丙型肝炎病毒多表位肽负荷的树突状细胞治疗性疫苗

摘要

本发明涉及病毒学和免疫学技术，它构建了丙型肝炎病毒多表位肽负荷的树突状细胞治疗性疫苗，其特征是：将CTL表位NS4B(1793-1801)SMMAFSAAL和P7(774-782)AAWYIKGRL用于构建重组腺病毒，进而采用该病毒感染人树突状细胞来制备多表位树突状细胞疫苗。根据检测结果证明这种HCV多表位肽负荷的DC细胞治疗性疫苗,它具有免疫原性。

说明书

技术领域

本发明涉及病毒学和免疫学技术，构建了丙型肝炎病毒多表位肽负荷的树突状细胞治疗性疫苗。

背景技术

丙型肝炎病毒（HCV）是引起慢性肝病的主要病原体之一，全世界约有HCV感染者1.7 亿-2.0亿，我国人群HCV感染率约3.2%，估计全国感染者在4000 万以上。HCV感染后，约50% -85%转为慢性肝炎，其中20%-30%发展为肝硬化，部分转为肝细胞肝癌（HCC），严重危害人类健康，已成为全球性的、严峻的公共卫生问题。迄今为止，尚缺乏理想的抗病毒治疗措施，干扰素治疗也不令人满意。由于HCV病毒变异率高，以保护性抗体为主的预防性HCV疫苗的研究步履维艰。因此，寻求抗HCV疫苗和有效抗病毒药物一直是研究的热点。

HCV基因组有9.6kb，编码3010aa的多肽，由结构蛋白（Core、E1和E2）和7个非结构蛋白（p7、NS2、NS3、NS4A、NS4B、NS5A和NS5B）组成。HCV感染后，机体细胞模式识别受体（pattern  recognition receptors，PRR）感受外来分子的侵入，诱导细胞内信号转导，产生I类干扰素等固有免疫反应，以抵抗病毒的侵袭；同时通过DC介导特异性细胞免疫，清除病毒感染，恢复细胞的“健康状态”。对急性HCV 感染病人观察中发现，如病人能早期出现针对包膜蛋白的抗体,则有利于病毒清除。早期疫苗研究中也证明了HCV 确实具有中和抗原表位,用真核载体表达的重组膜蛋白免疫黑猩猩,可以保护动物免受同株病毒的攻击。由于HCV中和抗原表位存在于编码包膜糖蛋白的E区，而HCV E区基因高度变异，尤其是E2区N端存在高变区（HRV1和HRV2），从而使机体产生的中和抗体因抗原变异而缺乏保护力，不能有效地清除病毒准种或其它型别病毒株的感染。黑猩猩感染实验能更仔细地观察初次感染时不同时相的免疫反应。结果说明CD4+ T细胞和CD8+ T细胞均在HCV清除和维持病毒抑制状态中发挥重要作用。

由于HCV疫苗研究的必要性和迫切性,自1989 年HCV基因获得克隆以来,人们一直在致力于疫苗的研究,但是进展缓慢。早些时候，人们注重发展HCV包膜糖蛋白或多肽亚单位疫苗，同HIV 疫苗的研究一样，由于HCV包膜糖蛋白高度的变异特性，使以产生中和性抗体控制病毒感染和复制的研究遇到困难。HCV疫苗难以实现的主要原因归纳为以下三点: ① HCV基因组变异率较高，病毒准种多，缺乏保护性抗体，不能阻止黑猩猩和人类恢复的病人再次感染，传统的预防性疫苗的研究遇到困难；② HCV复制能力差，感染力弱，使体内病毒滴度较低，在体外又不易培养,加之对病毒复制感染过程及发病机制的认识不够清楚，而且HCV 编码的不少蛋白质,如核心蛋白和NS蛋白还可能与HCV的致癌性有关,免疫原的选择以及强度均受到一定的限制；③ 缺乏理想的体外感染细胞模型,动物模型除黑猩猩外,其他动物,即使灵长类动物,如狒狒、恒河猴等都不能为HCV 所感染，限制了对疫苗评价的研究。近10年来，HCV疫苗研究的焦点主要集中在核酸疫苗、病毒载体疫苗、重组多表位疫苗以抗原递呈细胞为载体DC疫苗等。

