杆状病毒Red样重组过程中关键蛋白酶的鉴定及重组特性分析

摘要

AcMNPV（Autographa californica multinucleocapsid NPV）被广泛的应用于外源基因的表达，它依据高效率的同源重组能力将外源基因插入到基因组中。尽管杆状病毒的同源重组被多次的提及，但是具体机制并不明确，并且主要的功能基因也没有确定。
　　杆状病毒的碱性核酸酶AN和单链DNA结合蛋白LEF-3分别是噬菌体?Red?外切酶和Red?重组酶（或者原噬菌体RecE/T）的同源物，具有各自相应的蛋白酶活性，因而推测AN和LEF-3介导杆状病毒Red样重组。为了检测AN和LEF-3在杆状病毒Red样重组中的作用，我们通过构建AN和LEF-3分别缺失的AcBacmid-KOAN-I-SceⅠGFP-Tomato、AcBacmid-KOLEF-3-I-SceⅠGFP-Tomato初步确定了杆状病毒Red样重组涉及到基因AN和LEF-3，在敲除AN和LEF-3的全部开放阅读框后，杆状病毒无法介导Red样重组。同时利用瞬时表达载体在Sf9细胞中表达AN和LEF-3，检测发现线-线重组的概率得到明显提高。进一步研究杆状病毒Red样重组的特性，分析表明随着同源臂的增加，同源重组的效率也相应增加；并且研究发现同源臂附近的非同源序列对同源重组形成的病毒噬斑数量没有明显影响，但其形成病毒噬斑的时间相应延迟。
　　利用杆状病毒的Red样重组功能，我们成功的建立了一种快速获得重组病毒的方法。在复制缺陷型RD-BmBacmid的基础上，敲除LEF-2，通过抗性基因消除质粒pCP20的帮助，去除CAT，构建RD-BmBacmidKOLEF-2(cat-)。利用重叠PCR获得带有目的基因表达盒片段，同时该片段的两端带50 bp的同源臂，之后同线性化RD-BmBacmidKOLEF-2(cat-)共转染BmN细胞，3-4天内即可获得重组病毒。重组成功的病毒含有完整的LEF-2、orf1629，同时还含有目的基因表达盒，可以复制并侵染附近细胞。在本研究中，利用绿色荧光蛋白基因作为目的基因，通过荧光显微镜可以清晰的观察到重组病毒。结果证明我们可以在转染3-4天后获得重组病毒，整个实验过程时间短重组效率高。
　　本研究证明，杆状病毒Red样重组涉及基因AN和LEF-3，同时在利用瞬时表达载体表达AN和LEF-3后线线重组的概率得到明显提高。随着同源臂的增加，杆状病毒Red样重组概率得到明显增长。利用杆状病毒Red样重组功能，构建一种可以在3-4天内快速获得重组病毒的方法。

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第一章 引言

1λ-Red同源重组技术

2杆状病毒

3研究方案设计

第二章 杆状病毒Red样重组相关基因的克隆及敲除

1.引言

2.材料与试剂

3.方法

4结果与分析

5讨论

第三章 杆状病毒Red样重组相关基因研究

1.引言

2.材料与试剂

3.方法

4.结果与分析

5.讨论

第四章 杆状病毒Red样重组分子机制特性研究

1引言

2材料与试剂

3.方法

4.结果与分析

5讨论

第五章 杆状病毒Red样重组初步应用

1引言

2材料与试剂

3方法

4.结果及分析

5.讨论

结论

参考文献

致谢