白花蛇舌草有效部位及其制备方法

摘要

本发明公开了一种白花蛇舌草有效部位及其制备方法，本发明通过对白花蛇舌草的有效部位进行纯化，并对其中总环烯醚萜苷和6-O-对香豆酰鸡屎藤苷甲酯进行了含量测定，进一步明确了该有效部位中抗肿瘤的有效成分，有利于提高产品的稳定性；同时，通过小鼠的抗肿瘤实验以及与临床常用抗肿瘤药物环磷酰胺的对照，显示本发明白花蛇舌草有效部位的抗肿瘤作用明显。

说明书

技术领域

本发明涉及医药技术领域，特别是涉及一种白花蛇舌草有效部位及其制备方法、检测方法，以及其在制备抗肿瘤药物中的应用。

背景技术

白花蛇舌草是民间常用的一种中药，其味苦、甘、性寒，归心、肺、肝、大肠经。主要功效为清热解毒，利湿，抗癌，主治肺热喘咳、咽喉肿痛、肠痈疮疡、毒蛇咬伤、热淋涩痛、水肿、痢疾、肠炎、湿热黄疽、癌肿等。近年来，许多学者对白花蛇舌草的抗肿瘤作用进行了研究，其抗肿瘤的有效成分多而且较为复杂。但是迄今未见涉及白花蛇舌草有效部位及其制备方法和用途的专利。

发明内容

本发明的目的在于提供一种白花蛇舌草有效部位及其制备方法，还提供一种白花蛇舌草有效部位的检测方法，还提供一种白花蛇舌草在制备抗肿瘤药物中的应用。

本发明白花蛇舌草有效部位的制备方法为：

提取：取药材白花蛇舌草加8-16重量倍的45-80％乙醇，提取1-3次，每次1-3小时，合并提取液，浓缩；

纯化：以石油醚萃取浓缩物的水溶液2-5次，去除石油醚层，上D-101型大孔树脂柱，上样浓度为2.6-5.2mg/mL，按照2-6mL/min的吸附流速进行动态吸附，其中径高比为1∶4～1∶13，分别用水、10-30％、20-45％、25-60％乙醇溶液以2-5mL/min的流速进行洗脱，收集25-60％洗脱部分并蒸干，温度不高于60℃，真空干燥后即得白花蛇舌草有效部位，有效部位中6-0-对香豆酰鸡屎藤苷甲酯含量为50-85％。

本发明白花蛇舌草有效部位的检测方法为如下含量测定中的一种或几种：

本发明白花蛇舌草有效部位中总环烯醚萜苷的含量测定：

精密称取6-0-对香豆酰鸡屎藤苷甲酯对照品0.0015-0.0038重量份，置10mL量瓶中，加水6-10体积份，以功率250W，频率40kHz超声处理3-8分钟，放冷，用水稀释至刻度，摇匀，即得对照品溶液，其中每1mL含6-0-对香豆酰鸡屎藤苷甲酯0.267mg；

取本发明白花蛇舌草有效部位0.02-0.04重量份，精密称定，置10mL量瓶中，加水6-12体积份，以功率250W，频率40kHz超声处理15-30分钟，放冷，用水稀释至刻度，摇匀，即得。

取0.2-0.8体积份待测溶液，置10mL量瓶中，50-85％乙醇加至2-8体积份，加入30-70％盐酸1-3体积份，摇匀，80℃水解15-40分钟，取出，立即冷却，加入1-3体积份对二甲氨基苯甲醛溶液，用50-85％乙醇定容，摇匀，室温放置20-45分钟，在640nm处用分光光度计测定溶液吸光度，根据回归方程计算本发明白花蛇舌草有效部位中总环烯醚萜苷的含量为85％-96％。

