一种法氏柠檬酸杆菌Citrobacter farmeri SC01及其应用

摘要

本发明公开一种法氏柠檬酸杆菌Citrobacter farmeri SC01及其应用，该菌是从酚氰废水处理站一级好氧池污泥中，经人工富集培养、分离纯化得到，于2008年1月7号保藏于武汉大学中国典型培养物保藏中心，其简称为CCTCC，保藏编号为CCTCC NO：M208004。本发明的法氏柠檬酸杆菌Citrobacter farmeri SC01可在好氧条件下完全降解苯酚、邻甲酚、间甲酚和1－萘酚，经过114小时完全降解696mg/L的间甲酚，其平均降解速率最高可达8.94mg/(L·h)，而且，该菌对四环素、氯霉素、利福平和链霉素敏感，因此当该菌体被释放到自然环境中时，不会同时携带耐药因子在土著菌之间传播，从而使得该菌能够在废水、土壤酚类污染的治理和修复中得到安全、广泛的应用。

说明书

技术领域

本发明涉及一种能够高效降解酚类的法氏柠檬酸杆菌Citrobacter farmeri SC01及其应用。

背景技术

酚类化合物由一系列酚及其衍生物构成，沸点＜230℃的称为挥发酚。酚进入水体后严重影响地面水质量，使水生原有生物死亡。饮用水受酚污染，嗅和味都会改变。苯酚的制造、炼焦、炼油、冶金、塑料、化纤、绝缘材料、酚醛树脂、制药、炸药、农药等等工业都会有较高浓度的含酚废水。

酚类化合物是一种原型质毒物，对一切生活个体都有毒杀作用，能使蛋白质凝固，所以有强烈的杀菌作用。酚类物质对生物活体均能产生毒害，人们长期饮用被酚污染的水会引起头昏、贫血及各种神经系统疾病；当水中酚类含量大于10mg/L，鱼类等水生生物不能生存；含酚浓度高的废水若用于灌溉，将导致农作物的减产和枯死。含酚废水对人们的生活造成的严重影响和危害，被我国列为重点解决的有害废水之一。

目前国内外处理含酚废水的常用方法主要有物理法(吸附法、萃取法等)、化学法(化学氧化、光催化氧化等)和生物法(活性污泥法、生物膜法等)。根据废水浓度的不同选择不同的处理方法。对含酚浓度较高(＞2000mg/L)、毒性较强的废水，一般采用物理法和化学法；当废水中的酚类化合物浓度较低(＜2000mg/L)时，适于用生物法处理。生物法与物理法和化学法相比，具有经济、高效、无害化、无二次污染以及处理量大的优点。

Atagana，Harrison等从油污污染土壤中筛选出7种非担子类真菌及2种担子类真菌，用它们降解苯酚、间甲酚、邻甲酚及对甲酚混合物。假单胞菌CF600、丛毛睾丸酮单胞菌ZD4-1、红球菌PNAN5、蜡状芽孢杆菌Jp-A、Bacillus Cro3.2、Pseudomonas vesicularis、Alcaligenes eutrophus、Pseudomonas putida EKII、醋酸钙不动杆菌NCIB8250和铜绿假单胞菌ZD4-3等对酚的降解也有报道，能降解甲酚的好氧微生物主要有酵母菌、黄质菌和白腐真菌。

