控制丝状真菌发酵过程中生长形态的方法

摘要

本发明涉及一种控制丝状真菌发酵过程中生长形态的方法，属于生物工程领域。本发明将木质纤维素水解后得到的水解液经脱毒处理后，添加至丝状真菌发酵培养基中进行液体发酵培养，获得球状的具有生物催化活性的丝状真菌团体。本发明解决了现有技术条件中丝状真菌成球控制条件苛刻，控制条件重复性差，菌球直径分布不稳定等缺点。该技术手段操作条件范围广，操作简便可行，可有效降低对设备的要求，使其相对于其他技术手段而言，更具有工业化竞争力。

说明书

技术领域

本发明属于生物工程领域，涉及一种控制丝状真菌发酵过程中生长形态的方法。具体涉及在微生物生长的必需培养基中，以利用木质纤维素作为添加物，在发酵过程中控制丝状真菌生长形态的方法。

背景技术

丝状真菌广泛运用于工业化生产，其产品包括有机酸、酶制剂、抗生素、色素、小分子多肽等。在产业化生产中，深层发酵的丝状真菌在通常情况下存在3种形态：分散的菌丝体，球状和团块状。不同形态的丝状真菌会直接影响发酵体系中物性参数、基质传递等，所以形态对发酵产品的生成，发酵过程的控制至关重要，而且不同的产品对发酵的形态要求各不相同。例如：在利用黑曲霉进行酶制剂生产的时候，常常需要将其生长形态控制为分散的菌丝体状；而同样利用黑曲霉进行壳聚糖发酵的时候，则菌球状的形态更有利于产品产量的提高。

分散的菌丝体利于丝状真菌细胞的呼吸，传质也较好，但流变性相对较差，利于酶制剂、抗生素等产品的生产；规则的、适宜大小球状真菌则有利于有机酸、壳聚糖等产品的生产；而团块状的真菌在搅拌式发酵罐发酵过程中，会缠绕在搅拌器上或者附壁，造成传质传氧的限制，最终导致不能得到目标产品，发酵失败，但是在进行转盘上固定化丝状真菌进行生产时，团状的形态却能够很好的固定于转盘等载体之上。由此可见，不同的发酵工程对丝状真菌发酵的形态要求，差异是非常大的。因此，控制丝状真菌形态的技术是发酵过程控制的热点与重点。

与此相对应的问题是，由于发酵过程的复杂性，以及菌球形态控制本身会受到多种因素的影响，比如说菌种自身的影响，生长营养环境的影响，发酵操作条件的影响等等，最终使得丝状真菌的形态的不能控制为理想的形态，或者菌球控制的重复性以及平行性不好。这就使得高效简便的形态控制技术显得尤其重要。 在利用丝状真菌产有机酸的过程中，球状成为公认的最佳形态，在固定化技术迅速发展的今天，各种技术方案应运而生，控制菌体生长成为菌球的自固化技术也得到了巨大的发展。现有的各种技术方案中，各自存在自己的特点与缺陷。

在菌种选育方面，通过菌种选育改变菌种的特性，或者进行代谢的改造，最终使所获得的菌株能在各种培养条件下均能成为菌球。但是，菌种选育以及代谢工程的技术缺点是：由于菌种突变的随机性，使得筛菌的工作只能针对某种或某几种特定的性状进行筛选，而且筛选周期没有期限，存在菌种退化现象等。

也有文献指出(Driouch, H., B.Sommer, et al. 2010. Morphology engineering of Aspergillus niger for improved enzyme production. Biotechnology and Bioengineering 105(6): 1058-1068.)，利用微粒子在流场中与生产菌株的作用可以作为形态控制的有效策略。在利用黑曲霉产酶的时候，在发酵体系中加入二氧化硅等微粒子，有效将微生物体系的形态控制为丝状，达到了高产的目的。其技术方案的出发点是，由于酶制剂发酵的特点，需要将丝状真菌的形态控制为丝状，从而有利于酶的生产，利用微粒子在流场中与生产菌株的作用，最终达到了控制丝状真菌形态的目的。而且，其技术方案的前提是，该类型的菌种由于自身的生长特性，不因为环境的改变而能很好的形成菌球。在不同的发酵体系中，进行有机酸及其壳聚糖等产品的发酵生产时，球状是最佳的生产形态，添加微粒子的技术路线并不能有效将丝状真菌控制为菌球形态。

另外，有文献（Liu, Y., W. Liao, et al. (2008).  Study of pellet formation of filamentous fungi Rhizopus oryzae using a multiple logistic regression