用带有抗原基因的载体直接接种，可能由于机体因素在抗原未能递呈之前被降解而丧失（或降低）免疫原性，因此，有学者在体外将抗原或抗原基因导入DC，使抗原表位与DC上的MHC结合，呈现在细胞表面作为DC细胞疫苗，然后接种，通过DC递呈抗原信息给T、B细胞，诱导机体的细胞和体液免疫反应。研究表明，由DC激活的细胞免疫特别是CTL介导的免疫反应，在机体抵御恶性肿瘤和传染性疾病中发挥着十分重要的作用。在DC细胞疫苗的研究中，将外源性抗原基因导入DC较常用的方法是应用重组的病毒在体外感染DC，包括逆转录病毒感染、腺病毒感染和痘苗病毒感染等。复制缺陷型腺病毒载体和痘苗病毒载体是最常用的两个用作疫苗研究的病毒载体，另外还有将HCV基因嵌入HBV表面抗原基因，或与卡介苗（BCG）连接等，均在小鼠中发现能有效诱导机体的体液免疫和细胞免疫应答。

近10年来，随着对HCV持续感染机制的认识，结合我们多年的HCV研究工作基础，通过与国、内外学者交流，提出了HCV疫苗研究的新理念：需要结合HCV的生物学特性、感染发病特征、抗病毒免疫机制，改变“单纯预防”为“预防与治疗相结合”，改变“多次接种为多次反复接种”，发展能够诱导出强大的、针对多个病毒表位的、持续较长时间的、特异性CD8+和CD4+T细胞反应的疫苗研究策略，以诱导持续免疫应答和维持病毒抑制状态为“基本目标”的HCV疫苗研究的新理念。

利用复制缺陷型腺病毒载体构建含HCV核心区基因的重组腺病毒载体，高效表达了HCV核心蛋白，并制备出高滴度的感染性重组腺病毒。利用生物信息学方法筛选、经过初步验证的HCV 多个CTL表位，构建和制备出含GFP标签的HCV 2个CTL表位的重组腺病毒，感染人DC，制备多表位DC疫苗，体外与人T细胞混合培养。结果表明，构建的HCV多CTL表位DC细胞疫苗能够促进同源T细胞增殖，诱导CTL活性，提示重组HCV多表位腺病毒感染的DC可作为DC细胞疫苗进一步研究。

发明内容

本发明的目的是:提供一种丙型肝炎病毒多表位肽负荷的树突状细胞治疗性疫苗,它具有免疫原性。

本发明的技术方案是:丙型肝炎病毒多表位肽负荷的树突状细胞治疗性疫苗，其特征是：将CTL表位 NS4B(1793-1801) SMMAFSAAL和P7(774-782) AAWYIKGRL用于构建重组腺病毒，进而采用该病毒感染人树突状细胞来制备多表位树突状细胞疫苗。

所述的重组腺病毒表达：重组腺病毒表达质粒AD-序列1和AD-序列2构建:由上海合成序列1 in pGH和序列2 in pGH；序列1为HCV的CTL表位 NS4B(1793-1801) SMMAFSAAL和P7(774-782) AAWYIKGRL加上HCV Th表位NS3（1248-1261）GYKVLVLNPSVAAT串联，表位中间由促进表位提呈的AAY连接，应用兼顾pichia酵母偏性密码子和大肠杆菌偏性密码子设计基因，人工合成HCV CTL双表位基因串联。序列2为阳性对照，包含HCV的CTL表位Core(35-44)YLLPRRGPRL, Core(132-140)DLMGYIPLV和HCV Th表位NS3（1248-1261）GYKVLVLNPSVAAT；序列1和2同时加上GFP和FLAG标签，有利于Western Blot检测目的多肽的表达。

所述的树突状细胞的培养：全血来自于健康供者，经Ficoll-Hypaque密度梯度离心法分离外周血单个核细胞（PBMC），按CD14 MicroBeads humanmonocyte kit(MACS) 操作说明，分离收集CD14+单核细胞，细胞纯度达96.32%；用无血清培养液X-VIVO15调整CD14+单核细胞密度为1×10⁶cells/mL接种于24孔板，5%C02、37℃ 孵育培养5天，隔日半量换液，并加入GM-CSF(1000U／ml) 和IL-4 ( 1000U／ml )，第5天起加入成熟诱导因子rTNF-α（10ng/mL）、IL-1β（10 ng/mL）、IL-6（10 ng/mL）、PGE2（1μg/mL）培养2天，即可诱导出成熟的树突状细胞。在倒置显微镜下观察,培养1 d 后大部分细胞仍贴壁生长并成簇排列,呈圆形,细胞膜光滑无突起。培养5 d 后,细胞的形态出现不规则,悬浮细胞逐渐增多,细胞伸出突起。培养7d后,胞体明显变大,绝大部分细胞呈半悬浮生长,可见胞体不规则增大,胞膜向外伸出树枝样突起。