由于高浓度的间甲酚能够抑制微生物的生长，使废水处理的停留时间过长，处理效率较低。一般认为传统生物处理法仅适用于酚类化合物浓度在500mg/L以下。现有的能降解间甲酚的菌种主要有热带假丝酵母菌、麦芽糖假丝酵母菌、杂色云芝和一些厌氧产烷微生物等。Fialova.Arianna等人研究以BOD衡量苯酚类化合物被麦芽糖假丝酵母菌生物降解的快速监测，研究发现，当苯酚浓度为1.7g/L，苯磷二酚浓度为1.5g/L时，酵母菌能利用它们做为唯一的碳源和能源，即便间苯二酚此时浓度达到2g/L，也不会对它们的降解产生影响，同时对甲苯酚也能被降解；汪伦记利用杂色云芝对混合甲酚降解，研究发现低浓度下(100mg/L)下杂色云芝对混合甲酚的平均降解率达到74.8％，在高浓度下(500～1500mg/L)杂色云芝对混合甲酚的降解率随其浓度的升高而降低，最低为12.13％。杂色云芝对混合甲酚降解的平均绝对降解量先随浓度升高而呈大幅度增加的趋势，最高达265.1mg/L；香港大学的Fang，Herbert H.P.通过对产烷微生物降解甲基苯酚的研究指出，邻甲苯酚和间甲苯酚(各自浓度均为225mg/L时)能被部分降解；而热带假丝酵母菌在52h内能完全降解280mg/L的间甲酚为最高效的降解过程，由天津大学的姜岩、闻建平所报道。然而，焦化、石化、油制气、化纤、制药等行业排出含多元酚废水的浓度远高于此。

发明内容

本发明的目的是针对现有技术存在的问题，提供一种能高效降解酚类的法氏柠檬酸杆菌Citrobacter farmeri SC01，该菌可在好氧条件下高效降解间甲酚，并且能利用苯酚、邻甲酚、1-萘酚等多种酚类。

本发明的另一个目的是提供上述法氏柠檬酸杆菌Citrobacterfarmeri SC01在降解多种酚类有机物中的应用。

本发明的法氏柠檬酸杆菌Citrobacter farmeri SC01于2008年1月7号保藏于武汉大学中国典型培养物保藏中心，其简称为CCTCC，保藏编号为CCTCC NO：M208004。

一、高效降解酚类菌株的分离纯化

取广东韶钢焦化厂废水处理站一级好氧池污泥，将污泥置于三角瓶中，不添加营养曝气48小时，静置沉降、过滤，取上清液接入酚类降解菌选择培养基(选择培养基配方为：K₂HPO₄ 2.24g/L，KH₂PO₄2.75g/L，(NH₄)₂SO₄ 1g/L，MgCl₂·6H₂O 0.2g/L，NaCl 0.1mg/L，FeCl₃·6H₂O 0.02g/L，CaCl₂ 0.01mg/L，调节培养基的pH值为6.8～7.0，121℃下灭菌30分钟)，并加入苯酚100mg/L及间甲酚20mg/L为碳源，于恒温摇床内30℃，130转/分钟振荡培养，待溶液浑浊后停止振荡培养，将培养液重新接入新鲜选择培养基，其中的酚浓度适当提高，这样经过多次驯化培养，直至苯酚浓度达到500mg/L，间甲酚浓度达到50mg/L，得到的培养液既为酚类降解菌悬液(作为酚类降解菌源)。

将上述菌悬液转入LB平板培养基(LB培养基配方为：牛肉膏5g/L、蛋白胨10g/L、NaCl 5g/L，调节培养基的pH值为7.0～7.2，制平板时加入1.75％的琼脂)，再加入50mg/L间甲酚1毫升，用玻棒均匀涂布后划线法分离菌悬液，于30℃的恒温培养箱培养24小时，得到单菌落。由于每个单菌落都代表纯菌，因此能在该培养基上生长的菌都具有降解间甲酚的功能，由此得到纯培养间甲酚高效降解菌SC01。

二、菌株SC01的性质

对分离纯化得到的纯培养间甲酚高效降解菌SC01进行各种性质鉴定，结果如下：

1、形态特征

该菌的菌落为奶油色，表面光滑不透明，边缘整齐，菌体短杆至卵圆形。

2、培养特性

该菌的最适生长条件为：pH6～7，30～35℃。

3、生理特性

该菌为革兰氏染色阴性菌，触酶阴性，发酵型，兼性厌氧。

该菌对四环素非常敏感，氯霉素、利福平、青霉素中度敏感，对链霉素低敏。

4、功能特性

该菌能利用间甲酚作为唯一碳源和能源生长繁殖，在纯培养条件下，该菌可完全降解696mg/L的间甲酚，也可分别利用酚、邻甲酚、1-萘酚为唯一碳源和能源生长繁殖，同时将其降解。