反应器的操作条件调控也是控制丝状真菌形态的技术路线之一。常用的方法是控制发酵体系中通气量的大小、通气成分中氧气及二氧化碳在整个通气成分中比例的大小；调整STR发酵罐中搅拌速率，搅拌桨的类型，从而改变发酵体系中的流场特性和传质传氧情况，进而调控菌球的形态。例如：Jüsten（Jüsten, P., G. Paul, et al. (1998). Dependence of Penicillium chrysogenum growth, morphology, vacuolation, and productivity in fed-batch fermentations on impeller type and agitation intensity. Biotechnology and Bioengineering 59(6): 762-775.）通过改变发酵桨叶的类型以及搅拌的速率，有效控制了青霉菌的发酵形态，达到青霉素高产的目的。该技术方案的缺陷是调整的效果极其有限，不能有效满足工业生产中的操作要求。

综上可见，现有技术条件操作方法繁复，工艺条件苛刻，不能满足有效控制丝状真菌发酵型态的问题，可控性不高。因此，进行高效便捷的技术方案的设计，控制丝状真菌发酵生长形态，成为必然需求。发明人在前期的工作中发现，利用丝状真菌进行各种产品的生产时，纤维素水解液对丝状真菌的形态存在明显的影响，而对于其影响菌球形态的机理，发明人正在探索之中。因此，发明人期望在此发现之上，提供一种粗放的操作条件与精准的控制效果相结合的技术方案，从而实现形态的有效控制。

发明内容

本发明的技术目的是提供一种控制丝状真菌发酵过程中生长形态的方法，使得本方法能高效便捷地控制丝状真菌发酵过程中的生长形态，提高丝状真菌的发酵产率。

为了实现本发明的技术目的，本发明的技术方案为：

一种控制丝状真菌发酵过程中生长形态的方法，其特征在于将木质纤维素水解后得到的水解液经脱毒处理后，添加至丝状真菌发酵培养基中进行液体发酵培养，获得球状的具有生物催化活性的丝状真菌团体。

其中，本发明所述的木质纤维素的水解方法应理解为现有技术中任意的木质纤维素水解方法，即常规的木质纤维素处理方法。此方法即将诸如秸秆、玉米芯、甘蔗渣等木质纤维素原料用烯酸浸泡、高温加热处理、蒸爆酶解处理的方法；木质纤维素酸解液脱毒的方法也是现有技术中任意水解液脱毒的方法，例如向水解液中加入活性炭、Ca(OH)₂固体进行吸附脱毒处理，中和水解液酸性等方法。

本发明所述的木质纤维素酸解后的水解液脱毒处理后pH值为6～11，并灭菌冷却。

本发明所述的丝状真菌发酵培养基也应理解为现有技术中任何的常规丝状真菌发酵培养基。例如，米根霉发酵生产富马酸的常规发酵培养基、黑曲霉发酵生产壳聚糖/甲壳素的常规发酵培养基等等。丝状真菌生长所必需的营养物质，均包括碳源、氮源、无机盐、水分，将它们配制为一定浓度的溶液，控制pH范围为2～6，灭菌并冷却。举例的培养基配方为：葡萄糖或者木糖10～150 g/L，尿素0.1～4 g/L，KH₂PO₄ 0.5～2g/L，MgSO₄·7H₂O 0.1～1g/L，ZnSO₄·7H₂O 0.002～0. 1g/L, FeSO₄·7H₂O 0.01～0.1 g/L。

本发明所述的脱毒后的木质纤维素水解液向培养基中的添加量为：水解液体积占发酵培养基体积的0.5%～90%。

本发明所述的丝状真菌包括但不限于曲霉属，根霉属，毛霉属，或者青霉属。

本发明所述的液体发酵培养的条件是，控制发酵pH值2～6，接入丝状真菌孢子悬浮液，于30～35℃下培养12～72小时。

本发明所述的具有生物催化活性的丝状真菌团体可以作为发酵生产预培养的种子或者产品提取所需要的生物量。

本发明的有益效果在于：

（1）利用木质纤维素酸解液控制菌球形态，成功解决了丝状真菌发酵过程中控制困难的技术难题。相对于现有技术方案进行发酵过程中菌球形态的控制，该技术方案成本低廉，简便易行，可操作性强，效果显著，重复性较好。

（2）通过该技术进行形态控制，可有效增加发酵产物如富马酸、甲壳素/壳聚糖等产品的产量。相对于现行技术方案，增加了发酵产品的产出，提高了生产该类产品企业的收益。利用木质纤维素控制菌球形态，可有效降低生产时对设备精度的要求，从而降低生产设备的成本。使得该技术在工业化应用中更具有竞争优势。

