一种鱼类持续激活生长激素受体基因及制备方法和用途

摘要

本发明公开了一种鱼类持续激活生长激素受体基因及制备方法和用途。通过对鲤鱼GHR信号肽、c-Jun亮氨酸拉链区以及GHR跨膜区和胞内区分别采取PCR扩增，结合又一轮的搭桥PCR扩增，获得持续激活的GHR重组基因片段；将获得的重组基因克隆入表达载体pCA-AT，获得用于基因转移的重组基因载体pCA-SJG-AT。一种编码的蛋白质，其序列为SEQIDNO:1所示的氨基酸序列，一种分离的重组基因，其序列为SEQIDNO:2所示的核苷酸序列。该重组基因在快速生长转基因鱼中的应用，具有如下优点：（1）重组GHR蛋白的促进信号通路活性高，持续激活的GHR作用比GH作用的效率高3倍以上；（2）持续激活的GHR基因的转基因促生长效应显著，转基因鱼比对照鱼生长速度快50%以上。

说明书

技术领域

本发明属于水产经济动物基因工程育种技术领域，本发明涉及一种持续激活鱼类生 长激素信号通路和促进鱼类生长的重组基因，还涉及该重组基因的制备方法，同时还涉 及一种重组基因在鱼类基因工程育种中的用途。

背景技术

生长速度是水产养殖动物最重要的经济性状之一。在自然捕捞资源有限并日渐匮乏 的情况下，如何提高提高养殖鱼类的生长速度和产量，已成为当前的一个紧迫课题。同 时，提高养殖鱼类的生长速度可以加快商品鱼上市周期和提供更高质量的养殖鱼类新品 种，提高经济效益。因此，通过基因工程的技术研制具有快速生长效应的养殖鱼类新品 种具有重要的实际应用价值(Chen，T.T.，N.H.Vrolijk，et al.(1996).″Transgenic fish and  its application in basic and applied research.″Biotechnol Annu Rev 2：205-236；Fu，C.，W. Hu，et al.(2005).″Developments in transgenic fish in the People′s Republic of China.″Rev Sci Tech 24(1)：299-307.)。

自本实验室在1985年率先开展快速生长转基因鱼研究以来(Zhu，Z.，G.Li，et al. (1985).″Novel gene transfer into the fertilized eggs of gold fish(Carassius auratus L.1758).″ Journal of Applied Ichthyology 1(1)：31-34.)，全球范围内有数十家实验室开展了转基因鱼 相关的研究工作。在一些主养经济鱼类物种，如鲤鱼、罗非鱼、鲶鱼、鲑鱼等30多种 鱼中，都进行了转基因的研究(Zhu，Z.Y.and Y.H.Sun(2000).″Embryonic and genetic  manipulation in fish.″Cell Res 10(1)：17-27.Wu，G.，Y.Sun，et al.(2003).″Growth hormone  gene transfer in common carp.″Aquat.Living Resour 16：416-420.Devlin，R.H.，L.F. Sundstrom，et al.(2006).″Interface of biotechnology and ecology for environmental risk  assessments of transgenic fish.″Trends Biotechnol 24(2)：89-97.)。在所有提高受试鱼生长 速度为目的的研究中，均无一例外地使用了生长激素(GH)基因作为目标基因。然而， 由于GH信号通路的负反馈效应，和受试鱼多样的遗传背景，外源GH基因转移导致的 促生长效应在不同鱼中的效应不尽一致(Devlin，R.H.，C.A.Biagi，et al.(2001).″Growth  ofdomesticated transgenic fish.″Nature 409(6822)：781-782 Devlin，R.H.，D.Sakhrani，et  al.(2009).″Domestication and growth hormone transgenesis cause similar changes in gene  expression in coho salmon(Oncorhynchus kisutch).″Proc Natl Acad Sci U S A 106(9)： 3047-3052.)。

广为所知的是，GH需要与体内生长激素受体(GHR)结合，通过GHR介导的信 号通路的活化来促进机体生长(Lichanska，A.M.and M.J.Waters(2008).″How growth  hormone controls growth，obesity and sexual dimorphism.″Trends Genet 24(1)：41-47.)。 GHR是一种I型细胞因子受体，它由膜外区、跨膜区和胞内区组成。GH通过与GHR 的膜外区相结合使两个GHR蛋白形成二聚体结构，从而导致GHR胞内区JAK2激酶 活性的激活(Herrington，J.and C.Carter-Su(2001).″Signaling pathways activated by the  growth hormone receptor.″Trends Endocrinol Metab 12(6)：252-257.Waters，M.J.，H.N. Hoang，et al.(2006).″New insights into growth hormone action.″J Mol Endocrinol 36(1)： 1-7.)。通过Stat5因子的磷酸化等一系列胞内的信号传导途径，最终激活igfl等靶基因 的转录(Cesena，T.I.，T.X.Cui，et al.(2007).″Multiple mechanisms of growth  hormone-regulated gene transcription.″Mol Genet Metab 90(2)：126-133.)。因此我们提出， 通过将GHR的膜外区用一个特殊的亮氨酸拉链替代，可以使GHR分子持续形成二聚 体结构，从而导致GHR信号通路的持续激活；通过对GHR蛋白进行分子设计，可以 获得更高活性的GHR分子；以这一激活型的GHR分子进行基因转移，则可以获得新 型和高效的快速生长转基因鱼。

发明内容

本发明的目的是在于提供了一种鱼类持续激活生长激素受体(GHR)基因，该持 续激活的GHR分子由“全鱼”GHR信号肽、“全鱼”亮氨酸拉链、“全鱼”GHR跨膜 区和胞内区依序组成，能够在体内持续形成GHR的二聚体结构，从而持续激活GHR 信号通路。

本发明的另一个目的是在于提供了一种鱼类持续激活生长激素受体基因的制备方 法。该方法易行，操作简便。该持续激活的GHR重组基因由编码“全鱼”GHR信号肽、 “全鱼”亮氨酸拉链、“全鱼”GHR跨膜区和胞内区的基因片段依序组成，通过连接型 聚合酶链式(PCR)反应，将这些基因片段无缝连接，形成持续激活的GHR重组基因。