所述树突状细胞疫苗的免疫原性检测：

1、混合淋巴细胞培养；

2、ELISA检测DC上清IL-12p70和混合淋巴细胞培养上清IFN-γ；

3、用LDH释放法检测CTL活性。

所述的重组腺病毒构建了HCV多CTL表位肽负荷的树突状细胞（DC）治疗性疫苗。

本发明的特点是：根据检测结果证明这种HCV多表位肽负荷的DC细胞治疗性疫苗,它具有免疫原性。

附图说明：

下面结合实施例附图对本发明做进一步说明，但不做为对本发明的限定：

图1是重组质粒pAdtrack-CMV/序列1和pAdtrack-CMV/序列2的酶切鉴定1: 序列1,2：序列2,M：DNA Marker；

图2是重组腺病毒感染293T细胞；

图3是普通光镜和荧光镜下观察成熟树突状细胞；

图4是序列特异性PCR扩增结果；

图5是Western Blot结果；

图6是DC表面分子检测；

图7是ELISA检测细胞培养上清液中IL-12p70和混合淋巴细胞培养上清IFN-γ的含量；

图8是CTL杀伤实验结果。

具体实施方式

实施例1. 重组腺病毒表达：

1、 重组腺病毒表达质粒AD-序列1和AD-序列2构建:由Generay Biotech（上海）合成序列1 in pGH和序列2 in pGH。序列1为HCV的CTL表位 NS4B(1793-1801) SMMAFSAAL和P7(774-782) AAWYIKGRL加上HCV Th表位NS3（1248-1261）GYKVLVLNPSVAAT串联，表位中间由促进表位提呈的AAY连接，应用兼顾pichia酵母偏性密码子和大肠杆菌偏性密码子设计基因，人工合成HCV CTL双表位基因串联。序列2为阳性对照，包含HCV的CTL表位Core(35-44)YLLPRRGPRL, Core(132-140)DLMGYIPLV和HCV Th表位NS3（1248-1261）GYKVLVLNPSVAAT。序列1和2同时加上GFP和FLAG标签，有利于Western Blot检测目的多肽的表达。用限制性内切酶BamHI+XhoI双酶切，回收片段；同时用BamHI+XhoI酶切pAdtrack-CMV穿梭载体。取片段与载体在T4 DNA连接酶作用下25℃连接1小时，取10μl产物热休克法转化感受态细菌DH-5α，挑取氨苄抗性单克隆接种到氨苄选择性培养液扩增培养。提取质粒，酶切鉴定重组质粒pAdtrack-CMV/序列1和pAdtrack-CMV/序列2。将构建好的pAdtrack-CMV/序列1和pAdtrack-CMV/序列2用PacI酶切线性化，分别与腺病毒骨架pAdEasy-1共转化BJ-5183细菌进行同源重组，氨苄筛选阳性克隆得到重组腺病毒表达质粒AD-序列1和AD-序列2。已知序列1为156bp,序列2为159bp，pGH-1为3073bp, pGH-2为3076bp,用限制性内切酶BamHI+XhoI双酶切质粒序列1 in pGH和序列2 in pGH，琼脂糖凝胶电泳鉴定，可见预期大小的片段（见图1）。测序结果与设计的目的基因一致。

2、 重组腺病毒包装、扩增:将构建好的AD-序列1和AD-序列2用PacI酶切线性化，用脂质体法转染293T细胞。重组腺病毒感染293T细胞后48h,荧光镜下观察，可见GFP表达（见图2），由于HCV多CTL表位与GFP为融合表达，说明AD-序列1和AD-序列2构建成功。培养7～10天后,出现细胞病变, 收集细胞，用DMEM重悬，-80℃和37℃反复冻融3次，离心收集上清即腺病毒原液。经HEK293细胞扩增病毒粗提液，CsCl密度梯度离心纯化。噬斑法测定重组腺病毒滴度AD-序列1和AD-序列2分别为1.74×10¹⁰pfu/ml和1.56×10¹⁰pfu/ml。

