用于与代谢综合征、心血管疾病和/或胰岛素抗性相关的病症的诊断、预后、监测和治疗追踪的体外方法

摘要

本发明涉及用于对象中代谢系统和/或心血管系统和/或胰岛素抗性病症的诊断、预后和/或监测/治疗追踪的体外方法，所述方法包含测定对象样品中一种或多种心血管标志物的相对水平，并将测定到的所述一种或多种心血管肽的相对水平用于所述对象中代谢系统和/或心血管系统和/或胰岛素抗性病症的诊断、预后和/或监测/治疗追踪。

说明书

本发明的主题是用于与代谢综合征、心血管疾病和/或胰岛素抗性相关的病症的诊断、预后、监测和治疗追踪的体外方法，所述方法包含测定一种或多种心血管标志物的相对水平及其应用。

高血压经常伴有肥胖症、胰岛素分泌过多症和胰岛素抗性。这种类型的高血压的特征为钠潴留、血管内容积增加以及心搏量和输出量增加(Messerli FH等，1981“肥胖症和原发高血压：血液动力学、血管内体积、钠排泄和血浆肾素活性”(Obesity and essential hypertension.Hemodynamics，intravascular volume，sodium excretion，and plasma renin activity)，Arch Intern Med 141：81-5；Stelfox HT等，2006“肥胖患者中的血液动力学监测：体重指数对心输出量和心搏量的影响”(Hemodynamic monitoring in obese patients：the impact of body massindex on cardiac output and stroke volume)，Crit Care Med 34：1243-6)。作为对与心力衰竭或急性心肌缺血相关的血管壁应力增加的响应，心房利尿钠肽(ANP)和脑型利尿钠肽(BNP)在心肌细胞中作为激素原合成，它们分别被切割成ANP和BNP以及N-端proANP(NT-proANP)和N-端proBNP(NT-proBNP)(Ruskoaho H，2003“在心力衰竭中作为诊断工具的心脏激素”(Cardiac hormones as diagnostic tools in heart failure)，Endocr Rev 24：341-56；Potter LR等，2006“利尿钠肽、它们的受体以及环鸟苷单磷酸依赖性的信号传导功能”(Natriuretic peptides，their receptors，and cyclic guanosine monophosphate-dependent signaling functions)，Endocr Rev 27：47-72)。高利尿钠肽水平是新的有希望的心血管(CV)风险标志物，并已经与高血液(BP)、左心室肥大和蛋白尿症相关联(Olsen MH等，2005“N-端脑利尿钠肽原与代谢型心血管风险因子和代谢综合征反相关”(N-terminal pro brain natriuretic peptide is inversely related to metabolic cardiovascular risk factor

最近的研究描述了在肥胖症中利尿钠肽水平被抑制(Wang TJ等，2004“肥胖症对血浆利尿钠肽水平的影响”(Impact of obesity on plasma natriuretic peptide levels)，Circulation 109：594-600；Das SR等，2005“体重和身体组成对利尿钠肽循环水平的影响：来自达拉斯心脏研究的结果“(Impact of body mass and body composition on circulating levels of natriuretic peptides：results from the Dallas Heart Study)，Circulation 112：2163-8)。因为肥胖症与盐潴留和心输出量增加相关，因此预计它将产生高利尿钠肽水平。肥胖症似乎具有相反效应这一现象显得违反直觉，并被归因于非血液动力学的因素。因此，Wang和同事假定这种反比关系可能是由于脂肪组织增加了利尿钠肽清除受体(NPR-C)的表达，导致在肥胖对象中利尿钠肽的清除率增加(Wang TJ等，2004“肥胖症对血浆利尿钠肽水平的影响”(Impact of obesity on plasma natriuretic peptide levels)，Circulation 109：594-600)。然而，Das和同事通过DEXA在达拉斯心脏研究(Dallas heart study)中测定了瘦肉和脂肪质量，并发现了较低的BNP水平与瘦肉而不是脂肪质量的关联性(Das SR等，2005“体重和身体组成对利尿钠肽循环水平的影响：来自达拉斯心脏研究的结果”(Impact of body mass and body composition on circulating levels of natriuretic peptides：results from the Dallas Heart Study)，Circulation 112：2163-8)。

几项研究观察到了利尿钠肽与代谢综合征的其他要素的关联性(Olsen MH等，2008“通过N-端脑利尿钠肽原和高灵敏度的C-反应蛋白预测心血管风险受到年龄和性别的影响“(Cardiovascular risk prediction by N-terminal pro brain natriuretic peptide and high sensitivity C-reactive protein is affected by age and sex)，J Hypertens 26：26-34；Wang TJ等，2007“在能走动个体中血浆利尿钠肽水平与代谢风险因子的关联性”(Association of plasma natriuretic peptide levels with metabolic risk factors in ambulatory individuals)，Circulation 115：1345-53)。在Framingham心脏研究中，大腰围、高甘油三酯、低HD和高禁食葡萄糖(Wang TJ等，2007“在能走动个体中血浆利尿钠肽水平与代谢风险因子的关联性”(Association of plasma natriuretic peptide levels with metabolic risk factors in ambulatory individuals)，Circulation 115：1345-53)与较低的血浆ANP水平相关，并在略低程度上与较低BNP水平相关。在丹麦研究中，观察到了BNP与BMI、胰岛素、葡萄糖、甘油三酯和高血压的关联性(Olsen MH等，2005“N-端脑利尿钠肽原与代谢型心血管风险因子和代谢综合征反相关”(N-terminal pro brain natriuretic peptide is inversely related to metabolic cardiovascular risk factors and the metabolic syndrome)，Hypertension 46：660-6)。尽管这些研究证实了利尿钠肽与代谢综合征的几种特性的紧密关联，但这些关联性背后的机制仍难以捉摸。

降低餐后胰岛素水平的营养方法对于降低血压非常有效(Appel LJ等，2005“蛋白质、单不饱和脂肪和糖类摄取对血压和血清脂类的影响：OmniHeart随机试验的结果”(Effects of protein，monounsaturated fat，and carbohydrate intake on blood pressure and serum lipids：results of the OmniHeart randomized trial)，Jama 294：2455-64)，并且据信餐后状态在代谢综合征的早期阶段以及特别是动脉粥样硬化的发展中发挥重要作用(Hanefeld M等，1999“在非糖尿病人个体中餐后血浆葡萄糖是颈动脉内-中膜厚度增加的独立风险因子”(Postprandial plasma glucose is an independent risk factor for increased carotid intima-media thickness in non-diabetic individuals)，Atherosclerosis 144：229-35；Hanefeld M等，2007“代谢综合征的挑战”(The challenge of the Metabolic Syndrome)，Horm Metab Res 39：625-6)。

本发明的目的是对象中与代谢综合征相关的病症和/或与心血管系统和/或胰岛素抗性相关的疾病的诊断、预后和/或监测和/或治疗追踪，其中测定了所述对象中一种或多种心血管标志物的相对变化。

已经发现，胰岛素诱导心血管标志物、特别是MR-proANP_53-90的抑制，并且在胰岛素灵敏度与利尿钠肽、特别是MR-proANP_53-90的相对变化之间存在明显的正相关性。这种相关性提供了代谢综合征中从胰岛素抗性到高血压的直接联系。这种相关性的发现进一步产生了用于对象中与代谢综合征相关的病症和/或与心血管系统和/或胰岛素抗性相关的疾病的诊断、预后和/或监测和/或治疗追踪的方法。

因此，本发明的主题是用于对象中代谢系统和/或心血管系统和/或胰岛素抗性病症的诊断、预后和/或监测/治疗追踪的体外方法，所述方法包含：

-提供来自所述对象的样品，

-测定所述样品中一种或多种心血管标志物的相对水平，

-使用所述一种或多种心血管肽的相对水平，用于所述对象中代谢系统和/或心血管系统和/或胰岛素抗性病症的诊断、预后和/或监测/治疗追踪。

在本发明的优选实施方案中，测定了一种或多种心血管标志物的餐后相对水平。

根据本发明，“相对水平”被定义为基于基础值的相对浓度，其可以通过数学表示如下：

其中X是以百分数表示的一种或多种心血管标志物水平的变化，[餐后]和[基础]分别是餐后和基础水平。

它也可以指定为浓度相对于基础值的变化百分数，其可以通过数学表示如下：

或

在本发明方法的优选实施方案中，测定一种或多种心血管标志物的餐后相对水平。

在本发明的上下文中，术语“餐后”是指食物(营养物)和/或饮料和/或药物被摄取或施加到对象后的时间段，其也可以用于饮食和/或营养疗法的上下文中。

在葡萄糖耐受性或葡萄糖激惹试验的情形中，也可以测定餐后水平。例如，可以通过(在禁食过夜后)口服施用75g葡萄糖(通常作为葡萄糖溶液提供)，其应该在5分钟内饮下，来进行口服葡萄糖耐受性试验(oGTT)。在基线时(使用葡萄糖之前)并以不同时间间隔例如15、30、60、90、120或180分钟抽取血样。