（3）本发明的技术要点在于向丝状真菌常规发酵培养基中添加木质纤维素水解液，即可完全实现对丝状真菌菌体形态的控制，但是目前此方法的具体作用原理有待于进一步探索。

具体实施方式

实施例1

本实施例说明现有技术中一种以稀酸处理木质纤维素并脱毒的获得木质纤维素脱毒水解液的方法。在本发明专利中所使用的木质纤维素水解液不受该方法的限制，该方法提供的技术只是可适用于现有技术方法中水解木质纤维素的一种。

（1）将木质纤维素原料：农业废弃玉米秸秆，用除尘设备除杂，将秸秆粉碎，过标准筛，取粒径为40-60目之间的微粒。

（2）秸秆微粒用1%的稀硫酸浸泡处理24小时，过滤得到秸秆滤渣，往滤渣中添加3%的硫酸，在100℃处理3小时。

（3）将步骤2所获得成分过滤，滤液即为木质纤维素水解液。

（4）将在步骤3所获得的木质纤维素水解液中加入Ca(OH)₂固体进行吸附脱毒处理，直至pH升至6.0，过滤，所得到滤液即为木质纤维素脱毒水解液。

（5）115℃灭菌30min，冷却待用。

实施例2

本实施例说明现有技术中一种以蒸汽爆破的方法预处理木质纤维素并经脱毒获得脱毒木质纤维素水解液的方法。

（1）将木质纤维素原料：农业废弃稻草，将稻草粉碎为2-3 cm的颗粒。

（2）在该颗粒中按质量比物料比稀硫酸为10:1加入质量浓度为0.5%的稀硫酸，控制温度为50℃，酸浸泡干燥后，在蒸汽爆破装置中蒸爆，获得酸蒸爆物料。

（3）将上述酸蒸爆物料进行水溶，用稀硫酸将pH调制5.0，加入纤维素水解酶进行水解，控制酶水解的底物浓度5%-10%，过滤得到纤维素水解液。

（4）将在步骤3所获得的木质纤维素水解液中加入活性炭固体进行吸附脱毒处理，并用NaOH将pH调整至11，过滤，所得到滤液即为木质纤维素脱毒水解液。

（5）115℃灭菌30min，冷却待用。

实施例3

本实施例说明利用木质纤维素脱毒水解液控制菌球形态方法的步骤。

菌种：本实施例的菌种均是工业生产中常用的具有典型代表的丝状真菌，黑曲霉（Aspergillus niger CICC 2160）孢子悬浮液、米根霉（Rhizopus oryzae CICC 3087）孢子悬浮液、少根根霉（Rhizopus arrhizus NRRL 1526）孢子悬浮液、橘青霉（Penicillium citrinum CICC 4011）孢子悬浮液。

（1）培养基的配制：基础培养基包括，葡萄糖150 g/L，尿素4 g/L，KH₂PO₄ 0.5 g/L，MgSO₄·7H₂O 1 g/L，ZnSO₄·7H₂O 0.01 g/L,  FeSO₄·7H₂O 0.01 g/L, 葡萄糖和KH₂PO₄，金属离子，尿素分开灭菌，115℃灭菌30min；

（2）添加木质纤维素脱毒水解液：在基础培养基中按体积百分数为0.5%的量加入实施例1中所述木质纤维素脱毒水解液，用H₂SO₄将pH调控为6.0，并控制500 mL摇瓶的最终装液量为50 mL；

（3）菌体的培养：往步骤（1）所述培养基中加入黑曲霉（Aspergillus niger CICC 2160）孢子悬浮液1mL，于35℃，摇床转速为200rpm，培养72小时，获得表面光滑的球状团体，该细胞团体可以用作发酵生产柠檬酸的种子，也可用于生产壳聚糖/甲壳素所需的生物量。

实施例4

本实施例说明一种利用木质纤维素脱毒水解液控制菌球形态方法的效果。

（1）培养基的配制：基础培养基包括，葡萄糖10 g/L，尿素2 g/L，KH₂PO₄ 0.6 g/L，MgSO₄·7H₂O 0.5 g/L，ZnSO₄·7H₂O 0.02 g/L,  FeSO₄·7H₂O 0.1 g/L, 葡萄糖和KH₂PO₄，金属离子、尿素分开灭菌，115℃灭菌30min；

（2）添加木质纤维素脱毒水解液：在基础培养基中按体积百分数为6%的量加入实施例2中所述木质纤维素脱毒水解液，用H₂SO₄将pH调控为2.6，并控制500mL摇瓶的最终装液量为50mL；不加入纤维素脱毒水解液的培养基作为对照。