本发明还有一个目的是在于提供了一种鱼类持续激活生长激素受体基因在制备快速 生长转基因斑马鱼(鲤鱼、团头鲂、黄颡鱼)中的应用。该重组基因由于以cJun基因 的亮氨酸拉链结构替换GHR的胞外区，可以持续形成二聚体结构，因此其过表达促进 GH信号通路的活性高，比普通GH转基因促进信号通路的活性高3倍以上。该重组基 因被显微注射入斑马鱼(鲤鱼、团头鲂、黄颡鱼)受精卵中，通过进一步筛选获得快速 生长的转基因鱼。转基因促生长效应显著，转基因斑马鱼(鲤鱼、团头鲂、黄颡鱼)平 均生长速度比对照鱼快50％以上。

为了实现上述的目的，本发明采用了以下技术措施：

通过生物信息学方法，设计了持续激活的重组生长激素受体的蛋白分子。

该重组蛋白分子包含编码鲤鱼GHR信号肽，鲤鱼c-Jun亮氨酸拉链区，鲤鱼GHR 跨膜区和胞内区的基因序列，其氨基酸序列包含如下序列：

1)鲤鱼GHR信号肽：

MAYSLSLGLLYLGLLCGNGLVSARSE

2)鲤鱼c-Jun亮氨酸拉链区：

RIKAERKRLRNRLAATKCRKRKLERISRLEEKVKVLKNDNAGLSNTASVLRDQVAQLKQ KV

3)鲤鱼GHR跨膜区和胞内区：

LRVAQIPSKESTFPTTLVLIFGVIGVVILLVLLIFSQQQRLMVIFLPPIPAPKIKGIDP ELLKNGKLDQLNSLLSSQDMYKPDFYHEDPWVEFIQLDLDDPAEKNESSDTQHLLGLSRSGS SHFLNFKSDNDSGRASCYDPEIPNPKDLASFLPGHSGRGDNHPLVSRSSSSIPDLGFQQTSE VEETPIQTQPAVPSWVNMDFYAQVSDFTPAGGVVLSPGQLNSSPVKKKGEGNEKKIQFQLLS DGAYTSENTARLLSADVPPSPGPEQGYQAFPTQAVEGNLWNGEYLVSANDSQTPCLVPEAPP APILPPVSDYTVVQEVDAQHSLLLNPPSSQPAICPHSPNKHLPVIPTMPMGYLTPDLLGNLN P

其中GHR信号肽可以将重组蛋白分子运输到细胞膜上，c-Jun基因的亮氨酸拉链 区可以使GHR分子持续形成二聚体结构，GHR的跨膜区和胞内区可以传导GHR信号， 从而激活下游信号通路。

一种鱼类持续激活生长激素受体基因的制备方法，其步骤是：

1)引物设计。

为扩增鲤鱼GHR信号肽的引物：

JSP_F：AGATCGATCACCCGGGAGCCACCATGGCTTACTCTCTCTCGCTC

JSP_R：TTTCCGCCTTGATGCGCTCGGATCTTGCAGACACCAG

扩增c-Jun拉链区的引物：

J_F：CAAGATCCGAGCGCATCAAGGCGGAAAGGAAGAG

J_R：CTTGGTATCTGTGCCACTCTCAGGACTTTCTGTTTGAGTTG

为扩增GHR跨膜区和信号传导区的引物：

JG_F：CCTGAGAGTGGCACAGATACCAAGCAAAG

JG_R：GTTCTCGAGATTCATGGGTTCAGGTTTCCCAGAAG

2)对GHR信号肽，c-Jun亮氨酸拉链区，GHR跨膜区和胞内区，分别采取PCR扩 增。

以JSP_F和JSP_R引物对GHR信号肽进行扩增，PCR条件为：95℃预变性4分 钟；95℃变性30秒，66℃复性30秒，68℃延升30秒，13个循环；68℃延升10 分钟；4℃保存。

以J_F和J_R引物对c-Jun亮氨酸拉链区进行扩增，PCR条件为：95℃预变性4分 钟；95℃变性30秒，59℃复性30秒，68℃延升30秒，18个循环；68℃延升10 分钟；4℃保存。

以JG_F和JG_R引物对GHR跨膜区和胞内区进行扩增，PCR条件为：95℃预变 性4分钟；95℃变性30秒，63℃复性30秒，68℃延升90秒，20个循环；68℃ 延升10分钟；4℃保存。

3)对扩增的三个基因片段，采取又一轮PCR扩增，获得持续激活的GHR重组基因 片段。

用JSP_F和JG_R引物进行连接PCR，将GHR信号肽，亮氨酸拉链区，GHR跨膜 区和胞内区连接成一个新的分子片段，PCR扩增条件为：95℃预变性4分钟；95℃ 变性30秒，66-62℃(每个循环降0.5℃)复性30秒，68℃延升90秒，10个循环；95℃ 变性30秒，63℃复性30秒，68℃延升90秒，10个循环；68℃延升10分钟；4℃ 保存。

4)将获得的重组基因片段及人工合成的表达载体pCA-AT连接成重组基因载体 pCA-SJG-AT。

将重组基因片段及人工合成的表达载体pCA-AT用限制性内切酶SmaI和XhoI双酶 切，利用T4连接酶连接(常规方法，分子克隆实验指南，第二版，J.萨姆布鲁克等 著，科学出版社，1993)。转化大肠杆菌TOP10菌株(购自Invitrogen公司)，利用引 物F：CCGCAAAGCGTCTCAAACCAT，R：GTTTCCACACAGCAAGCCCAG进行PCR 筛选阳性克隆，见图2。经序列测定，获得用于基因转移的重组基因载体pCA-SJG-AT。 该重组基因编码一种蛋白质，其序列为SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列；一种分离的 重组基因，其序列为SEQ ID NO：2所示的核苷酸序列。