葡萄糖耐受性也可以使用静脉内葡萄糖耐受性试验(ivGTT)来测定。在过夜禁食后，将根据体重调整的葡萄糖剂量(例如0.3g/kg至最高约25g)通过导管给药到例如前臂中。在基线时(施用葡萄糖之前)并以不同时间间隔例如1、2、3、5、7、10、15、20、30、45、60、90、120或240分钟抽取血样。

此外，在高胰岛素血症、正常血糖夹试验的情况下也可以测定餐后水平以对胰岛素抗性进行研究和定量。该试验测量对增加的胰岛素水平进行补偿以不引起低血糖所需的葡萄糖量。通过外周静脉，以每m²每分钟10-120mU的速率灌注胰岛素。为了对胰岛素灌注进行补偿，灌注20％葡萄糖以将血糖水平维持在5至5.5mmol/l之间。葡萄糖灌输速率通过每5至10分钟检查血糖来确定。在试验的最后30分钟期间葡萄糖灌输的速率决定胰岛素敏感性。如果获得高的水平(7.5mg/min或更高)，患者对胰岛素敏感。非常低的水平(4.0mg/min或更低)表明身体对胰岛素的作用有抗性。介于4.0和7.5mg/min之间的水平不是决定性的，并表明“受损的葡萄糖耐受性”，是胰岛素抗性的早期征兆。

在本发明的上下文中，心血管标志物是指为与代谢综合征相关的病症(例如心肌梗塞、冠状动脉疾病、心力衰竭、II型糖尿病、肥胖症、高血压)提供诊断和/或预后和/或监测的肽和/或蛋白，所述肽和/或蛋白选自利尿钠肽(例如心房利尿钠肽、脑利尿钠肽)、肾上腺髓质素、内皮素、血管加压素。心血管标志物的基础水平取决于多种因素，例如对象的年龄、体重指数、对某些病症的遗传易感性/家族史、患者的性别和种族背景，以及与所述对象的总体健康状态相关的因素。然而，本发明式基于与此相反的发现，即从心血管标志物的基础水平到心血管标志物的餐后水平的相对变化基本上独立于这些因素，并且强烈依赖于施用于对象的食物和/或饮料和/或营养疗法和/或用药。

心血管标志物优选自ANP、BNP、ET-1、ADM、AVP及其片段和激素原以及所述激素原的片段。

在本发明方法的特别优选实施方案中，一种或多种心血管标志物的相对水平，使用检测下限为1nmol/L或以下、优选100pmol/L或以下、更优选10pmol/L或以下、更优选1pmol/L或以下、最优选0.5pmol/L或以下的测定方法来测定。此外，测定方法在正常范围内优选具有＜30％、更优选＜20％的测定间精确度。此外，测定方法在测量范围内优选具有＜10％、更优选＜5％的测定内精确度。这里的“测定内精确度”是指在具体测定方法的单批中测量值之间的偏差，“测定间精确度”是指在具体测定方法的多批中测量值之间的偏差，所述多批测定可以在不同地点、在不同天或由不同操作者执行。因此，上面提到的术语是指对使用所讨论的测定方法获得的结果的可重复性的度量。“测量范围”是指测定方法的检测上限和下限。

测定方法的灵敏性至少足以将变化和变差检测为增加和降低。对于健康对象来说，给定生物标志物的正常范围对应于高斯分布。

此外，本发明的实施方案是本发明的体外方法，所述方法还包含：

a)测定所述对象中一种或多种心血管标志物的基础水平，

b)测定所述一种或多种心血管标志物的餐后水平，

c)从步骤a和b中获得的值计算一种或多种心血管标志物的相对水平。

由此，将所述食品和/或饮料和/或饮食和/或营养疗法和/或用药的摄食、摄入或其他施用形式，与它对所述患者中所述一种或多种心血管标志物的水平的影响，通过所述水平的相对降低关联起来。

在本发明的上下文中，术语“基础水平”是指在没有因素例如食品、饮料、饮食、营养疗法或用药的影响时对象所具有的某些化合物、分子或代谢物例如心血管肽的个体水平。所述基础水平在禁食约12小时后对每个对象单独测定。此处的禁食是指对象在一段时间内除了水和/或必不可少的用药之外，不摄食或消耗食物、饮料或药物。

当在本文中提到时，“测定方法”或“诊断测定方法”可以是在诊断学领域中应用的任何类型的测定方法。这样的测定方法可以基于待检测被分析物与具有一定亲和性的一种或多种捕获探针的结合。对于捕获分子与目标靶分子之间的相互作用来说，亲和常数优选大于10⁸M^-1。

在本文中，当在激素原或其他肽的上下文中提到时，术语“片段”是指可以从较大蛋白或肽得到的较小蛋白或肽，因此其包含较大蛋白或肽的部分序列。所述片段可以从较大蛋白或肽通过其一个或多个肽键的皂化作用而产生。

心血管标志物pro ANP、proBNP、proET-1、proADM和pro-AVP的“片段”优选是指长度为至少6个氨基酸、更优选长度为至少12个氨基酸残基的片段。这样的片段优选可以用本文描述的免疫测定方法检测。

在本发明的文本中，“捕获分子”是可用于结合来自样品的目标靶分子、即被分析物(即在本发明的情形中是心血管肽)的分子。因此，捕获分子必须在空间上和表面特征例如表面电荷、疏水性、亲水性、路易斯供体和/或受体是否存在等方面适当塑造，以特异性结合目标靶分子。因此，结合可以由例如捕获分子与目标靶分子之间的离子、范德华、π-π、δ-π、疏水或氢键相互作用或两种以上上面提到的相互作用的组合来介导。在本发明的情形中，捕获分子可以例如选自核酸分子、糖类分子、RNA分子、蛋白质、抗体、肽或糖蛋白。优选情况下，捕获分子是抗体，包括其与目标靶或分子具有足够亲和性的片段，并包括重组抗体或重组抗体片段，以及所述抗体或其源自于变体链的长度为至少12个氨基酸的片段的化学和/或生物化学修饰的衍生物。

优选的检测方法包括各种格式的免疫测定法，例如放射免疫测定法(RIA)、化学发光和荧光免疫测定法、酶联免疫测定法(ELISA)、基于Luminex的珠子阵列、蛋白质微阵列测定法，以及快速检测格式例如免疫层析条样试验。

测定法可以是均相或非均相测定法、竞争和非竞争性夹心测定法。在特别优选的实施方案中，测定法采用夹心测定法形式，其是非竞争性免疫测定法，其中待检测和/或定量分子与第一抗体并与第二抗体结合。第一抗体可以结合到固相例如珠子、孔或其他容器的表面、芯片或条上，并且第二抗体是例如用染料、放射性同位素或反应性或催化活性组成部分标记的抗体。然后通过适合的方法测量与被分析物结合的标记抗体的量。“夹心测定法”所涉及的通用组合物和步骤是已确立的，并为专业技术人员所公知。(《免疫测定法手册》(The Immunoassay Handbook)，David Wild主编，Elsevier LTD，Oxford；第三版(2005年5月)，ISBN-13：978-0080445267；Hultschig C等，Curr Opin Chem Biol.2006Feb；10(1)：4-10.PMID：16376134，在此引为参考)。

在特别优选实施方案中，测定方法包含两种捕获分子，优选为都作为分散相存在于液体反应混合物中的抗体，其中第一种标记组分附着在第一种捕获分子上，其中所述第一种标记组分是基于荧光或化学发光淬灭或扩增的标记系统的一部分，并且所述标记系统的第二种标记组分附着于第二种捕获分子上，使得当两种捕获分子与被分析物结合后产生可测量信号，允许检测在包含样品的溶液中形成的夹心复合物。

