柠檬酸杆菌（Citrobacter sp.strain DBM）的硫酸盐还原特性及应用研究

摘要

酸性矿山废水含有的大量的重金属和硫酸盐，且pH较低，对矿区环境造成严重危害，并且由于硫化物矿石的不断氧化造成其污染治理困难。除了采用传统的中和沉淀法对其进行处理以外，生物硫酸盐还原过程正成为一种很有前景的处理方式，该技术的核心是利用一类称为硫酸盐还原菌的微生物还原酸性废水中的硫酸盐为硫化氢，硫化氢再和酸水中的重金属反应生成硫化物沉淀。并且生成的金属硫化物的溶解度比氢氧化物沉淀小的多，有利于回收利用，因此获得适合当地酸性废水处理的硫酸盐还原菌对于提高该技术的处理效率有着重要的影响。本文在总结前人研究成果的基础上，以大宝山污染河流底泥为接种物，驯化筛选了一株非传统的硫酸盐还原菌，经过厌氧、好氧生长试验、分子鉴定、生化指标鉴定确认了该菌属于兼性厌氧菌，在此基础上对其各种生理特性进行了研究，通过不同碳源条件下该菌的硫酸盐还原能力变化初步探讨了其作用机理。 对取自大宝山污染河流底泥为接种物启动硫酸盐还原反应器，进行了富集培养。通过逐步提高砷浓度进行胁迫的方式驯化菌群，结果表明该硫酸盐还原反应器对砷的最大耐受浓度为80mg/L。在此基础上，通过液体富集、平板涂布划线的方式获得一株可以还原硫酸盐的细菌。厌氧条件下，该菌株可快速还原硫酸盐产生硫化氢，培养4天后硫酸盐的浓度从10.30mM下降为0.10mM，生长过程中pH上升。好氧条件下该菌株生长迅速，培养48h后OD达到1.15，同时pH上升，但不还原硫酸盐。该菌株经过16srRNA鉴定属于肠杆菌科柠檬酸杆菌属，对该菌株进行了肠杆菌科相关生理指标鉴定，结果发现其接触酶阳性，氧化酶阴性，可以利用柠檬酸作为唯一碳源。菌株可以分解含-SH的氨基酸产生硫化氢，不产生苯丙氨酸脱氨酶，也不分解色氨酸产生吲哚。菌株的赖氨酸脱羧酶和鸟氨酸脱羧酶均为阳性，V-P试验阴性。菌株可以分解利用尿素，山梨糖醇，不能利用侧金盏花醇，丙二酸。经过试验确认筛选到的菌株为柠檬酸杆菌属的一个变种，命名为Citrobactersp.strainDBM。 DBM菌株可以还原氧，能够在限氧浓度条件逐渐耗尽氧，而后还原硫酸盐产生硫化物。DBM菌株可以硝酸盐、亚硝酸盐为电子受体，将其还原为NH4+，菌株对硝酸盐的还原优先于硫酸盐。酵母、Fe的添加对菌株的生长有明显的促进作用。菌株还可以亚硫酸盐、硫代硫酸盐、硫单质为电子受体还原产生硫化氢，对硫单质的还原稍慢。DBM菌株的生长范围是pH5.0-9.0，最佳培养温度35℃。硫化物和MoO42-的添加会强烈抑制菌株的生长和还原作用。菌株可以利用的碳源范围广泛，包括甲酸、乳酸、柠檬酸、葡萄糖、蔗糖，乳糖，不能利用乙酸。其中柠檬酸和糖类可以支持生长，但是不能产生硫化物，乳糖的利用产物是乙酸。DBM菌株在厌氧条件下生长时对乳糖的利用要优先于乳酸，由此导致其硫酸盐还原能力的消失，而添加NaF抑制其糖酵解途径可以恢复其硫酸盐还原活性。 在毒性耐受范围内，DBM菌株可以有效的沉淀金属Cu、Zn、Cd，沉淀的机理是硫酸盐还原生成硫化物，结合重金属。菌株DBM对As(V)有较好的耐性，可以达到1mM，As(III)对菌株的毒性明显大于As(V)。菌株在还原硫酸盐的同时无法将砷从水溶液中沉淀出来，原因可能是形成了水合离子和其他砷的化合物。菌株DBM对砷的耐性可能与反应器驯化过程中的砷胁迫有关。 以乳酸钠为碳源和络合剂提高了AMD的生化可利用性，改进了传统的生物硫酸盐还原过程(BilogicalSulfateReductionProcess)。以菌株DBM启动了一个升流式厌氧生物反应器，对预处理后的大宝山实际酸性废水进行了处理，运转30天中，Fe、Zn、Cd、Cu、As、Al的去除率均在99％以上，硫酸盐的去除率平均为62％。