本发明白花蛇舌草有效部位中6-0-对香豆酰鸡屎藤苷甲酯含量测定：

色谱条件：色谱柱采用YMC-C18柱：250mm×4.6mm，5μm；检测波长为310nm；进样量为10μL，流速为1.0mL/min；柱温为30℃；以乙腈为流动相A，以0.05％甲酸水溶液为流动相B，进行梯度洗脱，梯度条件为：时间0～15～20～30～60分钟，流动相A乙腈由15％～20％～20％～25％～25％；

对照品溶液的制备：精密称取6-0-对香豆酰鸡屎藤苷甲酯对照品适量，加40-60％甲醇制成每1ml含6-0-对香豆酰鸡屎藤苷甲酯0.105mg的溶液；精密量取上述6-0-对香豆酰鸡屎藤苷甲酯溶液0.5-1.5体积份，置10mL量瓶中，加40-60％甲醇稀释至刻度，摇匀，即得每1ml含6-0-对香豆酰鸡屎藤苷甲酯20.9μg的溶液；

供试品溶液的制备：取本发明白花蛇舌草有效部位0.0025-0.0048重量份，精密称定，置100mL量瓶中，加40-60％甲醇60-85体积份，以功率250W，频率40KHz超声处理8-12分钟，取出，放冷，加40-60％甲醇至刻度，摇匀，用0.45μm的微孔滤膜滤过，取滤液，即得；

测定法：分别精密吸取上述对照品溶液、及供试品溶液各0.008-0.012体积份，注入液相色谱仪，测定，即得。

本发明白花蛇舌草有效部位中含香豆酸以6-0-对香豆酰鸡屎藤苷甲酯计为60-85％。

本发明所述的重量份与体积份的关系为g/ml的关系。

本发明白花蛇舌草有效部位可以单独、组合或与其它任何中西药物按任意比例配伍，加入常规辅料，按照常规工艺，制成胶囊剂、片剂、丸剂、颗粒剂、口服液体制剂、注射剂等药学上可接受的各种剂型。

其中注射液原料纯度大于80％。

本发明通过对白花蛇舌草的有效部位进行纯化，并进行了白花蛇舌草有效部位中总环烯醚萜苷和6-0-对香豆酰鸡屎藤苷甲酯的含量测定，进而明确了该有效部位中抗肿瘤的有效成分，有利于提高产品的稳定性。同时，通过小鼠的抗肿瘤实验以及与临床常用抗肿瘤药物环磷酰胺的对照，显示本发明白花蛇舌草有效部位的抗肿瘤作用明显。

附图说明

图1：图A为样品紫外吸收图，图B为样品液相图，图C为对照品液相图，图D，E为样品质谱图

图2：总环烯醚萜苷光谱扫描图

图3：6-0-对香豆酰鸡屎藤苷甲酯标准曲线

图4：6-0-对香豆酰鸡屎藤苷甲酯标准曲线

图5：6-0-对香豆酰鸡屎藤苷甲酯标准曲线

下面实验例和实施例进一步说明但不限于本发明。

实验例1白花蛇舌草纯化后有效部位的鉴定

实验条件：

仪器：Waters-Micromass(HPLC-MS)

色谱条件如(表1)；

色谱柱：YMC-C18柱(250mm×4.6mm，5μm)；

流动相：流动相A为水(0.05％甲酸)，流动相B为乙腈，梯度条件见下表1；

流速：1.0mL/min；

检测波长：310nm；

柱温：35℃；

进样体积：10μL。

表1液相分析梯度洗脱条件考察

取实施例1制备的本发明白花蛇舌草有效部位0.1g，于10mL的容量瓶中，加50％甲醇超声溶解，并定容至刻度，摇匀，即得供试品溶液。得到色谱图如图1，经UV，HPLC-MS图谱及文献对比，确定可得有效部位含6-0-对香豆酰鸡屎藤苷甲酯含量达70％左右。其中，紫外图(图A)确定了该有效部位的紫外最大吸收值为310nm左右；液相图B为有效部位的液相图，该图谱中18分钟左右的主峰与液相图C中6-0-对香豆酰鸡屎藤苷甲酯对照品的主峰出峰时间基本一致，为18分钟左右。图D，E分别为有效部位18分钟左右主峰和对照品的一级与二级质谱图，在两图中碎片峰m/z分别为：549，387，223，163，119.经与文献及对照品的碎片峰相比较，可断定该有效部位的主要成分为6-0-对香豆酰鸡屎藤苷甲酯。