更优选情况下，所述标记系统包含稀土穴状化合物或稀土螯合物与荧光染料或化学发光染料、特别是花青素类型染料的组合。

在本发明的情形中，基于荧光的测定方法包含使用染料，所述染料可以例如选自FAM(5-或6-羧基荧光素)、VIC、NED、荧光素、荧光素异硫氰酸酯(FITC)、IRD-700/800、花青染料例如CY3、CY5、CY3.5、CY5.5、Cy7、占吨、6-羧基-2’，4’，7’，4，7-六氯荧光素(HEX)、TET、6-羧基-4’，5’-二氯-2’，7’-二甲氧基荧光素(JOE)、N，N，N′，N′-四甲基-6-羧基罗丹明(TAMRA)、6-羧基-X-罗丹明(ROX)、5-羧基罗丹明-6G(R6G5)、6-羧基罗丹明-6G(RG6)、罗丹明、罗丹明绿、罗丹明红、罗丹明110、BODIPY染料例如BODIPY TMR、俄勒冈绿、香豆素类例如伞形酮、苯并亚胺类例如Hoechst 33258；菲啶类例如德克萨斯红、雅吉瓦黄、Alexa Fluor、PET、溴化乙锭、吖啶类染料、咔唑染料、吩噁嗪染料、卟啉染料、聚甲炔染料等。

在本发明的情形中，基于化学发光的测定方法包含根据化学发光材料的物理原理使用染料，所述原理描述在Kirk-Othmer的《化学技术百科全书》(Encyclopedia of chemical technology)第四版，J.I.Kroschwitz执行主编，M.Howe-Grant编辑，John Wiley&Sons，1993，vol.15，p.518-562中，在此引为参考，包括在551-562页中的引用文献。优选的化学发光染料是吖啶酯。

在另一个优选实施方案中，使用免疫测定法测定所述患者中所述心血管标志物的基础水平和所述心血管标志物的餐后水平。

正如上面所概述的，诊断测定方法可以是在诊断学领域中应用的任何类型的测定方法，包括但不限于基于酶反应、化学发光、荧光或放射性化学物质的测定方法。优选的检测方法包括条试验、放射免疫测定法、化学发光和荧光免疫测定法、免疫印记测定法、酶联免疫测定法(ELISA)、基于Luminex的珠子阵列和蛋白质微阵列测定法。测定方法的类型也可以是基于微孔板、基于芯片、基于珠子的，其中生物标志物蛋白可以附着于表面或在溶液中。测定方法可以是均相或非均相测定法、夹心测定法、竞争和非竞争性测定法。(《免疫测定手册》(The Immunoassay Handbook)，David Wild主编，Elsevier LTD，Oxford；第三版(2005年5月)，ISBN-13：978-0080445267；HultschigC等，Curr Opin Chem Biol.2006Feb；10(1)：4-10.PMID：16376134)。

在本发明的最优选实施方案中，按照(Morgenthaler NG等，2004ClinChem 50：234-6)中的描述使用免疫测定法。

在本发明的体外方法的特别优选实施方案中，一种心血管标志物是proANP。更优选情况下，一种标志物是中段proANP。最优选的是中段proANP_53-90。MR-proANP_53-90是指中段心房利尿钠肽原，其包含心房利尿钠肽原(proANP)的53到90位氨基酸。

在本发明的上下文中，AVP是指精氨酸血管加压素(＝血管加压素)或其片段或其前体或所述前体的片段。AVP前体的优选片段是C-端proAVP(CT-proAVP或和肽素)。在本发明的情形中，CT-proAVP_107-145(或CT-pre-proAVP_126-164)是特别优选的心血管标志物。

在本发明的上下文中，ADM是指肾上腺髓质素或其片段或其前体或所述前体的片段。ADM前体的优选片段是中段proADM(MR-proADM)。在本发明的情形中，MR-proADM_24-71(或MR-preproADM_45-92)是特别优选的心血管标志物。

在本发明的上下文中，ET-1是指内皮素1或其片段或其前体或所述前体的片段。ET-1前体的优选片段是C-端-proET1(CT-proET1)。在本发明的情形中，CT-proET-1_151-195(或CT-preproET-1_168-212)是特别优选的心血管标志物。

在本发明的上下文中，BNP是指脑利尿钠肽或其片段或其前体或所述前体的片段。BNP前体的优选片段是N-端proBNP(NT-proBNP)。在本发明的情形中，NT-proBNP是特别优选的心血管标志物。

在本发明的优选实施方案中，一种或多种心血管标志物选自proANP或其片段(优选为MR-proANP，更优选为MR-proANP_53-90)、pro-BNP或其片段(优选为NT-proBNP)、pro-ET-1或其片段(优选为CT-proET1、更优选为CT-proET-1_151-195)、pro-AVP或其片段(优选为和肽素，更优选为CT-proAVP_107-145)、pro-ADM或其片段(优选为MR-proADM、更优选为MR-proADM_24-71)。

根据本发明，优选情况下至少一种标志物是选自下列的肽：利尿钠肽、内皮素-1、血管加压素、肾上腺髓质素，以及它们的肽原或其至少3个氨基酸、优选5个以上、更优选6个以上、更优选7个以上、更优选10个以上、更优选12个以上、更优选15个以上、最优选20个或以上氨基酸的片段。

在本发明的非常优选实施方案中，至少一种心血管标志物是心房利尿钠肽(ANP)或肽原及其至少3个氨基酸、优选5个以上、更优选6个以上、最优选7个以上氨基酸的片段。

在特别优选实施方案中，至少一种心血管标志物是MR-proANP_53-90或其至少3个氨基酸、优选5个以上、更优选6个以上、最优选7个以上氨基酸的片段。

本发明还涉及本发明的体外方法的特定实施方案，其中附加地测定对于所述对象对代谢系统和/或心血管系统病症的倾向性的分类具有预测价值的一种或多种其他标志物或临床参数的水平，其中临床参数可以是能够影响所述倾向性的任何参数，例如年龄、性别、疾病特别是高血压、肥胖症特别是躯干性肥胖症的既往史、体重指数、遗传易感性/家族史、种族背景、患者的影响所述倾向性的嗜好例如吸烟、饮酒、饮食、锻炼或用药。

在本发明的体外方法的另一个优选实施方案中，在施用所述食物和/或饮料和/或饮食和/或营养疗法后4小时内、优选2小时内、更优选15至60分钟之间，测定所述一种或多种心血管标志物的餐后水平。

在本发明的体外方法的另一个优选实施方案中，在一段延长时期内、优选在一周时期内、更优选一个月、更优选两个月、更优选半年、更优选在疾病的整个持续时间内，监测所述食物和/或饮料和/或饮食和/或营养疗法对一种或多种心血管肽的相对水平的餐后影响。对于慢性疾病来说，监测可以执行患者的终生。

本发明还可以包含将个体的心血管标志物的相对水平与预定值进行比较。预定值可以采取各种形式。它可以是单一截止值，例如群体的中位数或平均值或75^th、90^th、95^th或99^th百分位数。它可以根据对比组来建立，例如一个规定组中的风险为另一个规定组中的风险的两倍。它可以是范围，例如将测试群体等量(或不等量)地分组，例如低风险组、中风险组和高风险组，或分成四等分，最低的四分之一是具有最低风险的个体，最高的四分之一是是具有最高风险的个体。

在所选的特定群体中，预定值可以随着他们的嗜好、种族、遗传等而变化。例如，表观健康的非吸烟者群体(没有可检测到的疾病、特别是没有糖尿病)与吸烟群体或其成员患有心血管系统和/或代谢系统疾病的群体相比，可以具有不同的标志物“正常”范围。因此，所选的预定值可以考虑个体所属类别。本技术领域的普通专业人员可以使用不超出常规的实验来选择适合的范围和类别。

阈值水平可以从例如Kaplan-Meier分析获得，其中将疾病的发生与群体中心血管标志物的四分位数相关联。根据该分析，心血管标志物水平高于75th百分位数的对象具有患本发明的疾病的明显增加的风险。该结果得到对经典风险因子进行充分调整的Cox回归分析的进一步支持：最高的四分之一与所有其他对象相比非常明显地与患本发明疾病的增加的风险相关。

其他优选的截止值是例如正常群体的90^th、95^th或99^th百分位数。通过使用比75^th百分位数更高的百分位数，人们可以减少鉴定到的假阳性对象的数量，但是人们可能错过鉴定到具有中等、尽管仍然增加的风险的对象。因此，人们可以根据被认为更加合适的是以也鉴定到“假阳性”为代价而鉴定大多数有风险对象，还是以错过几个具有中等风险的对象为代价而主要鉴定高风险对象，来调整截止值。