该序列在SEQ ID NO：2所示的核苷酸序列导入到斑马鱼胚胎中，可以翻译为SEQ ID NO：1所示氨基酸序列的蛋白质。其中GHR信号肽可以将重组蛋白分子运输到细胞 膜上，c-Jun基因的亮氨酸拉链区可以使GHR分子持续形成二聚体结构，GHR的跨膜 区和胞内区可以传导GHR信号，从而激活下游信号通路。该SEQ ID NO.2所示的核苷 酸序列组成的重组基因可以显著促进GH信号通路，利用GH信号通路的靶基因IGF1 的表达水平进行检测，发现重组基因促进GH信号通路的活性比普通GH促进信号通路 的活性高3倍以上，见图3。

一种鱼类持续激活生长激素受体基因在制备快速生长转基因斑马鱼(鲤鱼、团头鲂、 黄颡鱼)中的应用，其步骤是：

1)转基因斑马鱼(鲤鱼、团头鲂、黄颡鱼)的制备。通过显微注射仪和显微注射 法(Zhu Z，Li G，He L，et al.Novel gene transfer into the fertilized eggs of goldfish  (Carassius auratus L.1758).Z angew Ichthyol，1985，1：31-34)将含重组基因的表达载体 pCA-SJG-AT导入斑马鱼(鲤鱼、团头鲂、黄颡鱼)受精卵中。

2)筛选具有快速生长效应的转基因鱼。通过重组基因在受试鱼体内的PCR检测， 筛选获得含有该重组基因且生长快速的转基因鱼。

检测pCA-SJG-AT转基因鱼的引物为：

F：CCGCAAAGCGTCTCAAACCAT，R：GTTTCCACACAGCAAGCCCAG

PCR条件为：

95℃预变性4分钟；95℃变性30秒，58℃复性30秒，72℃延升30秒，35个 循环；72℃延升5分钟。检测电泳图见图4。

3)转基因阳性鱼和对照鱼饲养于同样条件下，每月测定体重，转基因鱼的平均体 重比对照鱼重50％以上。结果见图5。

本发明专利具有如下优点和效果：(1)重组GHR蛋白的促进信号通路活性高，靶 基因的转录分析表明，持续激活的GHR作用比GH作用的效率高3倍以上；(2)持续 激活的GHR基因的转基因促生长效应显著，转基因鱼比对照鱼生长速度快50％以上。

附图说明

图1为一种表达载体pCA-SJG-AT示意图。

注：鲤鱼肌动蛋白基因的启动子，长2513bp；鲤鱼c-Jun基因的亮氨酸拉链区，长 177bp；鲤鱼生长激素受体基因跨膜区和信号传导区，长1107bp；鲤鱼肌动蛋 白基因的终止子区，长696bp。

图2为一种表达载体pCA-SJG-AT的PCR阳性克隆鉴定电泳图。

注：M：DNAMarker DL2000；1：阴性克隆；2-9：阳性克隆。

图3为一种表达载体pCA-SJG-AT促进GH信号通路的活性分析结果。

注：WT：为野生型胚胎；GH：为注射了GH表达载体的胚胎；CA-GHR：为注射 了重组基因载体pCA-SJG-AT的胚胎；Y轴示IGF1表达水平高低。卡方检验 比较两者的IGF1表达水平，**表示两组之间具有统计学上的极显著性差异(P ＜0.01)。

图4为一种表达载体pCA-SJG-AT在转基因鱼中的PCR鉴定电泳图。

注：M：DNAMarker DL2000；1-17：不同的转基因鱼个体。

图5为一种pCA-SJG-AT转基因斑马鱼的生长示意图。

注：WT：为野生型鱼；Jun-GHR：为pCA-SJG-AT转基因鱼。卡方检验比较两者 的体重，**表示两组之间具有统计学上的极显著性差异(P＜0.01)。

具体实施方式

实施例1：

持续激活的重组生长激素受体的重组蛋白的分子设计

通过蛋白质结构预测(http://swissmodel.expasy.org//SWISS-MODEL.html) SWISS-MODEL程序和蛋白质结构分析(http://swissmodel.expasy.org/spdbv/) Swiss-PdbViewer程序，基于我们前期对GHR信号通路的深刻认识，分子设计了持续激 活型的重组生长激素受体分子：

1)鲤鱼GHR信号肽：

MAYSLSLGLLYLGLLCGNGLVSARSE

2)鲤鱼c-Jun亮氨酸拉链区：

RIKAERKRLRNRLAATKCRKRKLERISRLEEKVKVLKNDNAGLSNTASVLRDQVAQLKQ KV

4)鲤鱼GHR跨膜区和胞内区：

LRVAQIPSKESTFPTTLVLIFGVIGVVILLVLLIFSQQQRLMVIFLPPIPAPKIKGIDP ELLKNGKLDQLNSLLSSQDMYKPDFYHEDPWVEFIQLDLDDPAEKNESSDTQHLLGLSRSGS SHFLNFKSDNDSGRASCYDPEIPNPKDLASFLPGHSGRGDNHPLVSRSSSSIPDLGFQQTSE VEETPIQTQPAVPSWVNMDFYAQVSDFTPAGGVVLSPGQLNSSPVKKKGEGNEKKIQFQLLS DGAYTSENTARLLSADVPPSPGPEQGYQAFPTQAVEGNLWNGEYLVSANDSQTPCLVPEAPP APILPPVSDYTVVQEVDAQHSLLLNPPSSQPAICPHSPNKHLPVIPTMPMGYLTPDLLGNLN P

其中GHR信号肽可以将重组蛋白分子运输到细胞膜上，c-Jun基因的亮氨酸拉链 区可以使GHR分子持续形成二聚体结构，GHR的跨膜区和胞内区可以传导GHR信号， 从而激活下游信号通路。

