乳杆菌已于2010年12月14日在国家知识产权局指定专利微生 物保藏中心保藏，保藏号为CGMCC No.4472。

样品的采集：2006年7月2日于内蒙古巴彦淖尔市乌拉特前旗三顶帐 房村采集了5份酸粥样品，样品均来自采用传统工艺制作酸粥的5个不同家 庭。采集样品时将做好的一盆酸粥，搅拌均匀，用无菌移液管吸取10mL酸 粥酸粥于带有胶塞的灭菌试管中，及时将试管封口，每个样品取三份。将收 集到的样品立即放入冰盒内，间隔一定时间更换冰袋，保持在较低的温度下 将样品放入4℃冰箱保存，以进行乳酸菌的筛选。

乳酸菌的分离纯化：用无菌枪头吸取1mL酸粥上清液，接种于5mL的 MRS液体培养基中，30℃恒温培养箱中培养48h～72h后用灭菌接种环蘸 取一环培养物，划线接种于MRS琼脂培养基上，置BBL培养罐中，15℃、 30℃、45℃恒温培养箱中厌氧培养48h～72h，待菌落形成后，观察记录菌 落形态，用无菌接种针挑取单个菌落接种于MRS液体培养基中，放入相应 的恒温箱(15℃、30℃、45℃)中培养18h～24h。连续培养三代后，将菌液振 荡混匀，离心洗涤菌体10min，弃上清液，沉淀中加入5mL灭菌生理盐水， 振荡混匀，重复两次后即将菌液制成供试菌液。将供试菌液振荡混匀，涂片， 固定，革兰氏染色，在光镜下仔细观察并记录细胞形态和细菌排列方式。在 连续培养的同时将第2代的细菌培养物划线接种于MRS固体培养基中，在 相应温度下厌氧培养，待菌落形成后，观察菌落形态，将菌落形态一致的细 菌进行过氧化氢酶试验。将形态一致、菌落形态一样、革兰氏阳性、过氧化 氢酶试验阴性的杆菌分离株和球菌分离株，暂定为乳酸菌属，进行保存。

乳酸菌分离株的保存：分离纯化得到的5株菌在MRS液体培养基中， 37℃、24h培养2代。4000rpm，离心10min(4℃)，弃上清液，菌体中加入等 量的灭菌生理盐水，振荡混匀，再4000rpm离心10min(4℃)离心洗涤菌体， 反复3次，弃上清液，加菌体保护液(含5％乳糖、1％L-谷氨酰胺钠、10％脱 脂乳)约2mL，充分混匀，分装于冻存管中，封口-40℃冷冻保存。

耐酸耐胆盐菌株的筛选：向MRS培养基中加入质量分数为0.3％的胆盐， 并调pH值至3.0，将活化好的菌种按5％接种量接于加胆盐的培养基中；同时， 用不加胆盐、不调pH值的MRS培养基作对照，培养24h后，涂于MRS固体 培养基上培养24h后，挑出单个菌落接于斜面上备用。

表4 耐酸耐胆盐菌株的筛选结果

注：+表示生长良好 ±表示生长情况一般 -表示未生长

乳酸菌的鉴定

将分离得到的耐酸耐胆盐的2株菌株进行鉴定。得到一株嗜酸乳杆菌， 嗜酸乳杆菌鉴定结果如下：

1、形态及菌落特征：杆状，两端园，0.6-0.9×1.5-6μm，以单个链出现。 不运动、无鞭毛，菌落粗糙。显微镜下显示缠绕或微毛丝状物，从好像暗影 的菌堆中心放射出来。深层菌落呈放射或分枝形的不规则状。无特有色素。

2、分离纯化的乳杆菌，经生理生化学特性分析和16S rDNA序列分析的 方法鉴定，其微生物学特性如下表所示：

表5生理生化鉴定结果

嗜酸乳杆菌菌粉的制备方法：

1、种子培养基：蛋白胨10g、葡萄糖6g、酵母粉10g、牛肉膏5g、硫酸镁 0.2g、硫酸锰0.2g、氯化钠0.03g、硫酸亚铁0.015g、醋酸钠4g、柠檬酸二胺2g、 磷酸二氢钾3.5g、吐温-800.1g、纯化水1000mL。1N HCl或NaOH调pH为 6.5±0.05，121℃15分钟灭菌。