通过使用个体的心血管标志物水平值和其他预后性实验室和临床参数来计算个体风险的其他数学可能性是例如NRI(净重新分类指数)或IDI(综合鉴别指数)。指数可以按照Pencina的文献来计算(Pencina MJ等：“评估新标志物的增加预测能力：从ROC曲线下面积到重新分类等”(Evaluating the added predictive ability of a new marker：from area under the ROC curve to reclassification and beyond)，Stat Med.2008；27：157-172)。

在本发明的特定实施方案中，将所述对象中所述一种或多种心血管标志物水平的5％以上、优选10％以上、更优选15％以上、更优选20％以上的餐后相对降低，与代谢系统和/或心血管系统和/或胰岛素抗性病症的诊断和不利预后以及对象发生代谢系统和/或心血管系统和/或胰岛素抗性病症的增加的风险相关联。

在本发明的另一个特定实施方案中，将所述对象中所述一种或多种心血管标志物水平的5％以上、优选10％以上、更优选15％以上、更优选20％以上的餐后相对增加，与代谢系统和/或心血管系统和/或胰岛素抗性病症的有利预后以及对象发生代谢系统和/或心血管系统和/或胰岛素抗性病症的增加的风险相关联。

此外，本发明的主题是测定方法的应用，所述测定方法优选具有1nmol/L或以下、优选100pmol/L或以下、更优选10pmol/L或以下、更优选1pmol/L或以下、最优选0.5pmol/L或以下的灵敏度，用于测定对象的一种或多种心血管标志物水平相对于所述对象的所述标志物的基础水平的变化，其中测定方法能够测定降低。

重要的是注意到，在本发明中使用的测定方法测量所述一种或多种心血管标志物水平的降低的能力是至关重要的，其中降低导致所述一种或多种心血管标志物的水平非常低。因此，本文中使用的测定方法优选为超灵敏的，以便能够在基础水平位于健康群体中所述一种或多种心血管标志物水平的97.5^th百分位数之内的对象中，测量所述一种或多种心血管标志物水平的降低。

本发明的另一个主题是上面描述的测定方法的应用，用于测定对象的一种或多种心血管标志物水平相对于所述对象的所述标志物的基础水平的餐后变化。

优选情况下，测定方法是免疫测定法。

本发明的另一个主题是上面概述的测定方法的应用，其中一种或多种心血管标志物水平的所述变化被用于诊断、预测和/或监测具有与代谢综合征相关的病症的对象。

在本发明的另一个实施方案中，所述对象是具有与代谢综合征相关的医学病症的人类。

在特定实施方案中，一种或多种心血管标志物水平的所述变化被用于糖尿病、特别是2型糖尿病的诊断/预后和/或监测。

当在本文中使用时，术语“代谢综合征”是指心血管疾病和II型糖尿病的几种风险因子的集合，正如美国心脏联合会(American Heart Association)(AHA)和国家心脏、肺脏和血液研究所(National Heart，Lung and Blood Institute)(NHLBI)所定义的(Grundy等，2005.Circulation 112：2735-3752)，在此引为参考。代谢综合征的重要要素包括葡萄糖不耐受性和血脂异常、高血压和躯干性肥胖症等。如果下述5个判据中的3个得到满足，则可以诊断为代谢综合征：粗的腰围(在男性中≥102cm以及在女性中≥88cm)，高甘油三酯(分别≥150mg/dL/1.7mmol/L，或用于高甘油三酯的药物治疗)，低HDL胆固醇(在男性中分别＜40mg/dL/1.03mmol/L；在女性中分别＜50mg/dL/1.3mmol/L；或用于低HDL胆固醇的药物治疗)，高血压(收缩压≥130mmHg或舒张压≥85mmHg，或在具有高血压史的患者中进行抗高血压药物治疗)，以及高禁食葡萄糖(≥100mg/dL或用于高血糖的药物治疗)。

更近些时候由国际糖尿病联盟(International Diabetes Federation)给出了具有一些修改的定义(http://www.idf.org/webdata/docs/IDF_Meta_def_final.pdf)。

在本发明的另一个优选实施方案中，与代谢综合征相关的病症选自心肌梗塞(MI)、冠脉综合征、充血性心力衰竭(CHF)、冠状动脉疾病(动脉粥样硬化)、中风、短暂性缺血性发作(TIA)、外周动脉疾病、心肌症、II型糖尿病、肾衰竭和/或具有上面提到的疾病的一种或多种症状例如肥胖症、高血压、头痛、胸痛和呼吸困难的患者。

胰岛素抗性(IR)是其中给定浓度的胰岛素产生低于预期的生物学效应的状态。胰岛素抗性也已被任意定义为每天需要200以上单位的胰岛素才能获得血糖控制并阻止酮病。由胰岛素抗性引起的高血浆胰岛素和葡萄糖水平，通常导致代谢综合征和2型糖尿病，包括其并发症。IR的症状可以包括疲劳、大脑迷糊、注意力无法集中、低血糖、肠膨胀、嗜睡、体重增加、脂肪储存、减肥困难、高血液甘油三酯水平、高血压和抑郁。

心血管疾病的特征在于心肌或为心脏、脑和其他关键器官供血的血管系统的机能障碍。术语“心血管疾病”覆盖了大范围的病症，包括动脉粥样硬化、冠状动脉疾病、心脏瓣膜病、心律不齐、心力衰竭、高血压、立位性低血压、休克、心内膜炎、主动脉及其分支的疾病、外周血管系统的病症、先天性心脏病、中风。

本发明的另一个主题是使用测定方法测定对象的一种或多种心血管标志物水平相对于所述对象的所述标志物的基础水平的变化，其中测定方法能够检测所述一种或多种心血管标志物水平的降低，并能够检测所述一种或多种心血管标志物水平的增加。

在测定方法的优选实施方案中，变化是增加或降低，并且其中测定方法具有1nmol/L或以下的灵敏度。

本发明的另一个实施方案是使用测定方法测定对象的一种或多种心血管标志物水平相对于所述对象的所述标志物的基础水平的餐后变化。

测定方法用于对象中代谢系统和/或心血管系统和/或胰岛素抗性病症的诊断、预后和/或监测/治疗追踪。

本发明的另一个目的是心血管肽的应用，用于患者的代谢系统和/或心血管系统病症的诊断、预后和/或治疗追踪。

当在本文中使用时，术语“对象”是指活的人类或非人类生物体。在本文中，优选情况下对象是人类对象。

当在本文中使用时，术语“样品”是指出于对目标对象例如患者进行诊断、预后或评估的目的而获得的体液样品。优选的测试样品包括血液、血清、血浆、脑脊液、尿液、唾液、痰液和胸膜腔积液。此外，本技术领域的专业人员将会认识到，某些测试样品在分级或纯化步骤、例如将全血分离成血清或血浆组分后，可以更容易地分析。

因此，在本发明的优选实施方案中，样品选自血液样品、血清样品、血浆样品、脑脊液样品、唾液样品和尿液样品，或上面提到的任何样品的提取物。优选情况下，样品是血液样品，最优选为血清样品或血浆样品。

通过本发明的方法或通过使用本发明的测定方法获得的标志物的水平，可以本技术领域的专业人员熟知的各种方式进行分析。例如，可以将获得的每个测定结果与“正常”值或表明特定疾病或结果的值进行比较。具体的诊断/预后可以取决于每个测定结果与这种值的比较，所述值可以被称为诊断或预后“阈值”。

诊断和/或预后测试的灵敏度和特异性不仅取决于测试的分析“质量”，而且还取决于构成异常结果的定义。在实践中，典型地通过将“正常”(即表观健康的)和“患病”群体(即患有糖尿病、胰岛素抗性和/或代谢综合征的患者)的变量值对其相对频率进行作图，计算出受试者工作特征曲线(ROC曲线)。对于任何特定标志物来说，患有或未患疾病的对象的标志物水平分布可能交叠。在这些条件下，测试不能以100％准确性绝对辨别正常与疾病，并且交叠的区域表示测试不能辨别正常与疾病的地方。选择一个阈值，高于它(或低于它，取决于标志物随着疾病如何变化)时测试被认为是异常的，低于它时测试被认为是正常的。ROC曲线下的面积是感觉到的测量值将允许正确鉴定病症的概率的度量。即使在测试结果不一定给出准确数字的情况下，ROC曲线也能使用。只要人们能够对结果排序，人们即能产生ROC曲线。例如，在“患病”样品上进行的测试的结果可以按照程度排序(例如1＝低，2＝正常，3＝高)。这种排序可以与“正常”群体中的结果相关联，并产生ROC曲线。这些方法在本技术领域中是公知的。参见例如Hanley等，Radiology 143：29-36(1982)。优选情况下，所选的阈值能够提供的ROC曲线面积大于约0.5、更优选大于约0.7、更优选大于约0.8、更优选大于约0.85，并且最优选大于约0.9。在该上下文中，术语“约”是指给定测量值的+/-5％。

