重组小分子泛素样修饰物蛋白酶及其制备方法和应用

摘要

本发明公开了一种重组小分子泛素样修饰物蛋白酶及其制备方法和应用。该重组蛋白酶由GST标签、ULP1P序列和多聚His标签组成，其氨基酸序列为SEQ ID NO：2所示。本发明重组SUMO蛋白酶识别完整的SUMO标签蛋白序列，并能高效地把SUMO从融合蛋白上切割下来，与EK和TEV等蛋白酶的识别位点相比，该酶切反应有很高的特异性，且在较宽范围的反应环境体系中保持较高的活力。本发明重组SUMO蛋白酶不但具有多聚His标签，便于融合蛋白切割后的亲和层析纯化，还有谷胱甘肽转移酶GST标签，方便蛋白酶的纯化，也增强了酶的稳定性。

说明书

技术领域

本发明涉及一种重组蛋白酶，尤其涉及一种重组小分子泛素样修饰 物蛋白酶及其制备方法，本发明还涉及该重组蛋白酶作为工具酶应用于 重组蛋白的切割和纯化，属于重组蛋白酶领域。

背景技术

小分子泛素样修饰物(small ubiquitin-related modifier，SUMO)蛋白酶 是半胱氨酸蛋白酶超家族的成员之一，在真核生物体内主要行使两种生理 功能：(1)切除SUMO前体C-末端的几个氨基酸残基，以暴露C-末端的Gly- Gly残基使之成为具修饰、转运等功能的成熟SUMO；(2)将SUMO与目 的蛋白偶合物水解成SUMO和目的蛋白，这个过程称为去SUMO化。研 究资料显示，各种SUMO蛋白酶都含有一个约200aa左右保守的C-末端 ULP结构域，该结构域具有催化活性；不同的SUMO蛋白酶有不同的N-末 端结构域，正是这种差异将不同的SUMO蛋白酶定位于细胞的不同部分。

在酿酒酵母中有两种SUMO蛋白酶：小分子泛素样特异性蛋白酶 1(Ubiquitin-like-specific protease 1，Ulp1)和小分子泛素样特异性蛋白酶 2(Ubiquitin-like-specific protease 2，Ulp2)。Ulp1位于核孔复合体(nuclear pore complex)，其主要功能是：(1)将Smt3(SUMO在酿酒酵母中的同源 物)C-末端序列(-GGATY)处理成成熟形式(-GG)；(2)将Smt3从被修饰蛋白 的赖氨酸ε-氨基上解开，Ulp1以上这些重要功能在酵母G₂-M细胞周期进 程中是必需的，缺失Ulp1表达的酵母不能生存。Ulp2则主要位于细胞核 内，不对SUMO前体进行酶切，似乎对一套特别的SUMO-底物蛋白偶合物 去SUMO化，缺乏Ulp2对酵母不致命，但是Ulp2在维持酵母正常的形态、 核分裂、胞质分裂，以及对DNA损伤的修复中是必需的。

酿酒酵母中的Ulp1是由621氨基酸残基组成的蛋白质多肽。至少含 有两个结构域，一个是保守的C-端蛋白酶折叠区域(432～621aa)；另一个是保 守性弱的N-端结构域(1～432aa)。通过序列相似性对比、结构预测和选择 性的蛋白水解实验发现，Ulp1中第403aa到621aa活性片段Ulp1p表现出 具有全长的Ulp1酶切活性，并能够水解以α-氨基连接的SUMO-目的蛋白 偶合物。

研究人员利用Ulp1p与SUMO/Smt3相互作用的晶体结构发现了 Ulp1p对SUMO/Smt3的识别主要依据底物的三级结构，而不像其它蛋白酶 只识别特定的氨基酸序列；Ulp1p的水解活性对SUMO/Smt3-蛋白偶合物具 有高效性和特异性，这些独特的优点使得Ulp1可以作为一种新的工具酶用 于重组蛋白的切割和纯化。