根据形态观察及生理生化试验，并查阅《Bergey’s Manual ofDeterminative Bacteriology》和《常见细菌系统鉴定手册》，发现菌株SC01与法氏柠檬酸杆菌(Citrobacter farmeri)最相符合。

三、菌株SC01的16S rDNA序列测定

挑取上述纯培养间甲酚高效降解菌SC01置入约20μL无菌双蒸水中，沸水浴5分钟后作为PCR模板，扩增16S rDNA至1.5kb，测序鉴定，结果如SEQ ID NO：1所示。

将测序得到的碱基序列通过因特网在GenBank等国际核酸序列数据库内进行同源序列搜索(blast search)，找出该株菌与数据库中同源性最高的模式菌株或保藏于ATCC或DSM等国际菌种保藏中心的菌株，结果发现菌种SC01与法氏柠檬酸杆菌Citrobacter farmeri具有最高同源性达99％。

综合对菌株SC01的形态观察、生理生化结果和16S rDNA分子测序结果，可以确定本发明分离纯化得到的纯培养间甲酚高效降解菌为法氏柠檬酸杆菌Citrobacter farmeri SC01。

与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：1.本发明的法氏柠檬酸杆菌Citrobacter farmeri SC01可在好氧条件下可完全降解苯酚、邻甲酚、间甲酚、1-萘酚，经过114小时完全降解696mg/L的间甲酚，其平均降解速率最高可达8.94mg/(L·h)，远高于目前文献报道水平；2.本发明的法氏柠檬酸杆菌Citrobacter farmeri SC01对四环素、氯霉素、利福平和链霉素敏感，因此当该菌体被释放到自然环境中时，不会同时携带耐药因子在土著菌之间传播，从而使得该菌能够在废水、土壤酚类污染的治理和修复中得到安全、广泛的应用。

附图说明

图1为法氏柠檬酸杆菌Citrobacter farmeri SC01的16SrDNA的PCR扩增程序；

图2为法氏柠檬酸杆菌Citrobacter farmeri SC01的生长与间甲酚的降解曲线图；

图3为法氏柠檬酸杆菌Citrobacter farmeri SC01降解间甲酚过程的UV图谱；

图4为法氏柠檬酸杆菌Citrobacter farmeri SC01降解不同初始浓度间甲酚曲线图；

图5为法氏柠檬酸杆菌Citrobacter farmeri SC01降解不同底物的曲线图。

具体实施方式

实施例1高效降解酚类菌株的分离纯化

取广东韶钢焦化厂废水处理站一级好氧池污泥，将污泥置于三角瓶中，不添加营养曝气48小时，静置沉降、过滤，取上清液接入酚类降解菌选择培养基(选择培养基配方为：K₂HPO₄ 2.24g/L，KH₂PO₄2.75g/L，(NH₄)₂SO₄ 1g/L，MgCl₂·6H₂O 0.2g/L，NaCl 0.1mg/L，FeCl₃·6H₂O 0.02g/L，CaCl₂ 0.01mg/L，调节培养基的pH值为6.8～7.0，121℃下灭菌30分钟)，并加入苯酚100mg/L及间甲酚20mg/L为碳源，于恒温摇床内30℃，130转/分钟震荡培养，待溶液浑浊后停止震荡培养，将培养液重新接入新鲜选择培养基，其中的酚浓度适当提高，这样经过多次驯化培养，直至苯酚浓度达到500mg/L，间甲酚浓度达到50mg/L，得到的培养液既为酚类降解菌悬液(作为酚类降解菌源)。

将上述菌悬液转入LB平板培养基(LB培养基配方为：牛肉膏5g/L、蛋白胨10g/L、NaCl 5g/L，调节培养基的pH值为7.0～7.2，制平板时加入1.75％的琼脂)，再加入50mg/L间甲酚1毫升，用玻棒均匀涂布后划线法分离菌悬液，于30℃的恒温培养箱培养24小时，得到单菌落。由于每个单菌落都代表纯菌，因此能在该培养基上生长的菌都具有降解间甲酚的功能，由此得到纯培养间甲酚高效降解菌SC01。