实施例2：

持续激活的GHR重组基因的制备

1)引物设计。

扩增GHR信号肽的引物：

F：CAGATCGATCACCCGGGAGCCACCATGGCTTACTCTCTCTCGCTC

R：TTTCCGCCTTGATGCGCTCGGATCTTGCAGACACCAG

扩增c-Jun拉链区的引物：

F：CAAGATCCGAGCGCATCAAGGCGGAAAGGAAGAG

R：CTTGGTATCTGTGCCACTCTCAGGACTTTCTGTTTGAGTTG

扩增GHR信号传递区的引物：

F：CCTGAGAGTGGCACAGATACCAAGCAAAG

R：GTTCTCGAGATTCATGGGTTCAGGTTTCCCAGAAG

2)对GHR信号肽，c-Jun亮氨酸拉链区，GHR跨膜区和胞内区，分别采取PCR 扩增。

GHR信号肽扩增条件为：95℃预变性4分钟；95℃变性30秒，66℃复性30秒， 68℃延升30秒，13个循环；68℃延升10分钟；4℃保存。

c-Jun亮氨酸拉链区扩增条件为：95℃预变性4分钟；95℃变性30秒，59℃复 性30秒，68℃延升30秒，18个循环；68℃延升10分钟；4℃保存。

GHR跨膜区和胞内区扩增条件为：95℃预变性4分钟；95℃变性30秒，63℃ 复性30秒，68℃延升90秒，20个循环；68℃延升10分钟；4℃保存。

3)对扩增的3个基因片段，采取又一轮PCR扩增，获得持续激活的GHR重组基 因片段。

用连接PCR的方法将GHR信号肽，亮氨酸拉链区，GHR跨膜区和胞内区连接成 一个新的分子片段，扩增条件为：95℃预变性4分钟；95℃变性30秒，66-62℃(每 个循环降0.5℃)复性30秒，68℃延升90秒，10个循环；95℃变性30秒，63℃复性 30秒，68℃延升90秒，10个循环；68℃延升10分钟；4℃保存。

4)将获得的重组基因克隆入改造后的表达载体pCA-AT，获得用于基因转移的重 组基因。

将重组基因片段及人工合成的表达载体pCA-AT用限制性内切酶SmaI和XhoI双 酶切，利用T4连接酶连接(常规方法，分子克隆实验指南，第二版，J.萨姆布鲁克 等著，科学出版社，1993)。转化大肠杆菌菌株，利用引物F： CCGCAAAGCGTCTCAAACCAT，R：GTTTCCACACAGCAAGCCCAG进行PCR筛选 阳性克隆，见图2。经序列测定，获得用于基因转移的重组基因载体pCA-SJG-AT。该 重组基因编码一种蛋白质，其序列为SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列；一种分离的重 组基因，其序列为SEQ ID NO：2所示的核苷酸序列。在SEQ ID NO：2所示的核苷酸序 列导入到斑马鱼胚胎中，可以翻译为SEQ ID NO：1所示氨基酸序列的蛋白质，其中GHR 信号肽可以将重组蛋白分子运输到细胞膜上，c-Jun基因的亮氨酸拉链区可以使GHR 分子持续形成二聚体结构，GHR的跨膜区和胞内区可以传导GHR信号，从而激活下游 信号通路。SEQ ID NO：2所示的核苷酸序列的重组基因表达促进GH信号通路的活性比 普通GH促进信号通路的活性高3倍以上，见图3。该持续激活的GHR重组基因载体 pCA-SJG-AT如图1所示。

实施例3：

一种持续激活的生长激素受体基因在斑马鱼中的应用。

1)转基因斑马鱼的制备：

以斑马鱼为对象，制备转持续激活GHR基因斑马鱼。将表达载体pCA-SJG-AT经 质粒小量制备试剂盒(Axygen公司)提取质粒DNA后，溶于ST溶液(88mmol/l NaCl， 10mmol/l Tris-HCl，pH 7.5)中，调节其终浓度为85ng/μl，采用显微注射的方法(Zhu Z， Li G，He L，et al.Novel gene transfer into the fertilized eggs of goldfish(Carassius auratus  L.1758).Z angew Ichthyol，1985，1：31-34)，在第一次卵裂前将DNA溶液导入斑马鱼受 精卵动物极，DNA注射剂量1-2nl/卵，完成显微操作后的受精卵置于28.5℃水温孵化 和养殖。

2)快速生长转持续激活GHR基因鱼的筛选：

在鱼缸中养殖3个月后，取约0.1-0.2cm²上述转基因鱼尾鳍组织，参考常规酚/氯 仿法提取DNA，进行转基因检测。常规酚/氯仿法：在1.5ml管中加入0.4ml DNA抽 提掖(10mmol/L EDTA，10mmol/L Tris·HCl，300mmol/L NaCl，2％(重量体积比 g/L)SDS)，55℃水浴1-2h后，于37℃水浴消化过夜；消化的组织液分别用酚、酚/ 氯仿、氯仿个抽提一次；加入2.5倍体积酒精，将沉淀立即放入另一离心管中；然后加 入70％(体积比)乙醇洗涤一次，高速离心1min；倒尽乙醇，37℃恒温培养箱放置15 min，加入适当体积含RNase的TE(含RNase，20mg/ml)溶解DNA。

采用PCR技术检测pCA-SJG-AT在转基因鱼中的整合情况。正向检测引物为 (CCGCAAAGCGTCTCAAACCAT)，反向检测引物为 (GTTTCCACACAGCAAGCCCAG)。

PCR反应条件如下：95℃预变性4分钟；95℃变性30秒，58℃复性30秒，72℃ 延升30秒，35个循环；72℃延升5分钟。目的片段长度为311bp，证实pCA-SJG-AT 整合到转基因鱼基因组中。