现有的用于从融合蛋白中切割SUMO的蛋白酶主要存在着特异性较 差、稳定低、不能在较宽范围的反应环境体系中保持高活力等缺陷，有 待改进。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是克服现有技术的不足，提供一种特异 性好、稳定性高、能在较宽范围的反应环境体系中保持高活力的重组小 分子泛素样修饰物蛋白酶；

本发明所要解决的另一个技术问题是提供一种制备上述重组小分子 泛素样修饰物蛋白酶的方法；

本发明所要解决的技术问题是通过以下技术方案来实现的：

一种重组小分子泛素样修饰物蛋白酶，由GST标签、ULP1P序列 和多聚His标签组成，其氨基酸序列为SEQ ID NO：2所示；

GST标签内含2个二硫键，提高了整个重组蛋白酶的稳定性；多聚 His标签和SUMO拥有相同标签，利于切割后蛋白纯化，减少蛋白损 失。

编码该重组小分子泛素样修饰物蛋白酶的核苷酸序列为SEQ ID NO：1所示；含有该核苷酸序列的表达载体以及含有该表达载体的宿主细 胞也当然属于本发明的保护范畴之内。

本发明还提供一种制备上述重组小分子泛素样修饰物蛋白酶的方 法，包括：将SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列与原核或真核表达载体可 操作性的相连接，得到重组表达载体；将该重组表达载体转化到宿主细 胞中，诱导蛋白表达，收集，纯化，即得。

其中，本发明通过大量的试验发现，当采用低温慢速(温度为 20℃，转速为55r/min)，IPTG浓度为0.05mmol/L的条件下过夜诱导， 相比于常温和常速的诱导表达条件，可显著提高重组蛋白的可溶性及产 量。

本发明重组SUMO蛋白酶识别完整的SUMO(Small Ubiquitin-like Modifier)标签蛋白序列，能高效地把SUMO从融合蛋白上切割下来。与 EK和TEV等蛋白酶的识别位点相比，由于其识别序列长，所以SUMO 蛋白酶酶切反应有很高的特异性，且在较宽范围的反应环境体系中保持 较高的活力，例如温度(4-30℃)、pH(5.5-9.5)等。本发明重组 SUMO蛋白酶不但具有多聚His标签，便于融合蛋白切割后的亲和层析 纯化，还有谷胱甘肽转移酶GST标签，方便蛋白酶的纯化，也增强了酶 的稳定性。

附图说明

图1重组表达质粒pGEX-6p-1-His的构建过程图。

图2低温慢速诱导条件下重组蛋白表达结果。

图3常温常速诱导条件下重组蛋白表达结果。

图4改造前Ulp1p(无GST)不同pH值酶切效果；M：蛋白质分子量 标准；1-5：Ulp1p(无GST)切割融合蛋白SUMO-IL-1β的酶切缓冲液pH 值分别为6，7，8，9，10；6：融合蛋白SUMO-IL-1β未经切割对照。

图5改造后Ulp1p-GST在不同pH值酶切效果；M：蛋白质分子量 标准；1-5：Ulp1p-GST切割融合蛋白SUMO-IL-1β的酶切缓冲液pH值 分别为6，7，8，9，10；6：融合蛋白SUMO-IL-1β未经切割对照。

图6Ulp1p改造前后在4℃下酶切效果对比；M：蛋白质分子量标 准；1：融合蛋白SUMO-IL-1β未经切割对照；2：利用改造前的 Ulp1p(无GST)在4℃下切割融合蛋白SUMO-IL-1β；3：利用改造后的 Ulp1p-GST在4℃下切割融合蛋白SUMO-IL-1β。

图7Ulp1p改造前后在16℃下酶切效果对比；M：蛋白质分子量标 准；1：融合蛋白SUMO-IL-1β未经切割对照；2：利用改造前的 Ulp1p(无GST)在16℃下切割融合蛋白SUMO-IL-1β；3：利用改造后的 Ulp1p-GST在16℃下切割融合蛋白SUMO-IL-1β。