实施例2菌株SC01的性质

对实施例1分离纯化得到的纯培养间甲酚高效降解菌SC01进行各种性质鉴定，结果如表1所示：

          表1菌株SC01的形态观察及生理生化实验结果

  序号  检测内容  结果  1  2  3  4  5  6  7  8  9  10  11    12  13  14  15  16  17  18  19  形态观察  革兰氏染色  接触酶  氧化酶  厌氧生长  葡萄糖氧化发酵  V-P测定  硝酸盐还原  淀粉水解  明胶液化  糖、醇类发酵    苯丙氨酸脱氨酶  柠檬酸盐利用  卵磷脂酶  吲哚  甲基红(MR)  硫化氢  赖氨酸脱羧酶  ONPG测定  奶油色，表面光滑不透明，边缘整齐  革兰氏阴性，短杆至卵圆形  +  -  +，兼性厌氧菌  +，发酵型  -  +  -  -  卫矛醇-，(甘露醇、山梨醇、棉籽糖、乳糖、  蔗糖、海藻糖、木糖、鼠李糖、阿拉伯糖、  蜜二糖)+  -  +  -  +  +  -  -  +

注：+表示阳性反应，-表示阴性反应。

根据形态观察及生理生化试验，并查阅《Bergey’s Manual ofDeterminative Bacteriology》和《常见细菌系统鉴定手册》，发现菌种SC01与法氏柠檬酸杆菌(Citrobacter farmeri)最相符合。

实施例3菌株SC01的16S rDNA序列测定

挑取上述纯培养间甲酚高效降解菌SC01置入约20μL无菌双蒸水中，沸水浴5分钟后作为PCR模板，扩增16S rDNA至1.5kb，PCR的扩增反应体系为50μL：

无菌双蒸水               36.5μL

10×PCR缓冲液             5.0μL

2.5mmol·L^-1dNTP         5.0μL

10μmol·L^-1F27          1.0μL

10μmol·L^-1R1522        1.0μL

5U·(μL)^-1Blend-Taq     0.5μL

模板DNA                  1.0μL

PCR反应程序如图1所示。

将扩增产物测序鉴定，测序结果如SEQ ID NO：1所示，通过GenBank进行比对，菌种SC01与法氏柠檬酸杆菌Citrobacter farmeri具有最高同源性达99％。

综合实施例2的形态观察、生理生化结果和实施例3的分子测序结果，可以得出结论本发明分离纯化得到的纯培养间甲酚高效降解菌SC01为法氏柠檬酸杆菌Citrobacter farmeri SC01。

实施例4法氏柠檬酸杆菌Citrobacter farmeri SC01降解间甲酚的性能

将法氏柠檬酸杆菌Citrobacter farmeri SC01接种至含间甲酚约40mg/L的选择培养基中，在170转/分钟、30℃摇床中振荡培养，前10小时每小时取样、之后在14、19、24小时取样，分别测定培养液中的间甲酚残余浓度，结果见图2。在图2的间甲酚降解曲线中，Citrobacter farmeri SC01对间甲酚的降解基本没有迟滞期，在第4小时后降解速度达到最大，在第9小时间甲酚完全降解，在此期间菌体浓度增加1.5倍，之后由于碳源(间甲酚)的不足，菌体的进一步增殖缺乏碳源支持，生长开始进入内源消耗期，菌体量开始下降。

随着不断强化的驯化过程，该菌对间甲酚的降解能力逐步提高，后又进行了降解过程的紫外扫描见图3。从中可以看出，间甲酚的特征吸收峰最大值在271纳米附近，这一波段也是苯环的特征吸收峰。随着降解的进行，间甲酚(及其中间产物)的量不断减少，在第7小时，特征峰已经消失，表明间甲酚及其带苯环的中间产物均被完全降解。