实验例2白花蛇舌草初提物中总环烯醚萜苷的含量测定

1、对照品溶液的制备

精密称取6-0-对香豆酰鸡屎藤苷甲酯对照品2.62mg，置10mL量瓶中，加水8mL，超声处理(功率250W，频率40kHz)5分钟，放冷，用水稀释至刻度，摇匀，即得对照品溶液(每1mL含6-0-对香豆酰鸡屎藤苷甲酯0.262mg)。

2、供试品溶液的制备

取实施例1制备的本发明白花蛇舌草初提物90mg，精密称定，置10mL量瓶中，加水8mL，超声处理(功率250W，频率40kHz)20分钟，放冷，用水稀释至刻度，摇匀，即得。

3、显色条件

取0.5mL待测溶液，置10mL量瓶中，75％乙醇加至4mL，加入50％盐酸2.0mL，摇匀，80℃水解20min，取出，立即冷却，加入2mL对二甲氨基苯甲醛溶液，用75％乙醇定容，摇匀，室温放置30min，在640nm处用分光光度计测定溶液吸光度。

4、吸收波长的选择

取对照品溶液和供试品溶液各0.5mL，按照实验例2中的显色条件项显色，500～800nm间进行扫描，结果见图2。表明对照品溶液和供试品溶液在640nm处都有最大吸收，图谱形状基本一致。

5、线性关系的考察

取对照品溶液0.20，0.40，0.60，0.80，1.00mL，按照实验例2中的显色条件项显色，640nm处测定吸光度值，结果见表2。以对照品浓度(mg/mL)为横坐标，吸光度(A)为纵坐标作标准曲线(见图3)，计算标准曲线的回归方程。

表2线性关系测定结果

经计算回归方程为Y_{6-0-对香豆酰鸡屎藤苷甲酯}＝0.0033X+0.1187，R＝0.9996；结果表明，6-0-对香豆酰鸡屎藤苷甲酯在52.4～262ug/mL范围内成线性关系。

6、精密度实验

取对照品溶液0.5mL，按照实验例2中的显色条件项显色，连续测定5次吸光度，并计算RSD值，结果见表3。

表3精密度实验结果

实验结果表明仪器精密度和操作精密度良好。

7、重复性实验

取供试品溶液5份，按照实验例2中的显色条件项平行操作显色，测定其吸光度，结果见表4。

表4重复性实验结果

实验结果表明该方法重复性良好。

8、稳定性实验

取供试品溶液0.5mL，按照实验例2中的显色条件项显色，显色后0～60min间，每隔10min测定1次吸光度，结果见表5。

表5稳定性实验结果

实验结果表明，样品显色后在0～60min内基本稳定。

9、加样回收率实验

称取已知含量的样品5份，精密称定，置10mL量瓶中，分别加入6-0-对香豆酰鸡屎藤苷甲酯对照品溶液(浓度为1.5mg/mL)9.0mL，按照实验例2中的方法制备供试品溶液后，按照实验例2中的显色条件项显色，进行测定，计算6-0-对香豆酰鸡屎藤苷甲酯的回收率，结果见表6。

表6加样回收率测定结果

计算平均回收率为99.05％，RSD为1.47％。

10、样品测定

取实施例1制备的三批白花蛇舌草初提物，每批2份，每份约90mg，精密称定，按照实验例2中的方法制备供试品溶液后，按照实验例2中的显色条件项显色，进行测定，根据回归方程计算白花蛇舌草有效部位初提物中总环烯醚萜苷含量，结果见表7。