图8Ulp1p改造前后在30℃下酶切效果对比；M：蛋白质分子量标 准；1：融合蛋白SUMO-IL-1β未经切割对照；2：利用改造前的 Ulp1p(无GST)在30℃下切割融合蛋白SUMO-IL-1β；3：利用改造后的 Ulp1p-GST在30℃下切割融合蛋白SUMO-IL-1β。

图9GST-Ulp1p切割SUMO融合蛋白的SDS-PAGE电泳分析； M：蛋白质分子量标准；1：SUMO-TNFα未切割；2：SUMO-TNFα酶 切后产物；3：SUMO-FGF-21酶切后产物；4：SUMO-FGF-21未切割； 5：GST-Ulp1p；6：SUMO-IL-1β未切割；7：SUMO-IL-1β酶切后产 物。

具体实施方式

下面结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将 会随着描述而更为清楚。但这些实施例仅是范例性的，并不对本发明的 范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的 精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换，但 这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。

实施例1本发明重组SUMO蛋白酶(Ulp1p-GST)的制备和纯化

1、重组表达质粒的构建

将ULP1P核苷酸序列和多聚His标签核苷酸序列连接在一起后用 BamH I和Xho I进行酶切，将其亚克隆到质粒pGEX-6p-1，得到重组表 达质粒pGEX-6p-1-His；其构建过程见图1.

2、转化

rosetta感受态细胞冰上融化，加入1μl重组表达质粒，冰上放置30 分钟，42℃热激50秒，加入200-300μl液体LB(无AMP)，37℃摇1小时 后涂板，37℃过夜培养。

3、表达

(1)活化：挑取单菌落于10-20mlLB中，37℃振摇过夜。

(2)二次活化：1/100接菌(500ml接5ml)，37℃振摇2-3小时至 OD₆₀₀＝0.2-0.4。

(3)诱导：

设置两组，分别按照以下诱导条件进行诱导：

试验组：IPTG(1M)：0.05mmol/l(500ml菌加25μl)；

温度为20℃；

转速：55r/min；

振摇时间：12小时；

对照组：常温常速(温度为37℃；转速为100r/min)，振摇时间： 12小时；IPTG浓度为0.05mmol/L(500ml菌加25μl)；

试验组的重组蛋白的SDS-PAGE的电泳结果为图2；对照组的重组 蛋白的SDS-PAGE的电泳结果为图3；从试验结果可见，采用试验组的诱 导条件可显著提高蛋白的可溶性和表达产量。

(4)收菌：4℃，4000rpm，离心30分钟，用lysis buffer冲悬，再 离心，弃上清，菌于-80度冻存。

4、纯化

1、手提：

(1)融菌：将菌冰上融化，加溶菌酶(500ml菌＝5-10ml lysis buffer，1ml lysis buffer＝1mg溶菌酶)和lysis buffer后冰上放置30分钟-1 小时。

(2)超声破碎：500ml菌大约20分钟；

(3)冰上柱上结合1小时，1400r离心；

(4)洗杂蛋白：每次5-6ml wash buffer，洗15遍；

(5)洗脱：每次2-3ml elution buffer，洗6遍；

(6)透析：PBS透析过夜；

2、AKTA纯化。

试验例1本发明重组SUMO蛋白酶(Ulp1p-GST)的应用效果试验

一、试验材料

1、供试样品：实施例1所制备和纯化的重组SUMO蛋白酶(Ulp1p- GST)；

2、对照样品：Ulp1p蛋白；

二、试验方法及结果

(一)、分别将等量的供试样品蛋白和Ulp1p蛋白分别置于pH值6， 7，8，9，10溶液中切割底物蛋白，由表1中可以看出，Ulp1p蛋白在 pH值为6，7，8，9的时候其酶切效率有明显的下降，而供试样品蛋白 在6，7，8，9的时候很好的保持了酶切活性(图4、图5)。