实施例5法氏柠檬酸杆菌Citrobacter farmeri SC01降解不同初始浓度间甲酚的性能

将法氏柠檬酸杆菌Citrobacter farmeri SC01接至不同初始浓度的间甲酚溶液中(各溶液的浓度如表2所示)，考察其对浓度冲击的耐受能力，实验结果见图4。从图4可以看出，间甲酚浓度在100～700mg/L之间时，该菌对间甲酚的降解均有一定时间的适应期，随着初始浓度的提高，适应期增长(见表2)，在不扣除适应期的情况下，平均降解速率有提高再降低的趋势，于304mg/L时达到最大值，浓度更高时由于适应期长，导致平均降解速率降低。法氏柠檬酸杆菌Citrobacter farmeri SC01对不同浓度间甲酚降解的条件实验，显示其对高浓度的间甲酚有较强的耐受和降解利用能力，具备在实际废水处理过程中抗浓度冲击负荷的能力，具有良好应用前景。

        表2不同初始浓度间甲酚中法氏柠檬酸杆菌Citrobacter farmeri

                            SC01的降解速率

  初始浓度  (mg/L)  211  304  408  475  604  697  适应期(h)  平均降解速  率(mg/(Lh)  15  8.15  17  8.94  25  7.70  32  7.43  50  7.50  72  6.11

实施例6法氏柠檬酸杆菌Citrobacter farmeri SC01对多种酚的降解

将法氏柠檬酸杆菌Citrobacter farmeri SC01接至不同浓度的苯酚、邻甲酚、间甲酚和1-萘酚反应液中，考察其对其它酚类的降解能力，降解过程曲线见图5。它们之间的降解速度大小为苯酚＞对甲酚＞间甲酚＞1-萘酚。造成这种结果的原因是，苯环上的取代基分为邻对位定位基和间位对位基两类：-O^-、-NH₂、-OH、-C₆H₅、-CH₃、-X等只有单键或带负电荷，它们具有邻对位定位效应，可使苯环活化(卤素除外)；-NO₂、-COOH等具有重键或带正电荷，这类取代基具有间位定位效应，取代反应都比苯困难，即会使苯环钝化。苯环上的酚羟基能够活化邻、对位基团，因而当甲基处于邻、对位时比在间位更易被攻击，因此邻、对位甲酚比间甲酚更容易被降解，在约42mg/L的初始浓度下，苯酚、对甲酚和间甲酚所需的降解时间分别为11小时、12小时和13小时；而1-萘酚具有双环的相对更为稳定的结构，相对单环酚类，降解速度最慢，初始浓度为22mg/L时，需要28小时才能降解完毕。该实例说明法氏柠檬酸杆菌Citrobacter farmeri SC01能够降解不同类型的酚类，在多种酚共存的实际废水发挥作用。

实施例7法氏柠檬酸杆菌Citrobacter farmeri SC01的抗生素敏感性实验

抗生素敏感性实验采用牛津杯法，将几种常见抗生素如青霉素、氯霉素、链霉素、四环素和利福平分别配成一定浓度进行实验。首先取0.1mL 1×10⁶g/mL的菌液涂于20mL培养基，每个平板上放置3个牛津杯，在牛津杯中加入0.1mL抗生素，32℃培养箱中过夜，敏感性实验以抑菌圈直径来评定：抑菌圈在20nm以上定义为极敏，15-20mm为高敏，10-14mm为中敏，小于10mm为低敏，没有抑菌圈的为不敏，法氏柠檬酸杆菌Citrobacter farmeri SC01对上述5种抗生素的敏感性实验结果见表3。本实例说明当菌体经实验室的筛选重新投放到自然环境或实际废水处理的污泥中是，不会因携带耐药因子而在土著菌之间传播，具备了实际应用的可行性。

表3法氏柠檬酸杆菌Citrobacter farmeri SC01的抗生素敏感性实

                        验结果

  序号  抗生素名  称 剂量(μg)  抑菌圈平均直径  (mm)  判定结果  1  2  3  4  5  青霉素  链霉素  利福平  氯霉素  四环素  10  10  5  30  30  0  9.3  10.3  12.0  20.3  不敏-  低敏+  中敏++  中敏++  高敏++++

一种法氏柠檬酸杆菌Citrobacter farmeri SC01及其应用序列表.txt

SEQUENCE LISTING