ROC曲线的水平轴表示(1-特异性)，其随着假阳性率而增加。曲线的垂直轴表示灵敏度，其随着真阳性率而增加。因此，对于所选的具体截止值来说，可以测定(1-特异性)的值，并可以获得相应的灵敏度。ROC曲线下的面积是测量到的标志物水平将允许正确鉴定疾病或病症的概率的度量。因此，ROC曲线下的面积可用于确定测试的有效性。

在某些实施方案中，不依赖于组中的一个或多个标志物的具体阈值来确定从对象获得的标志物水平分布情况是否指示了特定诊断/预后。相反，本发明可以利用标志物组“分布情况”作为不可分割的整体进行评估。这种标志物组中变化的特定“指纹”组合形式能够有效用作特定的诊断或预后指示物。正如在本文中讨论的，变化的组合形式可以从单一样品或组的一个或多个成员的当时变化(或组的响应值)获得。这里的组是指一组标志物。

正如在本文后面所描述的，组的响应值优选通过对在各种截止值下特定标志物组的灵敏度对组的1-(特异性)进行ROC曲线作图来确定。在这些方法中，来自对象的标志物测量值的分布情况合在一起，被认为提供了诊断或预后的全局概率(表示成数字分值或风险百分率)。在这样的实施方案中，标志物的某些子集的增加可能足以在一个患者中指示特定诊断/预后，而标志物的不同子集的增加可能足以在另一个患者中指示相同或不同的诊断/预后。也可以向组中的一个或多个标志物施加权重因数，例如，当标志物在鉴定特定诊断/预后中效用特别高时，可以将其权重成使得在给定水平下，它单独即足以传递阳性结果的信号。同样，也可以提供权重因数，使得特定标志物的任何给定水平都不足以传递阳性结果的信号，而只有当另一个标志物也有助于分析时才传递结果的信号。

在某些实施方案中，标志物和/或标志物组被选择成表现出至少约70％的灵敏度、更优选至少约80％的灵敏度、更优选至少约85％的灵敏度、更优选至少约90％的灵敏度以及最优选至少约95％的灵敏度，与至少约70％的特异性、更优选至少约80％的特异性、更优选至少约85％的特异性、更优选至少约90％的特异性以及最优选至少约95％的特异性的组合。在特别优选实施方案中，灵敏度和特异性两者均为至少约75％、更优选至少约80％、更优选至少约85％、更优选至少约90％以及最优选至少约95％。在这种情况下，术语“约”是指给定测量值的+/-5％。

在其他实施方案中，阳性似然比、阴性似然比、机会比或风险比被用作测试的预测风险或诊断疾病的能力的度量。在阳性似然比的情况下，值为1表示在“患病”和“对照”组二者的对象中阳性结果可能性相等；值大于1表示在患病组中阳性结果可能性更大；值小于1表示在对照组中阳性结果可能性更大。在阴性似然比的情况下，值为1表示在“患病”和“对照”组二者的对象中阴性结果可能性相等；值大于1表示在测试组中阴性结果可能性更大；值小于1表示在对照组中阴性结果可能性更大。在某些优选实施方案中，标志物和/或标志物组优选被选择成表现出至少约1.5或以上或约0.67或以下、更优选至少约2或以上或约0.5或以下、更优选至少约5或以上或约0.2或以下、更优选至少约10或以上或约0.1或以下，以及最优选至少约20或以上或约0.05或以下的阳性或阴性似然比。在这种情况下，术语“约”是指给定测量值的+/-5％。

在机会比的情况下，值为1表示在“患病”和“对照”组二者的对象中阳性结果可能性相等；值大于1表示在患病组中阳性结果可能性更大。值小于1表示在对照组中阳性结果可能性更大。在某些优选实施方案中，标志物和/或标志物组优选被选择成表现出至少约2或以上或约0.5或以下、更优选至少约3或以上或约0.33或以下、更优选至少约4或以上或约0.25或以下、更优选至少约5或以上或约0.2或以下以及最优选至少约10或以上或约0.1或以下的机会比。在这种情况下，术语“约”是指给定测量值的+/-5％。

在风险比的情况下，值为1表示在“患病”和“对照”组二者中终点(例如死亡)的相对风险相等；值大于1表示在患病组中风险更高；值小于1表示在对照组中风险更高。在某些优选实施方案中，标志物和/或标志物组优选被选择成表现出至少约1.1或以上或约0.91或以下、更优选至少约1.25或以上或约0.8或以下、更优选至少约1.5或以上或约0.67或以下、更优选至少约2或以上或约0.5或以下以及最优选至少约2.5或以上或约0.4或以下的风险比。在这种情况下，术语“约”是指给定测量值的+/-5％。

专业技术人员将会理解，将诊断或预后指示物与诊断或与将来临床结果的预后风险相关联，是一种统计学分析。例如，标志物水平大于X可以传递患者与水平低于或等于X的患者相比更可能遭受不利后果的信号，正如通过统计学显著性水平所确定的。统计学显著性通常通过比较两个或多个群体并确定置信区间和/或p值来确定。参见例如Dowdy和Wearden，《用于研究的统计学》(Statistics for Research)，John Wiley & Sons，New York，1983。本发明的优选置信区间是90％、95％、97.5％、98％、99％、99.5％、99.9％和99.99％，而优选的p值是0.1、0.05、0.025、0.02、0.01、0.005、0.001和0.0001。

序列

肾上腺髓质素的前体肽(前肾上腺髓质素原)的氨基酸序列提供在SEQ ID NO：1中。肾上腺髓质素是指前肾上腺髓质素原序列的22至185位氨基酸残基。肾上腺髓质素原(pro-ADM)的氨基酸序列提供在SEQ ID NO.2中。pro-ADM N-端20肽(PAMP)是指pre-proADM的22-41位氨基酸残基。PAMP的氨基酸序列提供在SEQ ID NO：3中。MR-pro-肾上腺髓质素(MR-pro-ADM)是指pre-pro-ADM的45-92位氨基酸残基。MR-pro-ADM的氨基酸序列提供在SEQ ID NO：4中。成熟的肾上腺髓质素(ADM)的氨基酸序列提供在SEQ ID NO：5中。

ANP的氨基酸序列提供在SEQ ID NO：8中。153个氨基酸的pre-pro-ANP的序列显示在SEQ ID NO：6中。在切掉N-端信号肽(25个氨基酸)和两个C-端氨基酸(127/128)后，释放出proANP(SEQ ID NO：7)。ANP包含来自前体激素原pro-ANP的C-端的99-126位残基。该激素原被切割成成熟的28个氨基酸的肽ANP，也称为ANP(1-28)或α-ANP，以及氨基端片段ANP(1-98)(NT-proANP，SEQ ID NO：9)。中段proANP(MR-proANP)被定义为NT-proANP或其包含proANP的至少53-90位氨基酸残基(SEQ ID NO：10)的任何片段。

164个氨基酸的血管加压素前体肽(前血管加压素原)的序列提供在SEQ ID NO：11中。血管加压素原是指前血管加压素原序列的29至164位氨基酸残基。血管加压素原的氨基酸序列提供在SEQ ID NO：12中。血管加压素原被切割成成熟的血管加压素、后叶激素运载蛋白II和C-端血管加压素原(CT-proAVP或和肽素)。血管加压素是指前血管加压素原的20至28位氨基酸残基。血管加压素的氨基酸序列显示在SEQ ID NO：13中。和肽素是指前血管加压素原的126至164位氨基酸残基。和肽素的氨基酸序列提供在SEQ ID NO：14中。后叶激素运载蛋白II包含前血管加压素原的32至124位氨基酸残基，其序列显示在SEQ ID NO：15中。

212个氨基酸的内皮素-1的前体肽(前内皮素原-1)的序列提供在SEQ ID NO：16中。Pro-ET-1是指pre-pro-ET-1序列的18至212位氨基酸残基。pro-ET-1的氨基酸序列提供在SEQ ID NO：17中。Pro-ET-1被切割成成熟ET-1、big-ET-1和C-端proET-1(CT-proET-1)。ET-1是指pre-pro-ET-1的53至73位氨基酸残基。ET-1的氨基酸序列显示在SEQ ID NO：18中。CT-proET-1是指pre-pro-ET-1的168至212位氨基酸残基。CT-proET-1的氨基酸序列提供在SEQ ID NO：19中。Big-ET-1包含pre-pro-ET-1的53至90位氨基酸残基，其序列显示在SEQ ID NO：20中。