表1不同pH值条件下对SUMO蛋白酶活性影响

  pH6   pH7   pH8   pH9   pH10   供试样品   90.58±0.04％   89.24±0.03％   83.17±0.01％   79.31±0.05％   60.03±0.04％   对照样品   80.52±0.03％   75.22±0.03％   70.05±0.04％   69.56±0.04％   58.32±0.03％

(二)、分别将等量的供试样品蛋白和Ulp1p蛋白分别置于温度4℃， 16℃，30℃的环境中切割底物蛋白，由表2中可以看出，无标签的Ulp1p 蛋白在4℃，16℃，30℃活性低于供试样品蛋白(图6、图7和图8)。

表2不同温度条件下对SUMO蛋白酶活性影响

  4℃(过夜)   16℃(5小时)   30℃(1小时)   供试样品   89.15±0.06％   85.35±0.15％   92.26±0.04％   对照样品   79.31±0.07％   73.26±0.12％   75.42±0.03％

(三)供试样品蛋白酶切SUMO融合蛋白的试验结果见图9。试验结 果说明，本发明重组SUMO蛋白酶能高效地把SUMO从融合蛋白上切割 下来。

                                    KLPI100060_2

序列表

<110>东北农业大学

<120>重组小分子泛素样修饰物蛋白酶及其制备方法和应用

<130>KLPI08078

<160>2

<170>PatentIn version 3.1

 

<210>1

<211>1368

<212>DNA

<213>Artifical sequence

 

<220>

<221>CDS

<222>(1)..(1368)

<223>

 