将经PCR检测获得的P₀代转基因鱼及其对照鱼分别在同等条件下养殖，约20％的 转基因鱼比对照鱼最大个体大，平均体重是对照鱼的1.5倍以上。

将上述快速生长的转pCA-SJG-AT基因鱼在养殖至性成熟后，与对照鱼杂交，筛选 转基因阳性的F₁代转基因鱼并继续养殖，从而获得具有快速生长特性的转基因鱼家系。

实施例4：

一种持续激活的生长激素受体基因在快速生长转基因鲤鱼、团头鲂或黄颡鱼中的应用。

1)转基因鲤鱼、团头鲂或黄颡鱼的制备

以中国重要的经济性养殖鱼类鲤鱼、团头鲂和黄颡鱼为对象，制备转持续激活GHR 基因鲤鱼、团头鲂和黄颡鱼。将表达载体pCA-SJG-AT经质粒小量制备试剂盒(Axygen 公司)提取质粒DNA后，溶于ST溶液(88mmol/l NaCl，10mmol/l Tris-HCl，pH 7.5) 中，调节其终浓度为85ng/μl，采用显微注射的方法(Zhu Z，Li G，He L，et al.Novel gene  transfer into the fertilized eggs of goldfish(Carassius auratus L.1758).Z angew Ichthyol， 1985，1：31-34)，在第一次卵裂前将DNA溶液导入鲤鱼(团头鲂、黄颡鱼)受精卵动 物极，DNA注射剂量1-2nl/卵，完成显微操作后的受精卵按常规方法进行孵化和养殖(申 玉春，2008，鱼类增养殖学，中国农业出版社)。

2)快速生长转持续激活GHR基因鱼的筛选：

将pCA-SJG-AT载体通过显微操作转入鲤鱼、团头鲂或黄颡鱼受精卵后，室温(20-25 ℃，以下相同)孵化，后置于鱼塘中养殖。在鱼塘中养殖3个月后，取约0.1-0.2cm²上述转基因鱼尾鳍组织，参考常规酚/氯仿法提取DNA，进行转基因检测。常规酚/氯仿 法：在1.5ml管中加入0.4ml DNA抽提掖(10mmol/L EDTA，10mmol/L Tris·HCl， 300mmol/LNaCl，2％(重量体积比g/L)SDS)，55℃水浴1-2h后，于37℃水浴消化 过夜；消化的组织液分别用酚、酚/氯仿、氯仿个抽提一次；加入2.5倍体积酒精，将 沉淀立即放入另一离心管中；然后加入70％(体积比)乙醇洗涤一次，高速离心1min； 倒尽乙醇，37℃恒温培养箱放置15min，加入适当体积含RNase的TE (含RNase，20 mg/ml)溶解DNA。

采用PCR技术检测pCA-SJG-AT在转基因鱼中的整合情况。正向检测引物为 (CCGCAAAGCGTCTCAAACCAT)，反向检测引物为 (GTTTCCACACAGCAAGCCCAG)。

PCR反应条件如下：95℃预变性4分钟；95℃变性30秒，58℃复性30秒，72℃ 延升30秒，35个循环；72℃延升5分钟。目的片段长度为311bp，证实pCA-SJG-AT 整合到转基因鱼基因组中。

将经PCR检测获得的P₀代转基因鱼及其对照鱼分别在相同池塘中按同等养殖方法 常规养殖(申玉春，2008，鱼类增养殖学，中国农业出版社)。在池塘中经1年期的养殖 观察，约20％的转基因鱼比对照鱼最大个体大，平均体重是对照鱼的1.5倍以上。

将上述快速生长的转pCA-SJG-AT基因鱼在池塘养殖至性成熟后，与对照鱼杂交， 筛选转基因阳性的F₁代转基因鱼并继续养殖，从而获得具有快速生长特性的转基因鱼 家系。鲤鱼、团头鲂和黄颡鱼的养殖及繁殖等均按常规操作进行(申玉春，2008，鱼类 增养殖学，中国农业出版社)。

SEQUENCE LISTING

 

<110> 中国科学院水生生物研究所

<120> 一种鱼类持续激活生长激素受体基因及制备方法和用途

<130> 一种鱼类持续激活生长激素受体基因及制备方法和用途

<160>  2    

<170>  PatentIn version 3.1

 

<210>  1

<211>  457

<212>  PRT

<213> 鲤鱼

 

<220>

<221>  signal peptide of common carp GHR

<222>  (1)..(26)

<223> 

 

<220>

<221>  Leucine zipper domain of common carp c-Jun

<222>  (27)..(87)

<223> 

 

<220>

<221>  common carp GHR transmembrane and intracellular domain

<222>  (88)..(457)

<223> 

 