表7样品测定结果

经计算白花蛇舌草初提物中总环烯醚萜苷的平均含量为30.07％。

实验例3白花蛇舌草纯化后有效部位中总环烯醚萜苷的含量测定

1、对照品溶液的制备

精密称取6-0-对香豆酰鸡屎藤苷甲酯对照品2.67mg，置10mL量瓶中，加水8mL，超声处理(功率250W，频率40kHz)5分钟，放冷，用水稀释至刻度，摇匀，即得对照品溶液(每1mL含6-0-对香豆酰鸡屎藤苷甲酯0.267mg)。

2、供试品溶液的制备

取实施例1制备的本发明白花蛇舌草纯化物约28mg，精密称定，置10mL量瓶中，加水8mL，超声处理(功率250W，频率40kHz)20分钟，放冷，用水稀释至刻度，摇匀，即得。

3、显色条件

取0.5mL待测溶液，置10mL量瓶中，75％乙醇加至4mL，加入50％盐酸2.0mL，摇匀，80℃水解20min，取出，立即冷却，加入2mL对二甲氨基苯甲醛溶液，用75％乙醇定容，摇匀，室温放置30min，在640nm处用分光光度计测定溶液吸光度。

4、吸收波长的选择

取对照品溶液和供试品溶液各0.5mL，按照实验例3显色条件项显色，500～800nm间进行扫描，结果见图2。表明对照品溶液和供试品溶液在640nm处都有最大吸收，图谱形状基本一致。

5、线性关系的考察

取对照品溶液0.20，0.40，0.60，0.80，1.00mL，按照实验例3显色条件项显色，640nm处测定吸光度值，结果见表8。以对照品浓度(μg/mL)为横坐标，吸光度(A)为纵坐标作标准曲线(见图4)，计算标准曲线的回归方程。

表8线性关系测定结果

经计算回归方程为Y_{6-0-对香豆酰鸡屎藤苷甲酯}＝0.0033X+0.1208，R＝0.9996；结果表明，6-0-对香豆酰鸡屎藤苷甲酯在53.4～267.0ug/mL范围内成线性关系。

6、精密度实验

取对照品溶液0.5mL，按照实验例3显色条件项显色，连续测定5次吸光度，并计算RSD值，结果见表9。

表9精密度实验结果

实验结果表明仪器精密度和操作精密度良好。

7、重复性实验

取供试品溶液5份，按照实验例3的方法制备供试品溶液后，按照实验例3显色条件项平行操作显色，测定其吸光度，结果见表10。

表10重复性实验结果

实验结果表明该方法重复性良好。

8、稳定性实验

取供试品溶液0.5mL，按照实验例3显色条件项显色，显色后0～60min间，每隔10min测定1次吸光度，结果见表11。

表11稳定性实验结果

实验结果表明，样品显色后在0～60min内基本稳定。

9、加样回收率实验

称取已知含量的样品5份，精密称定，置10mL量瓶中，分别加入6-0-对香豆酰鸡屎藤苷甲酯对照品溶液(浓度为1.5mg/mL)9.0mL，按照实验例3的方法制备供试品溶液后，按照实验例3显色条件项平行操作显色，进行测定，计算6-0-对香豆酰鸡屎藤苷甲酯的回收率，结果见表12。

表12加样回收率测定结果

计算平均回收率为97.99％，RSD为0.64％。

10、样品测定

取实施例1制备的三批白花蛇舌草纯化物，每批2份，每份约27.8mg，精密称定，按照实验例3的方法制备供试品溶液后，按照实验例3显色条件项平行操作显色，进行测定，根据回归方程计算白花蛇舌草有效部位纯化物中总环烯醚萜苷含量，结果见表13。