<400>1

atg tcc cct ata cta ggt tat tgg aaa att aag ggc ctt gtg caa ccc   48

Met Ser Pro Ile Leu Gly Tyr Trp Lys Ile Lys Gly Leu Val Gln Pro

1           5             10              15

act cga ctt ctt ttg gaa tat ctt gaa gaa aaa tat gaa gag cat ttg   96

Thr Arg Leu Leu Leu Glu Tyr Leu Glu Glu Lys Tyr Glu Glu His Leu

        20            25             30

tat gag cgc gat gaa ggt gat aaa tgg cga aac aaa aag ttt gaa ttg  144

Tyr Glu Arg Asp Glu Gly Asp Lys Trp Arg Asn Lys Lys Phe Glu Leu

     35             40            45

ggt ttg gag ttt ccc aat ctt cct tat tat att gat ggt gat gtt aaa  192

Gly Leu Glu Phe Pro Asn Leu Pro Tyr Tyr Ile Asp Gly Asp Val Lys

   50            55             60

tta aca cag tct atg gcc atc ata cgt tat ata gct gac aag cac aac  240

Leu Thr Gln Ser Met Ala Ile Ile Arg Tyr Ile Ala Asp Lys His Asn

65            70              75               80

atg ttg ggt ggt tgt cca aaa gag cgt gca gag att tca atg ctt gaa   288

Met Leu Gly Gly Cys Pro Lys Glu Arg Ala Glu Ile Ser Met Leu Glu

          85              90             95

gga gcg gtt ttg gat att aga tac ggt gtt tcg aga att gca tat agt    336

Gly Ala Val Leu Asp Ile Arg Tyr Gly Val Ser Arg Ile Ala Tyr Ser

         100             105            110

aaa gac ttt gaa act ctc aaa gtt gat ttt ctt agc aag cta cct gaa    384

Lys Asp Phe Glu Thr Leu Lys Val Asp Phe Leu Ser Lys Leu Pro Glu

     115            120             125

atg ctg aaa atg ttc gaa gat cgt tta tgt cat aaa aca tat tta aat    432

Met Leu Lys Met Phe Glu Asp Arg Leu Cys His Lys Thr Tyr Leu Asn

  130            135            140

ggt gat cat gta acc cat cct gac ttc atg ttg tat gac gct ctt gat    480

Gly Asp His Val Thr His Pro Asp Phe Met Leu Tyr Asp Ala Leu Asp

145             150            155            160

gtt gtt tta tac atg gac cca atg tgc ctg gat gcg ttc cca aaa tta    528

Val Val Leu Tyr Met Asp Pro Met Cys Leu Asp Ala Phe Pro Lys Leu

            165           170            175

gtt tgt ttt aaa aaa cgt att gaa gct atc cca caa att gat aag tac    576

Val Cys Phe Lys Lys Arg Ile Glu Ala Ile Pro Gln Ile Asp Lys Tyr

        180             185              190

ttg aaa tcc agc aag tat ata gca tgg cct ttg cag ggc tgg caa gcc    624

Leu Lys Ser Ser Lys Tyr Ile Ala Trp Pro Leu Gln Gly Trp Gln Ala

     195             200             205

acg ttt ggt ggt ggc gac cat cct cca aaa tcg gat ctg gaa gtt ctg    672

Thr Phe Gly Gly Gly Asp His Pro Pro Lys Ser Asp Leu Glu Val Leu

  210             215             220

ttc cag ggg ccc ctg gga tcc ctt gtt cct gaa tta aat gaa aaa gac    720

Phe Gln Gly Pro Leu Gly Ser Leu Val Pro Glu Leu Asn Glu Lys Asp

225            230            235             240

gat gat caa gta caa aaa gct ttg gca tct aga gaa aat act cag tta    768

Asp Asp Gln Val Gln Lys Ala Leu Ala Ser Arg Glu Asn Thr Gln Leu

          245             250             255

atg aat aga gat aat ata gag ata aca gta cgt gat ttt aag acc ttg    816

Met Asn Arg Asp Asn Ile Glu Ile Thr Val Arg Asp Phe Lys Thr Leu

        260            265              270

gca cca cga aga tgg cta aat gac act atc att gag ttt ttt atg aaa    864

Ala Pro Arg Arg Trp Leu Asn Asp Thr Ile Ile Glu Phe Phe Met Lys

      275            280            285

tac att gaa aaa tct acc cct aat aca gtg gcg ttt aat tcg ttt ttc    912

Tyr Ile Glu Lys Ser Thr Pro Asn Thr Val Ala Phe Asn Ser Phe Phe

  290              295            300

tat acc aat tta tca gaa agg ggt tat caa ggc gtc cgg agg tgg atg    960

Tyr Thr Asn Leu Ser Glu Arg Gly Tyr Gln Gly Val Arg Arg Trp Met

305            310            315             320

aag aga aag aag aca caa att gat aaa ctt gat aaa atcttt aca cca    1008

Lys Arg Lys Lys Thr Gln Ile Asp Lys Leu Asp Lys Ile Phe Thr Pro

           325             330            335

ata aat ttg aac caa tcc cac tgg gcg ttg ggc ata att gat tta aaa  1056

Ile Asn Leu Asn Gln Ser His Trp Ala Leu Gly Ile Ile Asp Leu Lys

         340            345             350

aag aaa act ata ggt tac gta gat tca tta tcg aat ggt cca aat gct  1104

Lys Lys Thr Ile Gly Tyr Val Asp Ser Leu Ser Asn Gly Pro Asn Ala

      355             360            365