实施例2. 树突状细胞的培养

1、    培养树突状细胞:全血来自于健康供者，经Ficoll-Hypaque密度梯度离心法分离外周血单个核细胞（PBMC），按CD14 MicroBeads humanmonocyte kit(MACS) 操作说明，分离收集CD14+单核细胞，细胞纯度达96.32%。用无血清培养液X-VIVO15调整CD14+单核细胞密度为1×10⁶cells/mL接种于24孔板，5%C02、37℃ 孵育培养5天，隔日半量换液，并加入GM-CSF(1000U／ml) 和IL-4 ( 1000U／ml )，第5天起加入成熟诱导因子rTNF-α（10ng/mL）、IL-1β（10 ng/mL）、IL-6（10 ng/mL）、PGE2（1μg/mL）培养2天，即可诱导出成熟的树突状细胞。在倒置显微镜下观察,培养1 d 后大部分细胞仍贴壁生长并成簇排列,呈圆形,细胞膜光滑无突起。培养5 d 后,细胞的形态出现不规则,悬浮细胞逐渐增多,细胞伸出突起。培养7d后,胞体明显变大,绝大部分细胞呈半悬浮生长,可见胞体不规则增大,胞膜向外伸出树枝样突起（见图3）。

2、    重组腺病毒感染树突状细胞:收集培养到第5天的未成熟DC，PBS液洗2次，细胞计数，按5×10⁵cells／孔接种于24孔培养板，每孔体积为100μl。分别加入250MOI重组腺病毒，置5%C02、37℃孵箱中，培养2h后加入完全培养基继续培养，并命名为AD1-DC,AD2-DC。于感染后48h荧光镜下观察细胞GFP的表达，应用流式细胞术（FCM）测定腺病毒介导基因转染DC的效率为76.79%。

3、    RT-PCR检测DC细胞转染的重组HCV多表位抗原基因序列:用Trizol提取重组腺病毒感染24h后DC的总RNA,取5μl RNA，用cDNA Synthesis Kit(Fermentas公司)反转录为cDNA，序列1上游引物5'ATGTCAATGATGGCTTTCAGCG3'，序列2上游引物5'ATGTCATTGTTGCCGCGCAGG3'，序列1、2共用下游引物5' CTACTTATCGTCGTCATCCTTGT 3'（北京奥科生物合成），PCR反应条件：95℃ 5min;95℃ 30s,52℃ 30s,72℃ 45s,35个循环；72℃ 10min，并用2%琼脂糖凝胶鉴定。结果显示在150bp处有特异性扩增条带（见图4），其大小与目的基因大小相符。

4、    western blot检测HCV多表位抗原在DC内的表达:用细胞裂解液裂解重组腺病毒感染48h后的DC，提取总蛋白，取50 g样品与上样缓冲液混合，煮沸5 min，进行15% SDS-PAGE电泳，转PVDF膜。将膜在含5%脱脂奶粉的TBST中室温下封闭1h，随后加入小鼠抗FLAG一抗(Sigma，1:1000稀释)，4℃孵育过夜，TBST摇洗3次，10min/次；羊抗小鼠IgG-HRP二抗（中杉金桥,1:10000稀释），室温孵育1h,TBST摇洗3次，10min/次；ECL化学发光试剂检测。结果可见大小约为10KD的蛋白，这与预计的序列1-FLAG和序列2-FLAG融合蛋白大小一致，表明DC成功表达出序列1和序列2蛋白（见图5）。

5、    流式细胞仪分析DC表型变化:分别以APC-HLA-DR、 FITC-CD80、PE-CD83，perCP-CD86Ab标记不成熟DC、成熟DC、重组腺病毒感染后DC。具体步骤：分别收集DC，调整细胞密度为5×10⁶cells／ml,各取50μl,加入l：20灭活兔血清10μl ,4℃封闭10min，分别加入上述Ab，4℃避光30min 后,PBS洗2 次，流式细胞仪检测。结果显示成熟DC和腺病毒感染DC比不成熟DC的表面标志表达明显升高，腺病毒感染DC的表面标志CD83、CD86、CD80和HLA—DR分别为76.87%, 87.75%, 97.51%, and 97.85%（见图6）

实施例3. 树突状细胞疫苗的免疫原性检测

1、混合淋巴细胞培养:收集感染重组腺病毒和未感染重组腺病毒的DC作为刺激细胞。刺激细胞分别以1×10³/孔、5×10³/孔、1×10⁴/孔接种于96孔培养板，每组设3个复孔；取CD14-PBMC为效应细胞，每孔加入1×10⁵个细胞，同时设只加效应细胞为阴性对照，只加培养液为空白对照，每孔终体积200μl。5%C02、37℃条件下进行混合淋巴细胞培养，4天后加入MTS溶液20μl /孔，继续孵育4h，酶联免疫分析仪于波长450nm处检测A450值，结果以3孔均值表示。刺激指数(SI)=实验组-空白组/阴性组-空白组。结果AD1-DC和AD2-DC组在DC:T为1：10时刺激指数分别为6.806±0.247和6.722±0.328，未感染DC组刺激指数为3.167±0.314，AD1-DC组和AD2-DC组比未感染DC对T淋巴细胞的刺激作用明显增强（P<0.05），且随着刺激细胞的浓度增加，刺激作用增强（表1）。