表13样品测定结果

经计算白花蛇舌草纯化物中总环烯醚萜苷的平均含量为95.51％。

实验例4HPLC法测定纯化后有效部位中6-0-对香豆酰鸡屎藤苷甲酯含量

1、对照品溶液的制备

精密称6-0-对香豆酰鸡屎藤苷甲酯对照品适量，加50％甲醇制成每1ml含6-0-对香豆酰鸡屎藤苷甲酯0.105mg的溶液；精密量取上述6-0-对香豆酰鸡屎藤苷甲酯溶液1mL，置10mL量瓶中，加50％甲醇稀释至刻度，摇匀，即得(每1ml含6-0-对香豆酰鸡屎藤苷甲酯20.9μg的溶液)。

2、供试品溶液的制备

取白花蛇舌草纯化后有效部位提取物3.62mg，精密称定，置100mL量瓶中，加50％甲醇80mL，超声处理(功率250W，频率40KHz)10分钟，取出，放冷，加50％甲醇至刻度，摇匀，用微孔滤膜(0.45μm)滤过，取滤液，即得。

3、检测波长的选择

取6-0-对香豆酰鸡屎藤苷甲酯对照品溶液，200～400nm间进行紫外扫描，结果见图1，从光谱图看出6-0-对香豆酰鸡屎藤苷甲酯对照品溶液在310nm处都有最大吸收，故选择测定波长为310nm。

4、色谱条件

色谱柱采用YMC-C18柱(250mm×4.6mm，5μm)；检测波长为310nm；进样量为10μL，流速为1.0mL/min；柱温为30℃；以乙腈为流动相A，以0.05％甲酸水溶液为流动相B，进行梯度洗脱(见表14)。

表14流动相梯度表

5、系统适应性实验

分别精密吸取上述对照品溶液、供试品溶液各10μL，注入液相色谱仪，记录色谱图。

根据实验例4中的色谱条件得6-0-对香豆酰鸡屎藤苷甲酯、白花蛇舌草有效部位提取物的色谱图(见图1B)，样品中各峰与相近峰分离完全。

6、线性关系考察实验

取6-0-对香豆酰鸡屎藤苷甲酯对照品适量，精密称定，加入50％甲醇制成每1mL中含6-0-对香豆酰鸡屎藤苷甲酯0.209mg的溶液，作为对照品溶液。精密量取对照品溶液各0.1mL、0.5mL、1.0mL、2.0mL、2.5mL、3.0mL，置10mL量瓶中，分别加甲醇至刻度，摇匀，精密量取10μL，注入液相色谱仪，进行HPLC测定，记录峰面积积分值，结果见表15。以进样量(X)对色谱峰面积值(Y)作标准曲线(见图5)，计算标准曲线的回归方程。

表15 6-0-对香豆酰鸡屎藤苷甲酯线性关系考察结果

经计算回归方程为Y_{6-0-对香豆酰鸡屎藤苷甲酯}＝2615233.659X-6740.193，R²＝0.9997；结果表明，6-0-对香豆酰鸡屎藤苷甲酯在0.0209～0.627μg范围内成线性关系。

7、稳定性实验

取实施例1制备的白花蛇舌草纯化物适量，精密称定，按实验例4中的方法制备供试品溶液后，分别在0，1，5，8，24h进行HPLC测定，记录峰面积，以考察其稳定性，结果见表16。

表16稳定性实验结果

实验结果表明，供试品溶液在24小时内基本稳定。

8、精密度实验

取同一份样品溶液，连续进样6次，进行HPLC测试，记录峰面积，并计算RSD值，结果见表17。

表17精密度实验结果

实验结果表明，本实验精密度良好。

9、重复性实验

取实施例1制备的白花蛇舌草纯化物适量，精密称取6份，每份约3.5mg，按实验例4中的方法制备供试品溶液后，进行HPLC测定，记录峰面积，结果见表18。

表18重复性实验结果

结果表明，该方法的重复性好。

10、回收率实验

采用加样回收法，取本品6份，每份约1.4mg，精密称定，置于100mL容量瓶中，加入6-0-对香豆酰鸡屎藤苷甲酯对照品溶液(浓度为1.02mg/mL)1.0mL，按实验例4中的方法制备供试品溶液后，精密吸取10μL，注入液相色谱仪，测定，以下式计算回收率，即得，测定结果见表19。

