采用光反射差法无标记高通量探测生物芯片的装置

摘要

本发明提供一种用光反射差法无标记高通量探测生物芯片的装置，该装置包括一入射光路和一由小孔部件、光电探测器、第一锁相放大器、第二锁相放大器和计算机系统组成的反射光探测光路；还包括第一光栅尺安装在x轴扫描台上，第二光栅尺安装在y轴扫描台上；该x轴扫描台和该y轴扫描台安放在三维调节架上，x轴扫描台和y轴扫描台分别与第一光栅尺和第二光栅尺电连接；第一光栅尺和第二光栅尺分别与计算机系统电连接。利用精密光栅尺提供的信号严格与扫描台位移一致，采用精密光栅尺控制生物芯片的二维快速扫描，实现了高通量的探测，克服了已有技术由于加速度和不均匀性的影响，难以快速探测的缺点。采用透镜和小孔装置提高了探测的灵敏度和分辨率。

说明书

技术领域

本发明涉及一种探测生物芯片的光学测量装置；特别涉及一种用光反射差法无标记高通量探测生物样品的装置。

背景技术

生物大分子之间如何相互作用及调控是当前生命科学面临的最基本问题之一，也是解释生命本质与奥妙的重要组成部分，生物大分子相互作用的检测是研究生物分子相互作用的关键。随着生命科学进入基因组、后基因组时代，研究方法已从单个生物大分子的孤立研究扩展到具有整体性、网络式、动态性等特点。因此发展无标记、高通量、并行检测的方法和装置是应时之需，已成为生命科学取得突破进展的关键之一。

荧光标记法和表面等离子体共振法是目前具有代表性的两种高灵敏度检测方法。荧光标记法具有高灵敏度和高通量的特点，但需要荧光标记，存在可能改变蛋白质的性质、产生光致漂白和检测时间长费用大等不足。如参考文献1：Kodadek，T.Chem.Biol.8，105-115(2001)。表面等离子共振法虽然具有无标记和高灵敏度的特点，但由于其灵敏度来源于表面等离子的共振，不仅对生物芯片有很高的要求、而且手续繁琐、检测成本比较昂贵，在高通量检测方面具有一定的困难。如参考文献2：F.Mannelli，等Bioelectrochemistry 66，129(2005)。正如英国剑桥大学著名的M.Cooper博士在“Drug Discovery&Development”网上对生命科学传感器的评论中指出：“目前还没有真正无标记高通量的生物传感器”。

光反射差法是近年来发展起来的一种非接触、无损伤的高灵敏度探测新方法，不仅可同时获得实部和虚部两路信号，具有很高的灵敏度，而且具有很高的空间分辨率和时间分辨率。本发明人和合作者首次发展了氧化物薄膜原子尺度外延生长的光反射差法原位实时探测方法，已获授权发明和实用新型专利各两项(专利号：ZL97219032.1；ZL97121997.4；ZL03153938.6；Zl03276452.9)。在此基础上，本发明人和合作者分别对蛋白质、核酸等生物样品进行了光反射差法无标记的检测，实验结果表明，光反射差法是无标记和高通量检测生物大分子相互作用(如蛋白与蛋白，蛋白与核酸，核酸与核酸等)的一种好方法。本发明人和合作者已申请相关专利4项(专利申请号：200810057538.0；200810101699.5；200810101699.5；200810101700.4)。尽管上述专利都是无标记的探测，但都还达不到高通量探测的要求。Y.Y.Fei等采取反射镜扫描和透镜系统，用光反射差法实现了高通量探测。如参考文献3：Y.Y.Fei，at el，Review of scientificinstruments，79，013708(2008)。但在此方案中，一方面通过反射镜扫描来实现光束的扫描达到几个微米的精度，其稳定性和重复性的要求是非常高的，因而装置结构比较复杂。另一方面，由于透镜不同部位对光束聚焦的畸变，使探测结果可能产生误差，其图像处理也是比较复杂的。因此，到目前为止，如何实现生物芯片无标记高通量的检测仍然是一个挑战。

发明内容

本发明的目的在于，克服上述一般光反射差法探测生物芯片难以实现高通量检测，而采用反射镜扫描和透镜系统的技术，使得测量装置和图像处理过程相当复杂的缺点；从而提供一种采用光栅尺控制扫描实现高通量，利用透镜和小孔装置提高分辨率与灵敏度的用光反射差法无标记高通量探测生物芯片的装置。