atg agt ttc gct ata ctg act gac ttg caa aaa tat gtt atg gaa gaa  1152

Met Ser Phe Ala Ile Leu Thr Asp Leu Gln Lys Tyr Val Met Glu Glu

  370             375            380

agt aag cat aca ata gga gaa gac ttt gat ttg att cat tta gat tgt  1200

Ser Lys His Thr Ile Gly Glu Asp Phe Asp Leu Ile His Leu Asp Cys

385             390             395            400

ccg cag caa cca aat ggc tac gac tgt gga ata tat gtt tgt atg aat  1248

Pro Gln Gln Pro Asn Gly Tyr Asp Cys Gly Ile Tyr Val Cys Met Asn

           405             410            415

act ctc tat gga agt gca gat gcg cca ttg gat ttt gat tat aaa gat  1296

Thr Leu Tyr Gly Ser Ala Asp Ala Pro Leu Asp Phe Asp Tyr Lys Asp

        420             425            430

gcg att agg atg aga aga ttt att gcc cat ttg att tta acc gac gct  1344

Ala Ile Arg Met Arg Arg Phe Ile Ala His Leu Ile Leu Thr Asp Ala

      435            440             445

tta aaa cat cat cat cat cat cac                                  1368

Leu Lys His His His His His His

   450            455

 

<210>2

<211>456

<212>PRT

<213>Artifical sequence

 

<400>2

Met Ser Pro Ile Leu Gly Tyr Trp Lys Ile Lys Gly Leu Val Gln Pro

1          5               10             15

Thr Arg Leu Leu Leu Glu Tyr Leu Glu Glu Lys Tyr Glu Glu His Leu

        20            25             30

Tyr Glu Arg Asp Glu Gly Asp Lys Trp Arg Asn Lys Lys Phe Glu Leu

     35             40             45

Gly Leu Glu Phe Pro Asn Leu Pro Tyr Tyr Ile Asp Gly Asp Val Lys

   50             55            60

Leu Thr Gln Ser Met Ala Ile Ile Arg Tyr Ile Ala Asp Lys His Asn

65            70               75              80

Met Leu Gly Gly Cys Pro Lys Glu Arg Ala Glu Ile Ser Met Leu Glu

           85            90             95

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        100              105            110

Lys Asp Phe Glu Thr Leu Lys Val Asp Phe Leu Ser Lys Leu Pro Glu

     115            120             125

Met Leu Lys Met Phe Glu Asp Arg Leu Cys His Lys Thr Tyr Leu Asn

  130            135            140

Gly Asp His Val Thr His Pro Asp Phe Met Leu Tyr Asp Ala Leu Asp

145             150            155            160

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            165           170            175

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        180             185              190

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     195             200             205

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  210             215             220

Phe Gln Gly Pro Leu Gly Ser Leu Val Pro Glu Leu Asn Glu Lys Asp

225            230            235             240

Asp Asp Gln Val Gln Lys Ala Leu Ala Ser Arg Glu Asn Thr Gln Leu

           245            250             255

Met Asn Arg Asp Asn Ile Glu Ile Thr Val Arg Asp Phe Lys Thr Leu

        260            265              270

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      275            280            285

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  290              295            300

Tyr Thr Asn Leu Ser Glu Arg Gly Tyr Gln Gly Val Arg Arg Trp Met

305            310            315             320

Lys Arg Lys Lys Thr Gln Ile Asp Lys Leu Asp Lys Ile Phe Thr Pro

           325              330           335

Ile Asn Leu Asn Gln Ser His Trp Ala Leu Gly Ile Ile Asp Leu Lys

         340            345            350

Lys Lys Thr Ile Gly Tyr Val Asp Ser Leu Ser Asn Gly Pro Asn Ala

     355              360            365

Met Ser Phe Ala Ile Leu Thr Asp Leu Gln Lys Tyr Val Met Glu Glu

  370             375            380

Ser Lys His Thr Ile Gly Glu Asp Phe Asp Leu Ile His Leu Asp Cys

385             390             395            400

Pro Gln Gln Pro Asn Gly Tyr Asp Cys Gly Ile Tyr Val Cys Met Asn

           405            410             415

Thr Leu Tyr Gly Ser Ala Asp Ala Pro Leu Asp Phe Asp Tyr Lys Asp

        420             425            430

Ala Ile Arg Met Arg Arg Phe Ile Ala His Leu Ile Leu Thr Asp Ala

      435            440             445

Leu Lys His His His His His His

  450             455