<400>  1

Met Ala Tyr Ser Leu Ser Leu Gly Leu Leu Tyr Leu Gly Leu Leu Cys

1               5                   10                  15     

Gly Asn Gly Leu Val Ser Ala Arg Ser Glu Arg Ile Lys Ala Glu Arg

            20                  25                  30         

Lys Arg Leu Arg Asn Arg Leu Ala Ala Thr Lys Cys Arg Lys Arg Lys

        35                  40                  45             

Leu Glu Arg Ile Ser Arg Leu Glu Glu Lys Val Lys Val Leu Lys Asn

    50                  55                  60                 

Asp Asn Ala Gly Leu Ser Asn Thr Ala Ser Val Leu Arg Asp Gln Val

65                  70                  75                  80 

Ala Gln Leu Lys Gln Lys Val Leu Arg Val Ala Gln Ile Pro Ser Lys

                85                  90                  95     

Glu Ser Thr Phe Pro Thr Thr Leu Val Leu Ile Phe Gly Val Ile Gly

            100                 105                 110        

Val Val Ile Leu Leu Val Leu Leu Ile Phe Ser Gln Gln Gln Arg Leu

        115                 120                 125            

Met Val Ile Phe Leu Pro Pro Ile Pro Ala Pro Lys Ile Lys Gly Ile

    130                 135                 140                

Asp Pro Glu Leu Leu Lys Asn Gly Lys Leu Asp Gln Leu Asn Ser Leu

145                 150                 155                 160

Leu Ser Ser Gln Asp Met Tyr Lys Pro Asp Phe Tyr His Glu Asp Pro

                165                 170                 175    

Trp Val Glu Phe Ile Gln Leu Asp Leu Asp Asp Pro Ala Glu Lys Asn

            180                 185                 190        

Glu Ser Ser Asp Thr Gln His Leu Leu Gly Leu Ser Arg Ser Gly Ser

        195                 200                 205            

Ser His Phe Leu Asn Phe Lys Ser Asp Asn Asp Ser Gly Arg Ala Ser

    210                 215                 220                

Cys Tyr Asp Pro Glu Ile Pro Asn Pro Lys Asp Leu Ala Ser Phe Leu

225                 230                 235                 240

Pro Gly His Ser Gly Arg Gly Asp Asn His Pro Leu Val Ser Arg Ser

                245                 250                 255    

Ser Ser Ser Ile Pro Asp Leu Gly Phe Gln Gln Thr Ser Glu Val Glu

            260                 265                 270        

Glu Thr Pro Ile Gln Thr Gln Pro Ala Val Pro Ser Trp Val Asn Met

        275                 280                 285            

Asp Phe Tyr Ala Gln Val Ser Asp Phe Thr Pro Ala Gly Gly Val Val

    290                 295                 300                

Leu Ser Pro Gly Gln Leu Asn Ser Ser Pro Val Lys Lys Lys Gly Glu

305                 310                 315                 320

Gly Asn Glu Lys Lys Ile Gln Phe Gln Leu Leu Ser Asp Gly Ala Tyr

                325                 330                 335    

Thr Ser Glu Asn Thr Ala Arg Leu Leu Ser Ala Asp Val Pro Pro Ser

            340                 345                 350        

Pro Gly Pro Glu Gln Gly Tyr Gln Ala Phe Pro Thr Gln Ala Val Glu

        355                 360                 365            

Gly Asn Leu Trp Asn Gly Glu Tyr Leu Val Ser Ala Asn Asp Ser Gln

    370                 375                 380                

Thr Pro Cys Leu Val Pro Glu Ala Pro Pro Ala Pro Ile Leu Pro Pro

385                 390                 395                 400

Val Ser Asp Tyr Thr Val Val Gln Glu Val Asp Ala Gln His Ser Leu

                405                 410                 415    

Leu Leu Asn Pro Pro Ser Ser Gln Pro Ala Ile Cys Pro His Ser Pro

            420                 425                 430        

Asn Lys His Leu Pro Val Ile Pro Thr Met Pro Met Gly Tyr Leu Thr

        435                 440                 445            

Pro Asp Leu Leu Gly Asn Leu Asn Pro

    450                 455        

 

<210>  2

<211>  8246

<212>  DNA

<213> 人工合成

 

<220>

<221>  leucine zipper domain of common carp c-Jun

<222>  (2876)..(3052)

<223> 

 

<220>

<221>  transmembrane and intra-cellular domain of common carp GHR

<222>  (3059)..(4165)

<223> 

 

<220>

<221>  signal peptide of common carp GHR

<222>  (2792)..(2869)

<223> 

 

