一种具有硫酸盐还原功能的柠檬酸杆菌及其应用

摘要

本发明涉及微生物领域，具体地，本发明涉及一种具有硫酸盐还原功能的柠檬酸杆菌及其应用，保藏编号为：CGMCC NO.4660。本发明筛选到的柠檬酸杆菌Citrobacter sp.strain HCSR为兼性菌，相对于现有SRB严格厌氧培养条件，具有在好氧条件下生长迅速，厌氧条件下有硫酸盐还原能力的特性，7天内去除SO42-最大含量从2.85g/L提高到6g/L，充分发挥了该菌株兼性厌氧的生理特性，易于培养且降低处理工艺难度，从而使该菌株能够在硫酸盐废水的治理中得到广泛应用。

说明书

技术领域

本发明涉及微生物领域，具体地，本发明涉及一种具有硫酸盐还原功能的柠檬酸杆菌及其应用。

背景技术

随着工业的不断发展，化工、味精、制药、糖蜜酒精、制革、造纸等领域在生产过程中排放出大量含硫酸盐(SO₄^2-)的高浓度有机废水。对于此类废水，目前一般采用微生物厌氧处理方法，其中硫酸盐还原菌(sulfate reducing bacteria，SRB)起着重要作用，微生物厌氧处理原理主要是利用严格厌氧的硫酸盐还原菌将SO₄^2-还原为H₂S等硫化物，核心催化功能在SRB。

据不完全统计，SRB已有脱硫弧菌(Desulfovibrio)、脱硫肠状菌(Desulfotomaculum)和脱硫单胞菌(Desulfomonas)等12个属近40多个种。国内外学者对硫酸盐还原菌研究做了大量的工作，包括SRB的分离及筛选、生态分布特性、毒理学研究及其污染与防治方法、处理工艺及反应器等。但具硫酸盐还原能力的柠檬酸杆菌鲜有报道。1932年，由werkman等将一群能利用柠檬酸盐和发酵乳糖的大肠杆菌进行了重新分类，首次单独列为柠檬酸杆菌属，其模式菌株为弗氏柠檬酸杆菌(Citrobacter freundii)到目前为止，根据生理生化和分子生物学的鉴定，柠檬酸杆菌属共有13个种。由于传统SRB大多数为严格厌氧菌，且菌体浓度较低，所以对污水处理工艺要求较为严格。

发明内容

本发明的目的是针对现有技术存在的问题，提供一种能够高效还原废水中硫酸盐的柠檬酸杆菌Citrobacter sp.strain HCSR，该菌在好氧与厌氧条件下均可生长，且在厌氧条件下具有硫酸盐还原功能。

本发明的另一个目的是提供上述柠檬酸杆菌Citrobacter sp.strain HCSR在处理高浓度硫酸盐废水中的应用。

本发明的柠檬酸杆菌Citrobacter sp.strain HCSR于2010年3月15日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，其简称CGMCC，保藏编号为：CGMCCNO.4660。

本发明从采自天津造纸厂造纸废水排污口污泥中筛选得到纯菌株Citrobacter sp.strain HCSR。在培养过程中发现，菌落早期为白色小菌落，后由于菌体还原硫酸盐产生硫化氢，硫化氢和亚铁离子结合产生硫化亚铁沉淀，使菌落逐渐变为黑色，表面凸起，直径约1mm～3mm。菌株HCSR在相差显微镜下观察，细胞大小和形态一致，菌体为杆状，稍有弯曲，两端钝圆，能运动，菌体宽度在0.6μm～0.8μm，长度在1.8μm～3.3μm之间。电镜观察显示细胞呈弧状，有极生单鞭毛。菌株HCSR革兰氏反应呈阴性，没有观察到有芽孢形成，接触酶阳性，氧化酶阴性。综合对菌株HCSR的生理生化特性以及16S rRNA基因测序结果，可以确定本发明分离纯化得到的菌株为Citrobacter sp.strain HCSR。

在本发明的实施例从，从以下几个方面考察了上述柠檬酸高效脱硫菌株处理高浓度硫酸盐废的性能：

1、以乙醇作碳源考察不同SO₄^2-对菌株HCSR硫酸盐去除率的影响，在富集培养基的基础上做以下改动：蛋白胨1g，酵母浸出汁1g，用氯化亚铁代替硫酸亚铁，硫酸盐用硫酸盐贮备液，其余均不变。