（3）菌体的培养：往步骤（2）所述培养基中加入米根霉（Rhizopus oryzae CICC 3087）孢子悬浮液1mL，于35℃，摇床转速为200rpm，培养24小时，结果显示对照组形成分散的菌丝体和少量菌球，加入纤维素水解脱毒液的培养基中菌体为表面光滑的球状团体。

实施例5

本实施例说明一种利用木质纤维素控制菌球生长形态方法进行富马酸发酵生产的有益效果。

（1）种子培养基的配制：基础培养基包括，木糖50 g/L，尿素2 g/L，KH₂PO₄ 0.5 g/L，MgSO₄·7H₂O 0.5 g/L，ZnSO₄·7H₂O 0.002 g/L,  FeSO₄·7H₂O 0.05 g/L, 葡萄糖和KH₂PO4，金属离子、尿素分开灭菌，115℃灭菌30min，

（2）添加木质纤维素脱毒水解液：在基础培养基中按体积百分数为2%的量加入实施例1中所述木质纤维素脱毒水解液，并控制500mL摇瓶的最终装液量为50mL，不加入纤维素脱毒水解液的培养基作为对照，用H₂SO₄将pH调控为2.0。

（3）发酵培养基的配制：葡萄糖120 g/L，尿素0.1 g/L，KH₂PO₄ 0.6 g/L，MgSO₄·7H₂O 0.1 g/L，ZnSO₄·7H₂O 0.002 g/L,  FeSO₄·7H₂O 0.01 g/L, 葡萄糖和KH₂PO4，金属离子、尿素分开灭菌，将过量CaCO₃加入培养基中，使发酵过程中pH控制在5-6之间。

（4）添加木质纤维素脱毒水解液：在发酵培养基中按体积百分数为2%的量加入实施例1中所述木质纤维素脱毒水解液，不加入纤维素脱毒水解液的培养基作为对照。

（5）种子培养：在步骤（1）中所获得培养基中接种1mL少根根霉（Rhizopus arrhizus NRRL 1526）孢子悬浮液，于35℃，摇床转速为200rpm，培养24小时，获得表面光滑的菌球种子。

（6）发酵培养：将上述步骤（3）中所获得种子液以15%的接种量接入步骤（2）所述的发酵培养基中，于35℃，摇床转速为200rpm，培养72小时，获得富马酸发酵液。

（7）结果显示，发酵液中的富马酸浓度为50.1 g/L，对照组中的富马酸浓度为45.3 g/L。

实施例6

本实施例说明一种利用木质纤维素控制菌球生长形态方法进行壳聚糖/几丁质发酵生产的有益效果。

（1）培养基的配制：基础培养基包括，木糖10 g/L，尿素0.1 g/L，KH₂PO₄ 2 g/L，MgSO₄·7H₂O 0.5 g/L，ZnSO₄·7H₂O 0.1 g/L,  FeSO₄·7H₂O 0.01 g/L, 葡萄糖和KH₂PO₄，金属离子、尿素分开灭菌，115 ℃灭菌30 min。

（2）添加木质纤维素：在基础培养基中按体积百分数为90%的量加入实施例2中所述木质纤维素脱毒水解液，并控制250 mL摇瓶的最终装液量为50 mL，不加入纤维素脱毒水解液的培养基作为对照，用H₂SO₄将pH调控为2.0。

（2）菌体培养：用摇瓶进行一级培养，培养条件为向培养基中接种橘青霉的孢子终浓度为2×10⁹个/L，接入250 mL的摇瓶中，装液量为50 mL，于温度30 ℃，200 rmp下培养24小时，得到发酵种子；以10%的接种量接入7 L的搅拌式发酵罐中，装液量为5 L，于30 ℃，150 rmp，通气量为0.5 vvm，培养12小时，得到含有甲壳素/壳聚糖的发酵产物。

（3）甲壳素的提取：将菌体烘干至恒重，向菌体中加入2%的NaOH溶液，121 ℃消化两小时，脱去蛋白质，离心，过滤；取沉淀物，加入2%的乙酸60 ℃处理2小时，离心，沉淀物即为甲壳素，水洗至中性，分别用95%乙醇和丙酮洗涤3次，干燥得到精制甲壳素。

（4）壳聚糖的提取：在壳聚糖提取过程中离心得到的上清液即为壳聚糖溶液，用10%的NaOH溶液将溶液的pH调整至9.0，离心取沉淀物，水洗至中性，即为壳聚糖粗品，加入2%的乙酸60 ℃处理2小时，离心，沉淀物即为甲壳素，水洗至中性，分别用95%乙醇和丙酮洗涤3次，干燥得到精制壳聚糖。

（5）结果对比见表1。

表1 数据统计结果