经测定已知白花蛇舌草有效部位提取物中6-0-对香豆酰鸡屎藤苷甲酯含量是698mg/g。

表19 6-0-对香豆酰鸡屎藤苷甲酯加样回收率实验

实验结果表明，本实验的加标回收率良好。

11、样品测定

取三批实施例1制备的白花蛇舌草纯化物样品，每批2份，每份约4.0mg，精密称定，按实验例4中的方法制备供试品溶液后，进行测定，根据回归方程计算白花蛇舌草纯化后有效部位提取物中6-0-对香豆酰鸡屎藤苷甲酯的含量，结果见表20。

表20样品测定结果

经计算白花蛇舌草有效部位提取物中含香豆酸以6-0-对香豆酰鸡屎藤苷甲酯计为69.76％。

实验例5纯化后的有效部位的小鼠抗肿瘤动物实验

1、急毒实验

实验用小鼠为ICR小鼠，36只，雌雄各半。(二级，5周，重18-22g，购于北京维通利华实验动物科技有限公司)。实验前，适应性喂养一周。一周后，依此把小鼠随机分成6组，每组6只，雌雄各半。小鼠按照空白，10g/kg，5g/kg，2.5g/kg，1.25g/kg，0.625g/kg给予有效部位的水溶液(含5％的乙醇，0.2ml/10g)，观察一周。经一周的观察，小鼠的各项指标较正常组，未见改变，故该有效部位的对小鼠的毒副作用小，未见明显的中毒症状。

2、小鼠体内抗肿瘤作用

实验用ICR小鼠50只，雄性(二级，5周，重18-22g，购于北京维通利华实验动物科技有限公司)。实验前，适应性喂养一周。一周后，随机把小鼠分成5组，每组10只。依此为模型组，阳性药物对照组，高剂量组，中剂量组，低剂量组。分好组后，于小鼠左前肢腋窝腔下接种S180悬浮液(10⁵个/ml)。24小时后，依此给予空白溶剂，环磷酰胺溶剂(20mg/kg)，高剂量(20mg/kg).中剂量(10mg/kg)，低剂量(5mg/kg)。观察14天，于第十五天，将小鼠脱颈处死，取出肿瘤，记录下肿瘤的重量与体积(如表21)。通过数据的对比可知，白花蛇舌草的有效部位经过纯化后，连续给药14天后，可使S180荷瘤小鼠的肿瘤体积较模型组显著减小，中剂量组的肿瘤体积以达到阳性药物的抑制水平；在抑制肿瘤体积的同时，该有效部位同样在肿瘤的重量上表现出抑制作用，其抑制率在中剂量组达到了41.15％(抑制率如表21)。由此可初步判断白花蛇舌草醇提纯化后的有效部位具有有效的抗肿瘤作用。

表21白花蛇舌草纯化后有效部位对S180小鼠的抗肿瘤作用(n＝10)

CY：环磷酰胺(阳性对照药物)

P＜0.05，P＜0.01，P＜0.001为与模型组对照

下述实施例均能实现上述实验例的效果。

具体实施方式

实施例1：本发明白花蛇舌草有效部位的制备

提取：取药材白花蛇舌草加12重量倍60％乙醇，提取2次，每次2小时，合并提取液，浓缩；

纯化：以石油醚萃取浓缩物的水溶液3次，去除石油醚层，上D-101型大孔树脂柱，上样浓度为3.733mg/mL，按照4mL/min的吸附流速进行动态吸附，其中径高比为1∶10，分别用水、20％、30％、40％乙醇溶液以3mL/min的流速进行洗脱，收集40％洗脱部分并蒸干，温度不高于60℃，真空干燥后即得白花蛇舌草有效部位，有效部位中6-0-对香豆酰鸡屎藤苷甲酯含量为70％。