2、发酵液培养基：蛋白胨15g、葡萄糖6g、酵母粉8g、牛肉膏6g、硫酸镁 0.2g、硫酸锰0.05g、氯化钠0.04g、硫酸亚铁0.015g、醋酸钠4g、柠檬酸二胺2g、 磷酸二氢钾3.5g、吐温-800.9g、纯化水1000mL。自然PH，121℃15分钟灭菌。

3、发酵及真空冷冻干燥：

一级、二级、三级种子接种量为1-7％，37℃进行发酵，搅拌速度为60 转/分，发酵液PH恒定在5.9，OD₆₀₀2.0以上镜检嗜酸乳杆菌形态正常，无杂 菌，终止发酵。得到的发酵液进行离心，转速为10000转/分，要求上清液清 澈，得到菌泥。再按照菌泥与保护剂为1∶10的比例进行混合为上机液。保护 剂配方各组份重量百分比为谷氨酸钠0.5％、乳糖5％海藻糖8％、脱脂奶粉 10％、甘油0.1％，其余为水，115℃灭菌15分钟后冷却至10℃。

上机液真空冷冻干燥工艺为：干燥条件-60--40℃预冻1-5h后进行真空 冷冻干燥，冷冻干燥温度为-60℃，真空度为1-8pa，真空冷冻干燥10-28h， 再进行粉碎、混合，粉碎粒度为0.4mm，即均可通过40目筛，混合均匀包装。

本发明涉及菌种的分类学特征和其他形态学特征也可参见如下文献：

长双歧杆菌，可参见森永乳业株式会社2001.12.7的JP 374327/2001专利文本 以及CN02822225.3公开的内容。

干酪乳杆菌，可参见《中国乳品工业》2004，(11)“不同地区酸马奶中乳杆 菌的分离及其生物学特性的研究”，孟和毕力格，乌日娜等；以及《中国乳品工 业》，2005，(06)，乌日娜，张和平，孟和毕力格，“酸马奶中乳杆菌Lb.casei.Zhang和 ZL12-1的16S rDNA基因序列及聚类分析”；以及内蒙古农业大学刘桂芳2004 年硕士论文“嗜酸乳杆菌和干酪乳杆菌β-半乳糖苷酶和蛋白水解活性的研究”。

嗜酸乳杆菌，可参见北京三元食品股份有限公司的CN200410000767.0，即 “一种嗜酸乳杆菌及其应用”；以及内蒙古农业大学刘桂芳2004年的硕士论 文“嗜酸乳杆菌和干酪乳杆菌β-半乳糖苷酶和蛋白水解活性的研究”所公开的 内容。

嗜热链球菌，可参见佟潇，《中国乳品工业》2004年03期，“酸奶中嗜热 链球菌的分离和鉴定”；以及弥春霞等，《牡丹江师范学院学报》，2007年第3 期“酸奶中嗜热链球菌的分离和鉴定”。

具体实施方案

本发明实施例中涉及到的菌种，除上述披露的制备方法得到的菌种外， 其余均可通过市售或者其他公开途径得到。

实施例1

四联菌片：将长双歧杆菌、干酪乳杆菌、嗜酸乳杆菌、嗜热链球菌按一 定的比例混合均匀，再与四联菌片其他原料混合，进行压片。将压好的四联 菌片稀释到适宜的稀释度，待测。

长双歧杆菌纯菌片：将长双歧杆菌菌粉和灭活的干酪乳杆菌、灭活的嗜 酸乳杆菌、灭活的嗜热链球菌按一定的比例混合均匀，再与四联菌片其他原 料混合，进行压片。将压好的长双歧杆菌片稀释到适宜的稀释度，待测。

按配方配置培养基

蛋白胨6.0-12.0g、胰胨6.0-12.0g、大豆胨2.0-5.0g、酵母粉1.0-3.0g、牛 肉粉2.0-5.0g、牛肝粉2.0-5.0g、葡萄糖5-20g、可溶性淀粉0.2-0.8g、磷酸氢 二钾0.5-2g、磷酸二氢钾0.5-2g、硫酸镁0.1-0.3g、硫酸亚铁0.01-0.03g、L- 半胱氨酸0.2-0.6g、硫酸锰0.001-0.002g、吐温800.5-2.0g、琼脂15.0-20g，蒸 馏水1000mL、pH 7.2-7.4±0.1、灭菌114-116℃，15-20min。±0.1为误差。