2、模拟不同废水组分，在培养基中加入一定量的SO₄^2-，Zn²⁺，Cr³⁺，Cu²⁺，以1％的接种量接种培养24h的菌液，然后接入硫酸盐还原-硫化物氧化气升式复合生物脱硫反应器中，启动反应器。

3、反应器运行期间，每隔1d测定出水pH、氧化还原电位(ORP)、碱度、S_2-、SO₄^2-以及Cu²⁺、Zn²⁺和Cr³⁺含量。SO₄^2-采用离子色谱(ICS-900，Dionex)，S^2-采用硫离子选择电极电位滴定法，重金属采用6000r·min^-1离心15min，0.45μm滤膜抽滤后，原子吸收光谱测定(SOLAAR-M6，Thermo)。

与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：

1、本发明筛选到的柠檬酸杆菌Citrobacter sp.strain HCSR为兼性菌，相对于现有SRB严格厌氧培养条件，具有在好氧条件下生长迅速，厌氧条件下有硫酸盐还原能力的特性，易于培养且降低处理工艺难度。

2、本发明通过采用好氧&厌氧——双阶段培养法大大提高柠檬酸杆菌硫酸盐去除能力，7天内去除SO₄^2-最大含量从2.85g/L提高到6g/L，充分发挥了该菌株兼性厌氧的生理特性，从而使该菌株能够在硫酸盐废水的治理中得到广泛应用。

附图说明

图1为本发明的柠檬酸杆菌HCSR在厌氧、好氧，双阶段培养条件下7日内硫酸盐脱除情况。

图2为硫酸盐还原-硫化物氧化耦合气升式生物脱硫反应器工艺流程图。

本发明的柠檬酸杆菌Citrobacter sp.HCSR于2010年3月15日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，100101)，保藏编号为：CGMCC NO.4660。

具体实施方式

实施例1高效脱硫柠檬酸杆菌的筛选

1、取样品采自天津造纸厂造纸废水排污口污泥，将样品沉淀48小时后取上清液以1％接入SRB分离纯化培养基(分离纯化培养基：MgCl₂·6H₂O 0.4g，NH₄Cl 1.0g，Na₂SO₄3.0g，Yeast extracts 1.0g，K₂HPO₄0.5g，CaCl₂·2H₂O 0.05g，乳酸钠3.0g，维生素C(10g/L)10mL，FeSO₄(5g/L)10mL。所有成分加入到去离子水，定容至1L，充分混合，加热至沸腾，然后冷却至室温，充氮气后1×10⁵Pa灭菌，pH为7.5。液体培养基在氮气下分装至具胶塞的厌氧管后密封，固体培养基加1.5％的琼脂粉。)

2、置于厌氧工作站(RUSKINN Bugbox)富集，以亚铁离子做指示剂，待培养基变黑后涂平板分离，平板置于恒温培养箱中30℃培养。约4d左右，长出黑色菌落，挑取单菌落划线分离，2～3次后获得纯菌株Citrobacter sp.HCSR。

实施例2柠檬酸杆菌HCSR的生理生化鉴定

对实施例1得到的高效硫酸盐还原菌株进行一系列性质鉴定，得到结果如下表1：

表1菌株HCSR形态观察及生理生化鉴定结果

本实施例按照《伯杰氏细菌鉴定手册》(第九版)(Baltimore：The Williams and Wilkins Co.Baltimore Md出版，2004年5月)中的生理生化鉴定方法，对菌株HCSR的生理生化进行鉴定，结果发现该菌株与Citrobacter werkmanii最符合。