134个氨基酸的脑利尿钠肽的前体肽(pre-pro-BNP)的序列提供在SEQ ID NO：21中。Pro-BNP是指pre-pro-BNP的27至134位氨基酸残基。pro-BNP的序列显示在SEQ ID NO：22中。Pro-BNP被切割成N-端pro-BNP(NT-pro-BNP)和成熟BNP。NT-pro-BNP包含27至102位氨基酸残基，其序列显示在SEQ ID NO：23中。SEQ ID NO：24显示了BNP的序列，其包含pre-pro-BNP肽的103至134位氨基酸残基。

SEQ ID NO：1(pre-pro-ADM的氨基酸序列)：

1    MKLVSVALMY LGSLAFLGAD TARLDVASEF RKKWNKWALS RGKRELRMSS

51   SYPTGLADVK AGPAQTLIRP QDMKGASRSP EDSSPDAARI RVKRYRQSMN

101  NFQGLRSFGC RFGTCTVQKL AHQIYQFTDK DKDNVAPRSK ISPQGYGRRR

151  RRSLPEAGPG RTLVSSKPQA HGAPAPPSGS APHFL

SEQ ID NO：2(pro-ADM的氨基酸序列)：

1    ARLDVASEFR KKWNKWALSR GKRELRMSSS YPTGLADVKA GPAQTLIRPQ

51   DMKGASRSPE DSSPDAARIR VKRYRQSMNN FQGLRSFGCR FGTCTVQKLA

101  HQIYQFTDKD KDNVAPRSKI SPQGYGRRRR RSLPEAGPGR TLVSSKPQAH

151  GAPAPPSGSA PHFL

SEQ ID NO：3(pro-ADM N20的氨基酸序列)：

1    ARLDVASEFR KKWNKWALSR

SEQ ID NO：4(MR-pro-ADM的氨基酸序列)：

1    ELRMSSSYPT GLADVKAGPA QTLIRPQDMK GASRSPEDSS

SEQ ID NO：5(ADM的氨基酸序列)：

1    YRQSMNNFQG LRSFGCRFGT CTVQKLAHQI YQFTDKDKDN VAPRSKISPQ

51   GY

SEQ ID NO：6(pre-pro-ANP的氨基酸序列)：

1    MSSFSTTTVS FLLLLAFQLL GQTRANPMYN AVSNADLMDF KNLLDHLEEK

51   MPLEDEVVPP QVLSEPNEEA GAALSPLPEV PPWTGEVSPA QRDGGALGRG

101  PWDSSDRSAL LKSKLRALLT APRSLRRSSC FGGRMDRIGA QSGLGCNSFR

151  YRR

SEQ ID NO：7(pro-ANP的氨基酸序列)：

1    NPMYNAVSNA DLMDFKNLLD HLEEKMPLED EVVPPQVLSE PNEEAGAALS

51   PLPEVPPWTG EVSPAQRDGG ALGRGPWDSS DRSALLKSKL RALLTAPRSL

101  RRSSCFGGRM DRIGAQSGLG CNSFRY

SEQ ID NO：8(ANP的氨基酸序列)：

1    SLRRSSCFGG RMDRIGAQSG LGCNSFRY

SEQ ID NO：9(NT-proANP的氨基酸序列)：

1    NPMYNAVSNA DLMDFKNLLD HLEEKMPLED EVVPPQVLSE PNEEAGAALS

51   PLPEVPPWTG EVS PAQRDGG ALGRGPWDSS DRSALLKSKL RALLTAPR

SEQ ID NO：10(proANP的53-90位氨基酸的氨基酸序列)：

1    PEVPPWTGEV SPAORDGGAL GRGPWDSSDR SALLKSKL

SEQ ID NO：11(pre-pro-AVP的氨基酸序列)：

1    MPDTMLPACF LGLLAFSSAC YFQNCPRGGK RAMSDLELRQ CLPCGPGGKG

51   RCFGPSICCA DELGCFVGTA EALRCQEENY LPSPCQSGQK ACGSGGRCAA

101  FGVCCNDESC VTEPECREGF HRRARASDRS NATQLDGPAG ALLLRLVQLA

151  GAPEPFEPAQ PDAY

SEQ ID NO：12(pro-AVP的氨基酸序列)：

1    CYFQNCPRGG KRAMSDLELR QCLPCGPGGK GRCFGPSICC ADELGCFVGT

51   AEALRCQEEN YLPSPCQSGQ KACGSGGRCA AFGVCCNDES CVTEPECREG

101  FHRRARASDR SNATQLDGPA GALLLRLVQL AGAPEPFEPA QPDAY

SEQ ID NO：13(AVP的氨基酸序列)：

1    CYFQNCPRG

SEQ ID NO：14(CT-pre-proAVP或和肽素的氨基酸序列)：

1    ASDRSNATQL DGPAGALLLR LVQLAGAPEP FEPAQPDAY

SEQ ID NO：15(后叶激素运载蛋白II的氨基酸序列)：

1    AMSDLELRQC LPCGPGGKGR CFGPSICCAD ELGCFVGTAE ALRCQEENYL

51   PSPCQSGQKA CGSGGRCAAF GVCCNDESCV TEPECREGFH RRA

SEQ ID NO：16(pre-pro-ET-1的氨基酸序列)：

SEQ ID NO：17(pro-ET-1的氨基酸序列)：

1    APETAVLGAE LSAVGENGGE KPTPSPPWRL RRSKRCSCSS LMDKECVYFC

51   HLDIIWVNTP EHVVPYGLGS PRSKRALENL LPTKATDREN RCQCASQKDK

101  KCWNFCQAGK ELRAEDIMEK DWNNHKKGKD CSKLGKKCIY QQLVRGRKIR

151  RSSEEHLRQT RSETMRNSVK SSFHDPKLKG KPSRERYVTH NRAHW

SEQ ID NO：18(ET-1的氨基酸序列)：

1    CSCSSLMDKE CVYFCHLDII W

SEQ ID NO：19(CT-pro-ET-1的氨基酸序列)：

1    RSSEEHLRQT RSETMRNSVK SSFHDPKLKG KPSRERYVTH NRAHW

SEQ ID NO：20(Big-ET-1的氨基酸序列)：

1    CSCSSLMDKE CVYFCHLDIIWVNTPEHVVP YGLGSPRS

SEQ ID NO：21(pre-pro-BNP的氨基酸序列)：

1    MDPQTAPSRA LLLLLFLHLA FLGGRSHPLG SPGSASDLET SGLQEQRNHL

51   QGKLSELQVE QTSLEPLQES PRPTGVWKSR EVATEGIRGH RKMVLYTLRA

101  PRSPKMVQGS GCFGRKMDRI SSSSGLGCKV LRRH

SEQ ID NO：22(pro-BNP的氨基酸序列)：

1    HPLGSPGSAS DLETSGLQEQ RNHLQGKLSE LQVEQTSLEP LQESPRPTGV

51   WKSREVATEG IRGHRKMVLY TLRAPRSPKM VQGSGCFGRK MDRISSSSGL

101  GCKVLRRH

SEQ ID NO：23(NT-pro-BNP的氨基酸序列)：

1    HPLGSPGSAS DLETSGLQEQ RNHLQGKLSE LQVEQTSLEP LQESPRPTGV

51   WKSREVATEG IRGHRKMVLY TLRAPR

SEQ ID NO：24(BNP的氨基酸序列)：

1    SPKMVQGSGC FGRKMDRISS SSGLGCKVLR RH

附图描述

图1、pre-pro-ADM的序列

图2、pro-ADM的序列

图3、pro-ADM N20的序列

图4、MR-pro-ADM的序列

图5、ADM的序列

图6、pre-pro-ANP的序列

图7、pro-ANP的序列

图8、ANP的序列

图9、NT-pro ANP的序列

图10、pro ANP的53-90位氨基酸的序列

图11、pre-pro-AVP的序列

图12、pro-AVP的序列

图13、AVP的序列

图14、CT-pre-pro AVP或和肽素的序列

图15、后叶激素运载蛋白II的序列

图16、pre-pro-ET-1的序列

图17、pro-ET-1的序列

图18、ET-1的序列

图19、CT-pro-ET-1的序列

图20、Big-ET-1的序列

图21、pre-pro-BNP的序列

图22、pro-BNP的序列

图23、NT-pro-BNP的序列

图24、BNP的序列

图25、在不肥胖正常血压对象(黑色菱形)、具有躯干性肥胖症的正常血压对象(白色菱形)和高血压对象(黑色三角形)中，口服葡萄糖耐受性试验过程中的血浆MR-proANP_53-90(A)和血清胰岛素(B)：^*不肥胖对肥胖的正常血压对象p＜0.05；肥胖的正常血压对高 血压对象p＜0.001；高血压对不肥胖的正常血压对象p＜0.01。