<400>  2

aagctttggt caagaaccag aggtgtaaag tacttgagta attttacttg attactgtac     60

ttaagtatta tttttgggga tttttacttt acttgagtac aattaaaaat caatactttt    120

acttttactt aattacattt ttttagaaaa aaaagtactt tttactcctt acaattttat    180

ttacagtcaa aaagtactta ttttttggag atcacttcat tctattttcc cttgctatta    240

ccaagctttt agaccttctt acttttgggg attatataag tattttctca ataaatatct    300

catatcttac tgtggtttaa ctgctgaatc taaaatttta atacaaaagt agttatattt    360

gttgtacatt gtaaactata acttaacttc agtttcagag aaactcatgt gctcaaaatg    420

taaaaaaagt ttcctgttaa atattttgta aatgtattga agacaaaata agaaaaaaaa    480

aatataagcc actaaatcac actgtccttg gtatcagcaa gagattctga cataatcagc    540

tgtttttgtt tattactgcc attgaaggcc atgtgcatta gtcccaagtt acacattaaa    600

aagtcacatg tagcttacca acatcagtgc tgttcaagca cagcctcatc tactattcaa    660

actgtggcac catctaaaat atgccagaat ttttttattt aatgaatttg accctgaaat    720

atgtattaat atcactcctg tgattttttt gtaatcagct tacaattaca ggaatgcaag    780

cctgattcat tacaagtttc actacacttt ctctgacaac atcacctact gaactcagac    840

cagctagttg ctccttaagt atacaatcat gtcactaatc ctcatttcaa tgaaaaatac    900

ccctattgta cttggtactt ggtagataac cacagagcag tattatgcca ttattgtgaa    960

tacaataaga ggtaaatgac ctacagagct gctgctgctg ttgtgttaga ttgtaaacac   1020

agcacaggat caaggaggtg tccatcacta tgaccaatac tagcactttg cacaggctct   1080

ttgaaaggct gaaaagagcc ttattggcgt tatcacaaca aaatacgcaa atacggaaaa   1140

caacgtattg aacttcgcaa acaaaaaaca gcgattttga tgaaaatcgc ttagggatcc   1200

ccccttgctc ttcaaacaat ccagcttctc cttctttcac tctcaagttg caagaagcaa   1260

gtgtagcaat gtgcacgcga cagccgggtg tgtgacgctg gaccaatcag agcgcagagc   1320

tccgaaagtt taccttttat ggctagagcc gggcatctgc cgtcatataa aagagcgcgc   1380

ccagcgtctc agcctcactt tgagctcctc cacacgcagc tagtgcggaa tatcatctgc   1440

ctgtaaccca ttctctaaag tcgacaaacc cccccaaacc taaggtgagt tgatctttaa   1500

gctagctttt tacattttca gctcgcatat atcaattcga acgtttaatt agaatgttta   1560

aataaagcca gattaaatga ttaggctcag ttaccggtct tttttttctc atttacgtgc   1620

gaactctgct taaactctag ttattcttta ttaatatgtg gttattttta tatatgtatg   1680

tgttatcata actgtactgg ctatgtcagg tggtaatgac tgtaacgtta cgttactcgt   1740

tgtaggcacg acattgaatg ggccggtgtt gaaataagtc ttcaacccct tttaacctca   1800

aaatgtgctc tggttaacaa ggattttaac agctatcagt atgactgtgc ggttttaaag   1860

ccgttagtga ggcacgttgc acacttgatg gatggccgga atgggaagtt ctttatgcag   1920

gcagtgctgc agcagggtgt gacctacttt agctaacgtt agccggctaa ccagcattca   1980

tctgccggta acttgagtct aatattctct catgtgatat cgaagtgatc aaagacacgt   2040

ctgttagctc actttaacca actgtagtga aaaatagcgc agtgtgcagc ccttcagtct   2100

ttcatttagg ctgattattc aatcatttta ttaactatta acgcgttact aaacgtaagg   2160

taacgtagtc agtttttaat aactggtgaa aagtactggt tgggtttaaa tggtgactta   2220

taattgtgtt ggagggggaa acctttttga taaaggctat ataatctcaa atgaatgggc   2280

tgaggatggt gttcacaggt gctttagtga agtccgctcg tgaagagtcg ctgaagtgac   2340

tgcagatctg tgacgcagtc gttttgggca gacggccgtt gaaattcggt tgagtaattg   2400

ataccaggtg aggctagagg atgtagaaat tcatttgtgt agaatttagg gagtggccct   2460

ggcgtgatga atgtcgaaat ccgttccttt ttactgaacc ctatgtctct ggctgagtgc   2520

cacaccgccg gcagccgcaa agcgtctcaa accattgcct tttatggtaa taatgagaat   2580

gcagagggac ttcctttgtc tggcacatct gaggcgcgca ttgtcacact agcacccact   2640

agcggtcaga ctgcagattg cagcacgaaa caggaagctg actccacatg gtcacatgct   2700

cactgaagtg ttgacttccc tgacagctgt gcactttcta aaccggtttt ctcattcatt   2760

tacagttcag atcgatcacc cgggagccac catggcttac tctctctcgc tcggtctgct   2820

ctacctgggc ttgctgtgtg gaaacggact ggtgtctgca agatccgagc gcatcaaggc   2880

ggaaaggaag aggctccgga accgactggc ggccaccaaa tgccgcaagc gcaaactgga   2940

acgcatctcc cggctggagg agaaagtgaa ggtgctcaag aacgacaacg ccggcctgtc   3000

caacaccgcc tccgtcctgc gggaccaggt ggcccaactc aaacagaaag tcctgagagt   3060

ggcacagata ccaagcaaag aatcaacgtt cccgacgacg ttggtgttga tttttggagt   3120

gattggagtg gtgattcttc ttgtcctcct catcttctct caacaacaga ggttgatggt   3180

aatattttta ccacctattc ctgcacctaa aataaaaggc atcgacccag agctgctgaa   3240

gaatggaaag cttgaccagc tcaattcttt gctgagcagt caggatatgt acaagccgga   3300

cttctaccat gaggatccat gggtggagtt catccagctg gaccttgatg accctgcaga   3360

gaagaatgag agttctgata cacaacatct gctgggcttg tctcgctcag gctcttctca   3420

cttccttaat ttcaaaagtg acaacgattc gggtcgtgct agctgctacg acccagaaat   3480

cccaaatccc aaggacttgg cttcttttct gcctggccat tcaggacgag gagataacca   3540

ccctctggtt tccagaagca gctcatccat ccctgatctt ggtttccagc agacatcaga   3600

agtggaggag actcccattc aaacgcaacc agctgtgccc agctgggtta acatggactt   3660

ttatgcccaa gtaagtgatt tcacaccagc aggaggtgtc gtgctttcac ctggacaact   3720

gaacagctct ccagtgaaaa agaagggaga agggaatgag aagaagatac aattccagtt   3780

gctttccgat ggagcctaca cctcagagaa cacagccagg ctgctttctg ccgatgtgcc   3840

acccagccct ggtcctgagc aggggtacca agcattccca acccaagccg ttgaggggaa   3900

cctctggaat ggtgagtacc tggtgtccgc caatgattcc cagacgccgt gcctggttcc   3960

tgaagctcct ccagccccca tactgccacc agtatcagac tatactgtag tgcaggaagt   4020

ggatgcccag cacagcctcc tcctgaatcc tccttcctca cagcctgcga tatgccctca   4080

cagcccaaac aaacatctcc ctgtaatccc aaccatgccc atggggtacc tcaccccaga   4140