目录

文摘

英文文摘

声明

第一章前言

1.1酸性矿山废水的危害

1.2酸性矿山废水的形成机理

1.3酸性矿山废水的主动处理技术

1.4酸性矿山废水的物化处理技术

1.4.1石灰/石灰石中和沉淀法

1.4.2硫化沉淀法

1.4.3人工湿地法

1.5酸性矿山废水的硫酸盐还原处理技术

1.6传统硫酸盐还原细菌

1.6.1硫酸盐还原菌(SRB)的分类

1.6.2 SRB的碳源及碳代谢

1.6.3 SRB的微量营养元素

1.6.4 SRB的电子受体

1.6.5硫酸盐还原菌还原硫酸盐的机理

1.6.6影响硫酸盐还原的因素

1.7 SRB的生存与氧

1.7.1氧胁迫下SRB生理响应

1.7.2氧胁迫下SRB形态响应

1.8非传统的硫酸盐还原菌

1.9本论文的研究意义、目标及方案

1.9.1研究意义

1.9.2研究目标

1.9.3研究方案

参考文献

第二章硫酸盐还原菌的驯化与筛选

2.1 引言

2.2材料和方法

2.2.1菌种分离来源

2.2.2试剂及仪器

2.2.3试验装置

2.2.4方法

2.3结果与分析

2.3.1 CSTR启动过程中硫酸盐的去除动态

2.3.2 CSTR反应器内菌体对硫酸盐的去除的血清瓶试验

2.3.3耐砷SRB的驯化

2.3.4.菌株的形态及鉴定

2.4讨论

2.4.1反应器启动、驯化过程中的硫酸盐变化

2.4.2菌株DBM与氧的关系

2.4.3菌株的生理生化特性

2.5小结

参考文献

第三章柠檬酸杆菌DBM的生理特性及其硫酸盐还原机理

3.1引言

3.2材料与方法

3.2.1菌株及培养基

3.2.2主要仪器

3.2.3试验方法

3.2.4DMB菌株的主要生理化特性

3.2.5碳源对DBM菌株产硫化物的影响实验

3.3结果与分析

3.3.1菌株DBM的生理特性

3.3.2菌株的电子受体试验

3.3.3菌株还原硫酸盐的机理

3.4讨论

3.4.1 Fe0对菌株还原硫酸盐的影响

3.4.2硫化物和MoO42-对菌株还原硫酸盐的影响

3.4.3菌株对硝酸盐和氧的还原

3.4.4菌株还原硫酸盐的与碳源利用的关系

3.5小结

参考文献

第四章柠檬酸杆菌DBM对重金属的转化去除

4.1引言

4.2材料与方法

4.2.1菌株及培养基

4.2.2主要仪器

4.2.3 DBM菌株对不同重金属的沉淀

4.2.4 DBM菌株沉淀产物的EDX分析

4.3结果与分析

4.3.1菌株对铜的沉淀

4.3.2菌株对锌的沉淀

4.3.3菌株对镉的沉淀

4.3.4菌株对As(Ⅲ)的沉淀

4.3.5菌株对As(Ⅴ)的沉淀

4.4讨论

4.4.1重金属对菌株还原硫酸盐活性的抑制

4.4.2菌株对As的沉淀

4.5小结

参考文献

第五章利用柠檬酸杆菌DBM处理酸性矿山废水

5.1引言

5.2材料与方法

5.2.1菌种来源、培养基及酸性废水

5.2.2试验装置及示意图

5.2.3试验方法

5.2.4酸性废水的络合试验

5.3结果与分析

5.3.1大宝山酸性矿山废水的性质

5.3.2 AMD的络合预处理

5.3.3硫酸盐的去除效果

5.3.4重金属的去除效果

5.4讨论

5.4.1乳酸钠的配位络合作用

5.4.2硫酸盐和重金属的去除

5.5小结

参考文献

第六章结论、创新及展望

6.1结论

6.2创新点

6.3不足之处及展望

附录 攻读博士期间发表及撰写论文

致谢