于培养基中添加抗菌素牛胆盐溶液终浓0.1-0.3mg/mL，硫酸庆大霉素终 浓度12-18μg/mL。

按GB/T4789.34-2008双歧杆菌检验的操作步骤和菌种鉴定方法进行检测。 结果如下：

表6 长双歧杆菌活菌数检测结果

实施例2

四联菌片：将长双歧杆菌菌粉、干酪乳杆菌菌粉、嗜酸乳杆菌菌粉、嗜 热链球菌菌粉按一定的比例混合均匀，再与四联菌片其他原料混合，进行压 片。再将压好的四联菌片稀释到适宜的稀释度，待测。

干酪乳杆菌纯菌片：将干酪乳杆菌菌粉和灭活的双歧杆菌菌粉、灭活的 嗜酸乳杆菌菌粉、灭活的嗜热链球菌菌粉按一定比例混合均匀，再与四联菌 片其他原料混合，压片。将压好的干酪乳杆菌片稀释到适宜的稀释度，待测。

培养基的配方为：

蛋白胨5-20g、牛肉粉4-8g、酵母粉4-8g、葡萄糖10-30g、吐温80 0.5-1.5 mL、磷酸氢二钾(7H₂O)1.0-3.0g、乙酸钠(3H₂O)2.0-6.0g、柠檬酸三铵1.0-3.0g、 硫酸镁(7H₂O)0.1-0.3g、硫酸锰(4H₂O)0.03-0.06g、琼脂15.0-20g、蒸馏 水1000mL、120-122℃，15-17min、pH 6.4-6.6±0.1。±0.1为可接受误差。

按GB/T 4789.35-2008食品中乳酸菌检验的操作步骤和菌种鉴定方法进 行检测。结果如下：

表7 干酪乳杆菌活菌数检测结果

实施例3

四联菌片：将长双歧杆菌、干酪乳杆菌、嗜酸乳杆菌、嗜热链球菌按一 定的比例混合均匀，再与四联菌片其他原料混合，进行压片。再将压好的四 联菌片稀释到适宜的稀释度，待测。

嗜酸乳杆菌纯菌片：将嗜酸乳杆菌菌粉和灭活的双歧杆菌菌粉、灭活的 干酪乳杆菌菌粉、灭活的嗜热链球菌菌粉按一定比例混合均匀，再与四联菌 片其他原料混合，压片。将压好的嗜酸乳杆菌片稀释到适宜的稀释度，待测。

培养基的配方为：

蛋白胨5-20g、牛肉粉4-8g、酵母粉4-8g、葡萄糖10-30g、吐温800.5-1.5mL、 磷酸氢二钾(7H₂O)1.0-3.0g、乙酸钠(3H₂O)2.0-6.0g、柠檬酸三铵1.0-3.0g、 硫酸镁(7H₂O)0.1-0.3g、硫酸锰(4H₂O)0.03-0.06g、琼脂15.0-20g、蒸馏水 1000mL、pH 6.4-6.6±0.1、灭菌120-122℃，15-17min。±0.1为可接受误差。

按GB/T 4789.35-2008食品中乳酸菌检验的操作步骤和菌种鉴定方法进 行检测。结果如下：

表8 嗜酸乳杆菌活菌数检测结果

实施例4

四联菌片：将长双歧杆菌、干酪乳杆菌、嗜酸乳杆菌、嗜热链球菌按一 定的比例混合均匀，再与四联菌片其他原料混合，进行压片。再将压好的四 联菌片稀释到适宜的稀释度，待测。

嗜热链球菌纯菌片：将嗜热链球菌菌粉和灭活的双歧杆菌菌粉、灭活的 干酪乳杆菌菌粉、灭活的嗜酸乳杆菌菌粉按一定的比例混合均匀，再与四联 菌片其他原料混合，压片。压好的嗜热链球菌片稀释到适宜的稀释度，待测。

培养基的配方为：

大豆蛋白胨3-6g、牛肉粉2-5g、酵母粉2-5g、葡萄糖10-30g、乳糖10-30g、 碳酸钙5-15g、琼脂15-20g、中性红0.04-0.06g、蒸馏水1000mL、pH 6.2-6.4±0.2、 灭菌120-122℃15-17min。±0.2为可接受误差。

按GB/T 4789.35-2008食品中乳酸菌检验的操作步骤和菌种鉴定方法进 行检测。结果如下：

表9 嗜热链球菌活菌数

四联菌片的培养和其他非检测菌失活两个实验的数据是为了说明检测结 果准确，经过本发明的实施例验证，达到了实际的效果。