ccttctggga aacctgaacc catgaatctc gagaaagcgg ccgcacggac tgttaccact   4200

tcacgccgac tcaactgcgc agagaaaaac ttcaaacgac aacattggca tggcttttgt   4260

tatttttggc gcttgactca ggatctaaaa actggaacgg cgaaggtgac ggcaatgttt   4320

tggcaaataa gcatccccga agttctacaa tgcatctgag gactcaatgt tttttttttt   4380

tttttttctt tagtcattcc aaatgtttgt taaatgcatt gttccgaaac ttatttgcct   4440

ctatgaaggc tgcccagtaa ttgggagcat acttaacatt gtagtattgt atgtaaatta   4500

tgtaacaaaa caatgactgg gtttttgtac tttcagcctt aatcttgggt tttttttttt   4560

ttttggttcc aaaaaactaa gctttaccat tcaagatgta aaggtttcat tccccctggc   4620

atattgaaaa agctgtgtgg aacgtggcgg tgcagacatt tggtggggcc aacctgtaca   4680

ctgactaatt caaataaaag tgcacatgta agacatccta ctctgtgtga tttttctgtt   4740

tgtgctgagt gaacttgcta tgaagtcttt tagtgcactc tttaataaaa gtagtcttcc   4800

cttaaagtgt cccttccctt atggccttca catttctcaa ctagcgcttc aactagaaag   4860

cactttaggg actgggatgc tctagacagg ataaaacctt gtatgcattt catttaatgt   4920

tttttgagat taaaagctta aacaagaatc tctagttttc tttcttgctt ttacttttac   4980

ttccttaata ctcaagtaca attttaatgg agtacttttt tacttttact caagtaagat   5040

tctagccaga tacttttact tttaattgag taaaattttc cctaagtact tgtactttca   5100

cttgagtaaa atttttgagt actttttaca cctctgtcaa gaactcctgg acaaagaatt   5160

cgtaatcatg tcatagctgt ttcctgtgtg aaattgttat ccgctcacaa ttccacacaa   5220

catacgagcc ggaagcataa agtgtaaagc ctggggtgcc taatgagtga gctaactcac   5280

attaattgcg ttgcgctcac tgcccgcttt ccagtcggga aacctgtcgt gccagctgca   5340

ttaatgaatc ggccaacgcg cggggagagg cggtttgcgt attgggcgct cttccgcttc   5400

ctcgctcact gactcgctgc gctcggtcgt tcggctgcgg cgagcggtat cagctcactc   5460

aaaggcggta atacggttat ccacagaatc aggggataac gcaggaaaga acatgtgagc   5520

aaaaggccag caaaaggcca ggaaccgtaa aaaggccgcg ttgctggcgt ttttccatag   5580

gctccgcccc cctgacgagc atcacaaaaa tcgacgctca agtcagaggt ggcgaaaccc   5640

gacaggacta taaagatacc aggcgtttcc ccctggaagc tccctcgtgc gctctcctgt   5700

tccgaccctg ccgcttaccg gatacctgtc cgcctttctc ccttcgggaa gcgtggcgct   5760

ttctcatagc tcacgctgta ggtatctcag ttcggtgtag gtcgttcgct ccaagctggg   5820

ctgtgtgcac gaaccccccg ttcagcccga ccgctgcgcc ttatccggta actatcgtct   5880

tgagtccaac ccggtaagac acgacttatc gccactggca gcagccactg gtaacaggat   5940

tagcagagcg aggtatgtag gcggtgctac agagttcttg aagtggtggc ctaactacgg   6000

ctacactaga agaacagtat ttggtatctg cgctctgctg aagccagtta ccttcggaaa   6060

aagagttggt agctcttgat ccggcaaaca aaccaccgct ggtagcggtg gtttttttgt   6120

ttgcaagcag cagattacgc gcagaaaaaa aggatctcaa gaagatcctt tgatcttttc   6180

tacggggtct gacgctcagt ggaacgaaaa ctcacgttaa gggattttgg tcatgagatt   6240

atcaaaaagg atcttcacct agatcctttt aaattaaaaa tgaagtttta aatcaatcta   6300

aagtatatat gagtaaactt ggtctgacag ttaccaatgc ttaatcagtg aggcacctat   6360

ctcagcgatc tgtctatttc gttcatccat agttgcctga ctccccgtcg tgtagataac   6420

tacgatacgg gagggcttac catctggccc cagtgctgca atgataccgc gagacccacg   6480

ctcaccggct ccagatttat cagcaataaa ccagccagcc ggaagggccg agcgcagaag   6540

tggtcctgca actttatccg cctccatcca gtctattaat tgttgccggg aagctagagt   6600

aagtagttcg ccagttaata gtttgcgcaa cgttgttgcc attgctacag gcatcgtggt   6660

gtcacgctcg tcgtttggta tggcttcatt cagctccggt tcccaacgat caaggcgagt   6720

tacatgatcc cccatgttgt gcaaaaaagc ggttagctcc ttcggtcctc cgatcgttgt   6780

cagaagtaag ttggccgcag tgttatcact catggttatg gcagcactgc ataattctct   6840

tactgtcatg ccatccgtaa gatgcttttc tgtgactggt gagtactcaa ccaagtcatt   6900

ctgagaatag tgtatgcggc gaccgagttg ctcttgcccg gcgtcaatac gggataatac   6960

cgcgccacat agcagaactt taaaagtgct catcattgga aaacgttctt cggggcgaaa   7020

actctcaagg atcttaccgc tgttgagatc cagttcgatg taacccactc gtgcacccaa   7080

ctgatcttca gcatctttta ctttcaccag cgtttctggg tgagcaaaaa caggaaggca   7140

aaatgccgca aaaaagggaa taagggcgac acggaaatgt tgaatactca tactcttcct   7200

ttttcaatat tattgaagca tttatcaggg ttattgtctc atgagcggat acatatttga   7260

atgtatttag aaaaataaac aaataggggt tccgcgcaca tttccccgaa aagtgccacc   7320

tgacgtctaa gaaaccatta ttatcatgac attaacctat aaaaataggc gtatcacgag   7380

gccctttcgt ctcgcgcgtt tcggtgatga cggtgaaaac ctctgacaca tgcagctccc   7440

ggagacggtc acagcttgtc tgtaagcgga tgccgggagc agacaagccc gtcagggcgc   7500

gtcagcgggt gttggcgggt gtcggggctg gcttaactat gcggcatcag agcagattgt   7560

actgagagtg caccataaaa ttgtaaacgt taatattttg ttaaaattcg cgttaaattt   7620

ttgttaaatc agctcatttt ttaaccaata ggccgaaatc ggcaaaatcc cttataaatc   7680

aaaagaatag cccgagatag ggttgagtgt tgttccagtt tggaacaaga gtccactatt   7740

aaagaacgtg gactccaacg tcaaagggcg aaaaaccgtc tatcagggcg atggcccact   7800

acgtgaacca tcacccaaat caagtttttt ggggtcgagg tgccgtaaag cactaaatcg   7860

gaaccctaaa gggagccccc gatttagagc ttgacgggga aagccggcga acgtggcgag   7920

aaaggaaggg aagaaagcga aaggagcggg cgctagggcg ctggcaagtg tagcggtcac   7980

gctgcgcgta accaccacac ccgccgcgct taatgcgccg ctacagggcg cgtactatgg   8040

ttgctttgac gtatgcggtg tgaaataccg cacagatgcg taaggagaaa ataccgcatc   8100

aggcgccatt cgccattcag gctgcgcaac tgttgggaag ggcgatcggt gcgggcctct   8160

tcgctattac gccagctggc gaaaggggga tgtgctgcaa ggcgattaag ttgggtaacg   8220

ccagggtttt cccagtcacg acgttg                                        8246