实施例2：本发明白花蛇舌草有效部位的制备

提取：取药材白花蛇舌草加9重量倍60％乙醇，提取3次，每次2.5小时，合并提取液，浓缩；

纯化：以石油醚萃取浓缩物的水溶液5次，去除石油醚层，上D-101型大孔树脂柱，上样浓度为4.825mg/mL，按照5mL/min的吸附流速进行动态吸附，其中径高比为1∶12，分别用水、25％、40％、55％乙醇溶液以5mL/min的流速进行洗脱，收集50％洗脱部分并蒸干，温度不高于60℃，真空干燥后即得白花蛇舌草有效部位，有效部位中6-0-对香豆酰鸡屎藤苷甲酯含量为80％。

实施例3：本发明白花蛇舌草有效部位的制备

提取：取药材白花蛇舌草加15重量倍60％乙醇，提取1次，每次2小时，合并提取液，浓缩；

纯化：以石油醚萃取浓缩物的水溶液2次，去除石油醚层，上D-101型大孔树脂柱，上样浓度为2.8mg/mL，按照3mL/min的吸附流速进行动态吸附，其中径高比为1∶8，分别用水、15％、25％、30％乙醇溶液以2.8mL/min的流速进行洗脱，收集30％洗脱部分并蒸干，温度不高于60℃，真空干燥后即得白花蛇舌草有效部位，有效部位中6-0-对香豆酰鸡屎藤苷甲酯含量为65％。

实施例4：本发明白花蛇舌草有效部位的检测

本发明白花蛇舌草有效部位中总环烯醚萜苷的含量测定：

精密称取6-0-对香豆酰鸡屎藤苷甲酯对照品2.67mg，置10mL量瓶中，加水8mL，以功率250W，频率40kHz超声处理5分钟，放冷，用水稀释至刻度，摇匀，即得对照品溶液，其中每1mL含6-0-对香豆酰鸡屎藤苷甲酯0.267mg；

取实施例1制备的本发明白花蛇舌草有效部位28mg，精密称定，置10mL量瓶中，加水8mL，以功率250W，频率40kHz超声处理20分钟，放冷，用水稀释至刻度，摇匀，即得。

取0.5mL待测溶液，置10mL量瓶中，75％乙醇加至4mL，加入50％盐酸2.0mL，摇匀，80℃水解20min，取出，立即冷却，加入2mL对二甲氨基苯甲醛溶液，用75％乙醇定容，摇匀，室温放置30min，在640nm处用分光光度计测定溶液吸光度，根据回归方程计算本发明白花蛇舌草有效部位中总环烯醚萜苷的含量95.51％。

本发明白花蛇舌草有效部位中6-0-对香豆酰鸡屎藤苷甲酯含量测定：

色谱条件：色谱柱采用YMC-C18柱：250mm×4.6mm，5μm；检测波长为310nm；进样量为10μL，流速为1.0mL/min；柱温为30℃；以乙腈为流动相A，以0.05％甲酸水溶液为流动相B，进行梯度洗脱，梯度条件为：时间0～15～20～30～60分钟，流动相A乙腈由15％～20％～20％～25％～25％；

对照品溶液的制备：精密称取6-0-对香豆酰鸡屎藤苷甲酯对照品适量，加50％甲醇制成每1ml含6-0-对香豆酰鸡屎藤苷甲酯0.105mg的溶液；精密量取上述6-0-对香豆酰鸡屎藤苷甲酯溶液1mL，置10mL量瓶中，加50％甲醇稀释至刻度，摇匀，即得每1ml含6-0-对香豆酰鸡屎藤苷甲酯20.9μg的溶液；