本发明的目的之二在于：应用本发明的装置检测蛋白质与蛋白质、蛋白与核酸、核酸与核酸等生物大分子相互作用的不同的生物样品和不同的生物芯片的方法，该方法不仅可高通量的探测生物芯片，而且具有高的灵敏度和分辨率。

本发明的目的是这样实现的：

本发明提供的用光反射差法无标记高通量探测生物芯片的装置，包括一由激光器1、调制器2、普克盒3、分析器4和第一透镜5组成的入射光路；一由小孔部件13、光电探测器14、第一锁相放大器15、第二锁相放大器15′和计算机系统16组成的反射光探测光路；其特征在于，还包括一个三维调节架11、x轴扫描台7、第一光栅尺8、y轴扫描台9、第二光栅尺10和第二透镜12；其中，所述的第一光栅尺8安装在所述的x轴扫描台7上，所述的第二光栅尺10安装在所述的y轴扫描台9上；该x轴扫描台7和该y轴扫描台9安放在所述的三维调节架11上，所述的x轴扫描台7和y轴扫描台9分别与第一光栅尺8和第二光栅尺10电连接；第一光栅尺8和第二光栅尺10分别与计算机系统16电连接；测量时生物芯片6安放在该x轴扫描台7上面，以便调节生物芯片6的水平；在所述的小孔部件13反射光前方光路中插入所述的第二透镜12，第二透镜12把从生物芯片反射的光束扩束，将从生物芯片6上表面和下表面的反射光束分开，仅探测从生物芯片6具有生物样品的一个表面的反射光，排除了生物芯片另一个没有生物样品表面反射光的干扰，提高了探测的灵敏度和信噪比；用光电探测器14检测小孔部件13选取的从生物样品的反射光，光电探测器14输出的信号同时输入第一锁相放大器15和第二锁相放大器15′，第一锁相放大器15和第二锁相放大器15′放大后的信号输入计算机系统16，分别检测反射光的基频和倍频信号；其中，第一光栅尺8和第二光栅尺10提供的位置移动信号，反馈给计算机控制系统，计算机控制系统根据第一光栅尺8和第二光栅尺10提供的位置移动信号，控制x轴扫描台7和y轴扫描台9的马达按照设定的扫描范围进行二维扫描。由于光栅尺提供的信号严格的与扫描台的位移一致，与扫描的速度和均匀性没有直接的关系，因而克服了一般扫描系统必须考虑扫描的加速、稳定等产生的影响，实现生物芯片6的二维快速扫描。

在上述的技术方案中，还包括2个驱动马达，第一驱动马达分别与所述的x轴扫描台7和计算机系统16电连接，第二驱动马达分别与所述的y轴扫描台9和计算机系统16电连接；x轴扫描台7和y轴扫描台9可以同时采用计算机通过光栅尺的信号控制马达扫描，也可以x轴扫描台7(或y轴扫描台9)采用计算机通过光栅尺的信号控制马达扫描，y轴扫描台9(或x轴扫描台7)不使用光栅尺，而采用计算机直接控制马达扫描。

在上述的技术方案中，所述的小孔部件13，用来选取从生物样品表面反射光的中心部分进行探测，用光电探测器14检测小孔部件13选取的从生物样品的反射光，这样相当于减小了扫描光斑，而且可排除杂散光的干扰，因而提高了分辨率。所述的小孔部件13为一块不透明的金属或塑料平板上开一个小孔，该小孔的直径根据检测需要的探测光光斑大小和形状设计。

在上述的技术方案中，还包括2个以上所述的小孔部件13，该2个以上小孔部件13串联设置在探测光路中，或一个一个的分别放在探测光路的不同位置。当选用小孔的直径比较小时，采用串联的几个小孔具有一定的优点。因为光束通过小孔后往往会产生衍射，采用几个串联的小孔，后面的小孔就可阻挡和隔离前面小孔所产生的衍射光，因而可排除衍射光的干扰和提高检测的信躁比。

在上述的技术方案中，所述的金属平板为合金铝板或钢板或铁板或塑料，并把制作了小孔的金属板煮黑。

在上述的技术方案中，所述的小孔部件上的小孔做成圆形、方形或矩形或一条狭缝；该小孔的尺寸和光束的尺寸一致，也可以比光束的尺寸小。小孔可以绕垂直于光束和入射光平面的轴旋转360度，测量时旋转小孔就可以在入射平面上得到需要的光斑形状。