实施例3柠檬酸杆菌HCSR的16S rDNA序列分析

提取出柠檬酸杆菌HCSR菌体总DNA，设计引物扩增出其16S rDNA基因后进行测序，并在NCBI数据库进行同源性数据比较。

16S rDNA基因扩增及PCR产物分析模板的制备：吸取适量菌体离心，取出菌体沉淀，使用基因组抽提试剂盒(基因组DNA提取方法请参见《细菌分子遗传学分类鉴定法》(上海科学技术出版社，1990年)抽提菌体总DNA，片段大小在20kbp左右，16S rDNA基因引物的设计采用通用引物，由上海生工生物工程技术服务有限公司提供。PCR反应体系见表2，反应条件见表3，每批次PCR反应均设立阴性参照(加入引物但不加入模板的空白对照)，扩增出的基因片段大小在1375bp～1584bp之间。

表2PCR反应体系

表3PCR反应条件

委托擎科生物技术公司(北京)对扩增出的16S rDNA基因进行测序，将测序结果在NCBI数据库进行同源性数据比较，采用BLAST比对方法获得结果发现菌种HCSR与柠檬酸杆菌具有较高的同源性。

实施例4柠檬酸杆菌HCSR在不同培养条件下脱硫效果

厌氧，好氧和双阶段培养条件下，菌种HCSR处理硫酸盐的效果见图1。从图中可以看出，在厌氧条件下，菌种HCSR在7日内最大脱硫能力为11.8mM，最终SO₄^2-浓度为0.1mM。好氧培养条件下，SO₄^2-浓度在第3日从11.8mM降低至9.4mM，此后不再降低，说明在好氧条件下，菌种生长较快，但是硫酸盐还原能力较弱。在经过先好氧，再厌氧的双阶段培养后，菌种HCSR在7日内最大脱硫能力由11.7mM上升至20.9mM，脱硫能力提高79％，大大提高了该菌株在高浓度硫酸盐废水治理中的可用性。

实施例5柠檬酸杆菌HCSR在重金属硫酸盐废水处理工艺中的应用

本实施例采用的硫酸盐还原-硫化物氧化耦合气升式生物脱硫反应器工艺流程图如图2所示，具体实施方式为：

1、人工配制含Cu²⁺、Zn²⁺和Cr³⁺的重金属废水。以Cr₂(SO₄)₃、CuSO₄和ZnSO₄母液配置，废水Zn²⁺、Cu²⁺和Cr³⁺含量分别为1、0.6和0.2mM，SO₄^2-含量约为8mM。试验时，通过2mol·L^-1HCl控制进水pH为5.6。设置上述重金属含量是基于我国大多数制革、金属加工以及城市污泥生物沥浸脱毒产生的废液中重金属含量的可能范围。

2、将活化24h的柠檬酸杆菌HCSR菌体种子注入气升式硫酸盐还原生物反应器中，通过外缠加热丝控温(32±1)℃，利用磁力搅拌器实现废水混合均匀(转速160r·min^-1)，控制水力停留时间36h(SO₄^2-负荷率为4.1kg·m^-3·d^-1)。

3、从气升式硫酸盐还原生物反应器底部通入100％N₂以保证反应器内厌氧环境，在厌氧条件下，菌种HCSR将硫酸盐还原为硫化氢和硫化物，重金属如ZnS，CuS，Cr₂S₃在气-固-液三相分离装置中沉淀出去，其余硫化氢与可溶性硫化物(如硫化钠等)通过蠕动泵加入至气升式硫化物氧化生物反应器中，通入空气，在硫化物氧化菌的作用下，将S^2-氧化为单质硫，通过固-液两相分离装置除去，脱除后经检测废水达标后可以排放。

4、金属沉淀物利用电解装置电解后，重金属在电极表面析出，便于回收利用。

经检测出水成分，处理后，出水pH可稳定在6.5～8.0，SO₄^2-还原(去除)率达72％～80％，Cu²⁺、Zn²⁺和Cr³⁺去除(沉淀)率达99％以上。

实施例6柠檬酸杆菌HCSR在高浓度硫酸盐造纸废水处理工艺中的应用

表4造纸废水组成

将实施例5中重金属废水成分置换成表4中所述造纸废水，利用NaOH控制进水pH，略去金属沉淀装置，直接偶联硫酸盐还原和硫化物氧化气升式生物脱硫反应器，其他操作方法和步骤同实施例5，最终反应器出水检测结果为：COD_Cr去除率为85～88％，BOD去除率高于97％，SO₄^2-还原(去除)率达90％以上。