(C)在高胰岛素血症、正常血糖夹中血浆MR-proANP_53-90水平的抑制。(D)在具有低和高胰岛素敏感性的对象中的ΔMR-proANP_53-90(0-120min)，分别被测定为在夹的稳定状态下低于25^th和高于75^th百分位数的葡萄糖灌注速率(GIR)值。数据用盒须图显示。盒从25^th延伸到75^th百分位数，在中位数处的线指示50^th百分位数。须表示从最低延伸到最高值的范围。

图26、在n＝10个对象中，oGTT后NT-proBNP和MR-proANP_53-90相对浓度的比较。

图27、(代谢综合征)—胰岛素敏感性与120分钟时相对MR-proANP变化的相关性[胰岛素敏感性指数(ISI或SI)]：-对于健康人来说，t＝0时ISI＞4.5[禁食；-t＝30、60、90和120分钟时ISI≥6；-对于具有胰岛素抗性的人来说，t＝30、60、90和120分钟时，ISI＜6。

实施例

研究设计与方法

研究方案1(OGTT和钳夹试验)

研究方案得到波茨坦大学和德国柏林Charite医学院的伦理委员会的批准。在研究之前，从所有参加者获得了正式书面知情同意书。

研究设计

对象是正在进行中的代谢综合征和2型糖尿病的病源学的病例-对照关联性研究(代谢综合征柏林-波茨坦研究，MESY-BEPO)的一部分。在德国波茨坦和柏林，从普通人群召集志愿者。基线检查包括人体测量值、血液取样、75g口服葡萄糖耐受性测试(oGTT)和关于生活方式、嗜好和医疗史的个人面谈。该群体的亚组(n＝31)经历了高胰岛素血、正常血糖钳夹试验，其在oGTT后的另一天进行。

对象

研究了108位非高血压对象(55位非肥胖和53位躯干性肥胖症对象)和54位患有原发性高血压的患者。高血压被定义为收缩压≥140mmHg，舒张压≥90mm Hg，或使用抗高血压治疗。所有药物治疗的高血压对象在研究前的最近6个月内具有稳定的药物治疗。肝脏酶升高到超过相应正常上限的两倍、或具有高血浆肌酸酐浓度(＞1.3mg/dl)或具有严重病症包括全身性炎症、心力衰竭或晚期恶性肿瘤疾病的对象，被排除在研究之外。在oGTT和钳夹试验前3天内，所有对象被指令维持他们的正常体力活动并消费含有200g糖类的正常饮食。进行抗糖尿病治疗或新诊断的2型糖尿病的对象，被排除在检查之外。葡萄糖代谢紊乱的定义是基于1997年美国糖尿病学会(American Diabetes Association)的在过夜禁食和2小时75g oGTT后获得的葡萄糖值的判据(2000，“专家委员会关于糖尿病诊断和分类的报告”(Report of the Expert Committee on the Diagnosis and Classification of Diabetes Mellitus)，Diabetes Care 23 Suppl 1：S4-19)。

实验步骤

所有测试在12小时过夜禁食后的早晨进行。BP由经过训练的研究护士使用OmronHEM705CP血压计(Omron，Germany)在患者采取坐位时测量。以2分钟的间隔获得三个测量值，并使用平均值确定临床收缩压和舒张压。对于oGTT来说，在相对于口服葡萄糖输入的0、30、60、90、120和180分钟时抽取静脉血样。

正常血糖、高胰岛素血钳夹：

高胰岛素血、正常血糖钳夹使用每分钟每m²身体表面100mU人类胰岛素(Actrapid；Novo Nordisk，Bagsvaerd，Denmark)和20％葡萄糖(Serag Wiessner，Naila，Germany)的可变灌注进行120分钟(DeFronzo RA等，1979“葡萄糖钳夹技术：一种用于定量胰岛素分泌和抗性的方法”(Glucose clamp technique：a method for quantifying insulin secretion and resistance)，Am J Physiol 237：E214-23)。在钳夹的稳态条件下，将毛细血管血糖调整到5.5mmol/l至少60分钟。在假定的稳态条件期间单一毛细血管葡萄糖浓度的偏差＞10％，被定义为非稳态。在整个钳夹试验中，每5分钟监测毛细血管血糖浓度，并使用它通过调整葡萄糖的可变灌注来调节血浆葡萄糖。

分析步骤

将所有静脉血样立即离心并冷冻在-70℃下直到进行分析。毛细血管血糖浓度使用葡萄糖氧化酶方法在Dr.Müller G-L葡萄糖分析仪(Dr.Müller Glucose analyzer，Freital，Germany)上测定。血清甘油三酯、总胆固醇和HDL-胆固醇通过标准的酶测定法测定，并从这些数据计算LDL-胆固醇(进行临床化学分析的认证实验室)。HbA1c使用Hi-Auto A1C HA-8140系统(Menarini Diagnostics，Germany)测定。血清胰岛素使用商业化的酶联免疫吸附测定法(胰岛素ELISA，Mercodia AB，Uppsala，Sweden)测量。稳态模型评估胰岛素抗性(Homeostasis Model Assessment Insulin Resistance)(HOMA-IR)被计算为禁食胰岛素(IU/L)x禁食葡萄糖(mmol/L)/22.5(Matthews DR等，1985“稳态模型评估：从人类禁食血浆葡萄糖和胰岛素浓度评估胰岛素抗性和β-细胞功能”(Homeostasis model assessment：insulin resistance and beta-cell function from fasting plasma glucose and insulin concentrations in man)，Diabetologia 28：412-9)。

人类血浆MR-proANP53-90按照以前的描述测定(MorgenthalerNG等，2004“用于人类血浆中中段心房利尿钠肽原的免疫发光测定法”(Immunoluminometric assay for the midregion of pro-atrial natriuretic peptide in human plasma)，Clin Chem 50：234-6)。

NT-proBNP通过电化学发光免疫测定法(ELICIA，Roche Diagnostics，Basel，Switzerland)测定。

统计学分析

我们将研究群体分成三组：具有原发性高血压的患者(n＝54)、具有躯干性肥胖症的非高血压对象(n＝53)，以及没有躯干性肥胖症的非高血压对象(n＝55)。躯干性肥胖症按照ATP III定义的代谢综合征判据来诊断(国家胆固醇教育项目(NCEP)成年人高血液胆固醇检测、评估和治疗专家委员会(National Cholesterol Education Program(NCEP)Expert Panel on Detection，Evaluation，and Treatment of HighBlood Cholesterol in Adults)(成人治疗委员会III)，国家胆固醇教育项目(NCEP)专家委员会关于成年人高血液胆固醇的检测、评估和治疗的第三次报告(成人治疗委员会III)最终报告(Third report of the national Cholesterol Education Program(NCEP)expert panel on detection，evaluation，and treatment of high blood cholesterol in adults(Adult Treatment Panel III)Final report)，Circulation 2002；106：3143-3421)。

一般特征提供为平均值±SD。所有其他数据显示为平均值±SEM。所有数据在分析之前进行对数转换。在oGTT中计算从0到180min的ΔMR-proANP_53-90。组比较通过ANOVA进行，然后进行Sidak检验作为事后多组比较。使用重复测量值ANOVA分析来比较三组之间在oGTT期间的MR-proANP_53-90时间过程。关联性分析通过Pearson′s相关性分析来进行。在钳夹试验中，胰岛素敏感性被确定为钳夹试验的稳态(至少30分钟)中葡萄糖灌注速率(GIR；mg每kg体重·min^-1)除以稳态中的循环胰岛素浓度(pmol/l)。使用用于成对样品的非参数性Wilcoxon′s符号秩次检验比较来自基线和稳态中的数据。在所有分析中，P值＜0.05被认为是显著的。所有统计学分析使用用于Windows的SPSS第14版(SPSS Inc.，Chicago，Illinois)进行。

结果

研究群体的特征概述在表1中。肥胖的正常血压对象与非肥胖正常血压对象相比胰岛素抗性更高：他们具有更高的禁食胰岛素和血糖浓度、更低的HDL-胆固醇浓度和甘油三酯水平以及更高的SPB和DBP。除了较高的年龄、HbA1c水平和SBP之外，具有高血压的肥胖对象与肥胖的正常血压对象在BMI、腰围和胰岛素抗性方面相当。