本发明相对于已有技术具有以下优点：

由于在本发明的无标记高通量探测生物芯片的装置中设置了第二透镜，该透镜把从生物芯片反射的光束扩束，将从生物芯片6上表面和下表面的反射光束分开，仅探测从生物芯片6具有生物样品的一个表面的反射光，排除了生物芯片另一个没有生物样品表面反射光的干扰，提高了探测的灵敏度和信噪比。

本发明的用光反射差法无标记高通量探测生物芯片的装置中还利用了小孔，该小孔用来选取从生物样品表面反射光的中心部分进行探测，用光电探测器14检测小孔13选取的从生物样品的反射光，这样相当于减小了扫描光斑，而且可排除杂散光的干扰，因而提高了分辨率。

本发明的用光反射差法无标记高通量探测生物芯片的装置中还包括2个驱动马达，第一驱动马达分别与所述的x轴扫描台7和计算机系统16电连接，第二驱动马达分别与所述的y轴扫描台9和计算机系统16电连接；x轴扫描台7和y轴扫描台9可以同时采用光栅尺的信号用计算机控制马达扫描，也可以x轴扫描台7(或y轴扫描台9)采用光栅尺的信号用计算机控制马达扫描，y轴扫描台9(或x轴扫描台7)不使用光栅尺，直接用计算机控制马达扫描。

本发明提供的用光反射差法无标记高通量探测生物芯片的装置，由于第一光栅尺和第二光栅尺提供的位置移动信号，反馈给计算机控制系统，计算机控制系统根据第一光栅尺和第二光栅尺提供的位置移动信号，控制x轴扫描台和y轴扫描台的马达，按照设定的扫描范围进行二维扫描。由于光栅尺提供的信号严格的与扫描台的位移一致，与扫描的速度和均匀性没有直接的关系，因而克服了一般扫描系统必须考虑扫描的加速、稳定等产生的影响，实现生物芯片6的二维快速扫描。不仅实现了生物芯片无标记高通量的检测，而且具有很高的灵敏度和分辨率。适用于探测蛋白质与蛋白质、蛋白与核酸、核酸与核酸等生物大分子相互作用的不同的生物样品和不同的生物芯片，生物芯片可以是一个生物样品点，也可以是成千上万个生物样品点的面阵生物芯片，还可以原位实时监测生物大分子的相互反应，因而在生化研究、制药和临床等领域具有非常广泛的应用。