供试品溶液的制备：取实施例1制备的本发明白花蛇舌草有效部位3.62mg，精密称定，置100mL量瓶中，加50％甲醇80mL，以功率250W，频率40KHz超声处理10分钟，取出，放冷，加50％甲醇至刻度，摇匀，用0.45μm的微孔滤膜滤过，取滤液，即得；

测定法：分别精密吸取上述对照品溶液、及供试品溶液各10μL，注入液相色谱仪，测定，即得。

本发明白花蛇舌草有效部位中含香豆酸以6-0-对香豆酰鸡屎藤苷甲酯计为69.76％。

实施例5：本发明白花蛇舌草有效部位中总环烯醚萜苷的含量测定：

精密称取6-0-对香豆酰鸡屎藤苷甲酯对照品3.26mg，置10mL量瓶中，加水10mL，以功率250W，频率40kHz超声处理7分钟，放冷，用水稀释至刻度，摇匀，即得对照品溶液，其中每1mL含6-0-对香豆酰鸡屎藤苷甲酯0.267mg；

取实施例2制备的本发明白花蛇舌草有效部位36mg，精密称定，置10mL量瓶中，加水12mL，以功率250W，频率40kHz超声处理25分钟，放冷，用水稀释至刻度，摇匀，即得。

取0.8mL待测溶液，置10mL量瓶中，80％乙醇加至6mL，加入60％盐酸2.5mL，摇匀，80℃水解30min，取出，立即冷却，加入3mL对二甲氨基苯甲醛溶液，用80％乙醇定容，摇匀，室温放置40min，在640nm处用分光光度计测定溶液吸光度，根据回归方程计算本发明白花蛇舌草有效部位中总环烯醚萜苷的含量86％。

实施例6：本发明白花蛇舌草有效部位中6-0-对香豆酰鸡屎藤苷甲酯含量测定

色谱条件：色谱柱采用YMC-C18柱：250mm×4.6mm，5μm；检测波长为310nm；进样量为10μL，流速为1.0mL/min；柱温为30℃；以乙腈为流动相A，以0.05％甲酸水溶液为流动相B，进行梯度洗脱，梯度条件为：时间0～15～20～30～60分钟，流动相A乙腈由15％～20％～20％～25％～25％；

对照品溶液的制备：精密称取6-0-对香豆酰鸡屎藤苷甲酯对照品适量，加60％甲醇制成每1ml含6-0-对香豆酰鸡屎藤苷甲酯0.105mg的溶液；精密量取上述6-0-对香豆酰鸡屎藤苷甲酯溶液1.2mL，置10mL量瓶中，加60％甲醇稀释至刻度，摇匀，即得每1ml含6-0-对香豆酰鸡屎藤苷甲酯20.9μg的溶液；

供试品溶液的制备：取实施例3制备的本发明白花蛇舌草有效部位4.24mg，精密称定，置100mL量瓶中，加60％甲醇65mL，以功率250W，频率40KHz超声处理12分钟，取出，放冷，加60％甲醇至刻度，摇匀，用0.45μm的微孔滤膜滤过，取滤液，即得；

测定法：分别精密吸取上述对照品溶液、及供试品溶液各12μL，注入液相色谱仪，测定，即得。

本发明白花蛇舌草有效部位中含香豆酸以6-0-对香豆酰鸡屎藤苷甲酯计为80％。

实施例7：片剂的制备

取实施例1制备的白花蛇舌草有效部位，加入常规辅料，按照常规工艺，制成片剂。

实施例8：丸剂的制备

取实施例2制备的白花蛇舌草有效部位，加入常规辅料，按照常规工艺，制成丸剂。

实施例9：口服液体制剂的制备

取实施例3制备的白花蛇舌草有效部位，加入常规辅料，按照常规工艺，制成口服液体制剂。