在肥胖的正常血压对象中，与非肥胖的正常血压对象和具有高血压的肥胖对象相比，观察到最低的MR-proANP_53-90禁食浓度(53.9±28.0pmol/l对64.1±25.6pmol/l和77.5±30.8pmol/l)。在对年龄和BMI进行调整之后，差异仍然显著。在正常血压对象中，禁食MR-proANP_53-90水平与年龄(r＝0.429，p＜0.0001)、HDL-胆固醇(r＝0.270，p＝0.006)明显正相关，并与BMI(r＝-0.313，p＝0.001)、DBP(r＝-0.251，p＝0.009)、禁食胰岛素(r＝-0.276，p＝0.004)和HOMA-IR指数(r＝-0.268，p＝0.005)明显负相关。相反，在具有高血压的肥胖对象中，与MR-proANP_53-90的正相关性仅限于年龄(r＝0.546，p＜0.0001)。

在所有研究对象中，MR-proANP_53-90水平在口服葡萄糖激惹后30分钟时快速降低，并在整个测试过程中保持被抑制(p＜0.0001；基础水平对oGTT后30、60、90、120和180min时的水平)。在肥胖的正常血压对象中，与非肥胖正常血压对象和肥胖的高血压对象相比，激惹后从90至180分钟的MR-proANP_53-90浓度明显更低(图25A)。但是，在180分钟时MR-proANP_53-90的相对抑制相似(在非肥胖正常血压对象中是20.0±13.4％，在肥胖的正常血压对象中是21.4±19.5％，在高血压对象中是21.2±13.4％，NS)。在肥胖的正常血压对象中禁食和葡萄糖激惹后的胰岛素水平明显较低(图25B)，并与正常血压对象中禁食和激惹后从60到180分钟的MR-proANP_53-90水平负相关(r＝-0.198--0.358；p＜0.0001-0.05)，而这些关联性在高血压对象中弱得多。在正常血压和高血压对象中，在oGTT期间在禁食和激惹后血糖水平与MR-proANP_53-90水平之间没有相关性(数据未显示)。

尽管BNP在健康对象中似乎发挥次要生理作用，但它通常以与ANP相似的方式被调控。因此，我们测试了NT-proBNP水平是否也对口服葡萄糖激惹做出响应而降低。在10个对象中评估了NT-proBNP水平，并与该亚组中的MR-proANP_53-90进行比较。事实上，NT-proBNP的相对浓度在葡萄糖激惹后也降低，但是与MR-proANP_53-90相比响应更短暂并且更小(图26)。

31位肥胖个体(17位正常血压对象和14位高血压对象)经历了正常血糖-高胰岛素血钳夹试验。正常血压对象与高血压对象在年龄、BMI、腰围和胰岛素灵敏性方面匹配(平均值±SE；分别为30.6±3.5kg/m²对32.0±3.4kg/m²，p＝0.341；101.0±7.3cm对103.6±8.8cm，p＝0.526；6.1±1.6mg/kg体重x min^-1对5.5±2.0mg/kg体重x min^-1，p＝0.388)。在正常血压与高血压对象之间禁食血糖、胰岛素和MR-proANP_53-90水平没有差异(平均值±SE；分别为5.2±0.5mmol/l对5.4±0.6mmol/l，p＝0.147；66.0±40.2pmol/l对76.2±39.0pmol/l，p＝0.470；59.5±18.3pmol/l对61.0±31.5pmol/l，p＝0.874)。在正常血糖钳夹试验中，在夹住120分钟时，循环胰岛素水平在正常血压对象中增加到1223(范围为708-2106)pmol/l，在高血压对象中增加到1247(范围为430-1476)pmol/l(p＝0.489)。在两个组中，在夹住120分钟时，MR-proANP_53-90水平与基础值相比显著降低，但是在两个组之间没有差异(ΔMR-proANP_53-900-120min在正常血压对象中为11.1(-1.3-25.1)pmol/l，在高血压对象中为8.5(-35.2-34.6)；p＝0.297)(图25C)。在具有低和高胰岛素灵敏性的对象中，没有观察到MR-proANP_53-90抑制(被测定为分别低于25^th和高于75^th百分位数的葡萄糖灌注速率值)的差别(图25D)。

在健康个体中(n＝264)，平均MR-ProADM浓度为0.33nmol/L(标准偏差0.07nmol/L，范围为0.1-0.64nmol/L，99^th百分位数为0.52nmol/L，97.5^th百分位数为0.49nmol/L，2.5^th百分位数为0.17nmol/L，1^st百分位数为0.14nmol/L。测定方法的检测下限为0.08nmol/L(Morgenthaler等，2005.Clin Chem 51(10)：1823-1829)。

在健康个体中(n＝325)，MR-ProANP浓度的中位数为45pmol/L，范围为9.6-313pmol/L，99^th百分位数为197.5pmol/L，97.5^th百分位数为163.9pmol/L，2.5^th百分位数为18.4pmol/L，1^st百分位数为13.6pmol/L。测定方法的检测下限为6.0pmol/L(Morgenthaler等，2004.Clin Chem 50(1)：234-236)。

在健康个体中(n＝359)，CT-ProAVP浓度的中位数为4.2pmol/L，范围为1-13.8pmol/L，99^th百分位数为13.5pmol/L，97.5^th百分位数为11.25pmol/L，2.5^th百分位数为1.7pmol/L。测定方法的检测下限为1.7pmol/L(Morgenthaler等，2006.Clin Chem 52(1)：112-119)。359位个体中的9位具有低于检测下限的CT-proAVP值，并被定义为1.0pmol/L。

在健康个体中(n＝326)，平均CT-ProET1浓度为44.3pmol/L(标准偏差10.6pmol/L)，范围为10.5-77.4pmol/L，99^th百分位数为72.8pmol/L，97.5^th百分位数为66.6pmol/L，2.5^th百分位数为24.8pmol/L，1^st百分位数为17.4pmol/L。测定方法的检测下限为0.4pmol/L(Papassotiriou等，2006.Clin Chem 52(6)：1144-1151)。

在健康对象中(n＝2264)，平均NT-proBNP浓度为5.94pmol/l(标准偏差7.36pmol/l)，中位数是3.25pmol/l，97.5^th百分位数为19.94pmol/l，95^th百分位数为17.58pmol/l。测定方法的检测下限为0.59pmol/l。

表1、研究对象的临床和生物化学特征

除非另有指明，否则值是平均值±SD。所有的值均未调整过。^ap＜0.0001；^bp＜0.01；^cp＜0.05，相对于非肥胖无高血压对象，以及^dp＜0.0001；^ep＜0.05，相对于肥胖的高血压对象。肥胖症根据ATIII用于代谢综合征的判据定义为“躯干性肥胖症”：腰围对于女性来说＞88cm，对于男性来说＞102cm。

研究方案得到波茨坦大学和德国柏林Charite医学院的伦理委员会的批准。在研究之前，从所有参加者获得了正式书面知情同意书。

分析步骤(bitte überpriifen und überarbeiten/)

将所有静脉血样立即离心并冷冻在-70℃下直到进行分析。毛细血管血糖浓度使用葡萄糖氧化酶方法在Dr.Müller G-L葡萄糖分析仪(Dr.Müller Glucose analyzer，Freital，Germany)上测定。HbA1c使用Hi-AutoA1C HA-8140系统(Menarini Diagnostics，Germany)测定。血清胰岛素使用商业化的酶联免疫吸附测定法(胰岛素ELISA，Mercodia AB，Uppsala，Sweden)测量。稳态模型评估胰岛素抗性(Homeostasis Model Assessment Insulin Resistance)(HOMA-IR)被计算为禁食胰岛素(IU/L)x禁食葡萄糖(mmol/L)/22.5(Matthews DR等，1985“稳态模型评估：从人类禁食血浆葡萄糖和胰岛素浓度评估胰岛素抗性和β-细胞功能”(Homeostasis model assessment：insulin resistance and beta-cell function from fasting plasma glucose and insulin concentrations in man)，Diabetologia 28：412-9)

人类血浆MR-proANP53-90按照以前的描述测定(Morgenthaler NG等，2004“用于人类血浆中中段心房利尿钠肽原的免疫发光测定法”(Immunoluminometric assay for the midregion of pro-atrial natriuretic peptide in human plasma)，Clin Chem 50：234-6)。

NT-proBNP通过电化学发光免疫测定法(ELICIA，Roche Diagnostics，Basel，Switzerland)测定。