表1. 混合淋巴细胞培养CCK-8检测结果 （                                                ±s）

注：^* AD1-DC和成熟DC组相比，T细胞增殖更明显，P＜0.05

2、ELISA检测DC上清IL-12p70和混合淋巴细胞培养上清IFN-γ:收集感染前后DC上清，应用IL-12 p70ELISA检测试剂盒检测重组腺病毒感染前DC，AD1-DC和AD2-DC的培养液上清IL-12p70含量，每组设6个复孔，最低检测值为31.2pg/ml，分别为71.84±1.21pg/ml、193.83±2.69pg/ml、168.71±2.78pg/ml（P<0.05）（图7A）。用上述DC刺激T细胞，不加DC的T细胞做对照，收集上述混合淋巴细胞培养液上清，应用IFN-γELISA检测试剂盒检测IFN-γ分泌，每组设6个复孔，最低检测值为31.2pg/ml。T、DC-T、AD1-DC-T和AD2-DC-T组的上清IFN-γ含量分别为46.01±2.91pg/ml、47.35±1.98pg/ml、 141.14±2.74pg/ml、134.05±1.84pg/ml（P<0.05）(见图7B)。

3、用LDH释放法检测CTL活性：将转染FL-J6/JFH转录本的Huh-7.5细胞作为靶细胞，调整细胞浓度为10⁴/ml, 96孔细胞培养板每孔加100ul(10³细胞)。复苏CD14-PBMC，用10%FCS的RPMI1640培养淋巴细胞，并添加20ng/mlIL-2，用感染后DC刺激的T淋巴细胞作为效应细胞(AD1-DC-L、AD2-DC-L)，未感染DC刺激的T淋巴细胞（DC-L）和单纯淋巴细胞（L）作为对照。按效靶比100∶1、50∶1、25∶1接种到96孔细胞培养板中 ,同时设置靶细胞自然释放LDH孔作为阴性对照和最大释放LDH孔作为阳性对照,分别设3个复孔,在5%CO2,37℃孵箱共培养6小时,根据LDH释放试剂盒说明书检测CTL活性。特异性细胞杀伤率(%) = (试验组OD值-靶细胞自然释放组OD值-效应细胞自然释放组OD值)/(靶细胞最大释放组OD值-靶细胞自然释放组OD值)。检测结果显示，不同效靶比条件下AD1-DC-L组和AD2-DC-L组对Huh7.5的杀伤率明显高于DC-L组和L组，其杀伤能力与效应细胞数量成正比。而且在效靶比为100:1时，AD1-DC-L组和AD2-DC-L组杀伤率达到最大，分别为35.99%和30.01%，显著高于DC-L组15.07%（P<0.05）和L组14.77 %（P<0.01），AD1-DC-L组和AD2-DC-L组相比无明显差异（P＞0.05）。提示重组多CTL表位腺病毒感染的DC可诱导特异性的细胞免疫应答（见图8）。

序列表

SEQUENCE LISTING

 

<110>  中国人民解放军第四军医大学

 

<120>  丙型肝炎病毒多表位肽负荷的树突状细胞治疗性疫苗

 

<130>  无

 

<160>  4    

 

<170>  PatentIn version 3.3

 

<210>  1

<211>  38

       No1：序列1的氨基酸序列

<212>  PRT

<213>  人工序列

      

<400>  1

smmafsaala  ayaawyikgr laaygykvlv lnpsvaat      38

 

 

 

<210>  2

<211>  114

       No2：序列1的核酸序列

<212>  DNA

<213>  人工序列

 

<400>  2

tcaatgatgg ctttcagcgc cgcattggcg gcatatgctg cctggtacat caagggcagg  60

ttggcggcat atggctataa agtgctggtg ctcaacccct ccgtcgctgc aaca       114

 

 

<210>  3

<211>  39

       No3：序列2的氨基酸序列

<212>  PRT

<213>  人工序列

 

<400>  3

yllprrgprl aaydlmgyip lvaaygykvl vlnpsvaat 39

 

 

<210>  4

<211>  117

       No4: 序列2的核酸序列

<212>  DNA

<213>  人工序列

 

<400>  4

 

 

tacttgttgc cgcgcagggg ccctagattg gcggcgtatg atctcatggg gtatattccg   60

cttgtcgcgg cgtatggcta taaagtgctg gtgctcaacc cctccgtcgc tgcaaca     117