附图说明

下面结合附图及实施例对本发明进行详细的说明：

图1本发明的无标记高通量探测生物芯片的装置示意图。

图2采用本发明无标记高通量探测核酸生物芯片获得的基频信号扫描成像图。

图3采用本发明无标记高通量探测核酸生物芯片获得的倍频信号扫描成像图。

图面说明如下：

1-激光器；2-调制器；3-普克盒；4-分析器；

5-第一透镜；6-生物芯片；7-x轴扫描台；8-第一光栅尺；

9-y轴扫描台；10-第二光栅尺；11-三维调节架 12-第二透镜

13-小孔；4-探测器；15-第一锁相放大器；

15′-第二锁相放大器 16-计算机系统。

具体实施方式

实施例1：

参考图1，制作一台本发明的采用光反射差法无标记高通量探测生物芯片的装置，本实施例利用专利号为ZL03153938.6所提供的光反射差法装置进行了改造。

本实施例中激光器1选用输出偏振光波长632.8nm的He-Ne激光器，在激光器1输出光的前方安置一个调制器2(美国Hinds公司生产的PEM90型光弹调制器)，在调制器2后安置普克盒3(Cleveland Crystals公司生产的IMPACT10型普克盒)，在普克盒3后安置一分析器4(从New Focus购买的5524型偏振器)，在分析器4安置第一透镜5，其第一透镜5的焦距为10厘米。由激光器1、调制器2、普克盒3、分析器4和第一透镜5组成的入射光路；第二透镜12选用焦距为20厘米的透镜，在第二透镜12后安置一小孔部件13，该小孔部件13用一块合金铝板经过表面煮黑，在合金铝板中间开有直径为1毫米小孔，在小孔部件13后安置一光电探测器14(美国Newport-Klinger公司生产的818-B8-40型硅光电二极管)，在光电探测器14的信号输出端分别与第一锁相放大器15和第二锁相放大器15′电连接，两台锁相放大器均采用Stanford Research Systems公司生产的SR830DSP型号的锁相放大器，两台锁相放大器分别与具有数据采集和控制的计算机系统16电连接，而组成反射光探测系统。x轴扫描台7和y轴扫描台9选用市场上购买的，其调节范围为0-7厘米的一维精密调节台；第一光栅尺8和第二光栅尺10为雷尼绍公司的SIGNUM^TMRELM高精度光栅尺，分别和x轴扫描台7和y轴扫描台9连接，并通过计算机系统16用光栅尺的信号控制x轴扫描台7和y轴扫描台9的扫描；x轴扫描台7和y轴扫描台9安置在一个三维调节架11上；选用有500多个核酸样品点的芯片做生物芯片6，生物芯片6安放在x轴扫描台7上。当测量时将生物芯片6安放在该x轴扫描台7上面，以便调节生物芯片6的水平；在小孔部件13反射光前方光路中插入第二透镜12，第二透镜12把从生物芯片反射的光束扩束，将从生物芯片6上表面和下表面的反射光束分开，仅探测从生物芯片6具有生物样品的一个表面的反射光，排除了生物芯片另一个没有生物样品表面反射光的干扰，提高了探测的灵敏度和信噪比；用光电探测器14检测小孔部件13选取的从生物样品的反射光，光电探测器14输出的信号同时输入第一锁相放大器15和第二锁相放大器15′，第一锁相放大器15和第二锁相放大器15′放大后的信号输入计算机系统16，分别检测反射光的基频和倍频信号；其中，第一光栅尺8和第二光栅尺10提供的位置移动信号，反馈给计算机控制系统，计算机控制系统根据第一光栅尺8和第二光栅尺10提供的位置移动信号，控制x轴扫描台7和y轴扫描台9的马达按照设定的扫描范围进行二维扫描。由于光栅尺提供的信号严格的与扫描台的位移一致，与扫描的速度和均匀性没有直接的关系，因而克服了一般扫描系统必须考虑扫描的加速、稳定等产生的影响，实现生物芯片6的二维快速扫描。

首先打开激光器1，从激光器输出的偏振光通过调制器2、普克盒3、分析器4和第一透镜5入射到生物芯片6的表面，生物芯片6表面的反射光通过第二透镜12的扩束，把从生物芯片上下表面的反射光分开，小孔部件13放在生物样品点表面反射的光束中间，光电探测器14探测从小孔13透过的反射光，从探测器出来的信号经过隔直流电路后，输入到两台锁相放大器，经过放大的信号由计算机采集，并进行数据和图像处理后，输出结果。在生物芯片扫描以前，先把入射的激光束调到没有生物样品点的表面，分别调节普克盒3和分析器4，使输出信号为“0”，以便提高灵敏度。然后用计算机系统16和两光栅尺分别控制x轴扫描台7和y轴扫描台9的扫描。并用计算机系统16进行数据和图像的采集与处理，输出检测结果。

见图2是在10分钟时间内，用光反射差法无标记高通量探测500多个核酸样品点生物芯片获得的基频信号扫描成像图。

见图3是在10分钟时间内，用光反射差法无标记高通量探测500多个核酸样品点生物芯片获得的倍频信号扫描成像图。

实施例2：

按实施例1实施，x轴扫描和实施例1一样，x轴扫描台7和光栅尺8与计算机系统16连接，计算机系统16通过光栅尺的信号控制x轴扫描台7的扫描；y轴扫描台9和步进马达与计算机系统16连接，y轴扫描台9直接通过计算机系统16控制步进马达进行y轴扫描。第二透镜12选用焦距为5厘米的透镜，

选用1000个蛋白质样品点的芯片作生物芯片6，其中选择雷尼绍公司的SIGNUM^TMRELM高精度光栅尺做第一光栅尺8控制x轴扫描台的扫描；y轴扫描台利用计算机控制的步进马达进行扫描；小孔部件13的小孔孔径选取直径为0.5毫米。检测蛋白质的杂交反应。

首先打开激光器1，激光器输出的偏振光通过调制器2、普克盒3、分析器4和第一透镜5入射到生物芯片6的表面，生物芯片6表面的反射光通过第二透镜12的扩束，把从生物芯片上下表面的反射光分开，小孔13放在生物样品点表面反射的光束中间，探测器14探测从小孔13透过的反射光，从探测器出来的信号经过隔直流电路后，输入到两台锁相放大器15，经过放大的信号由计算机采集，并进行数据和图像处理后，输出结果。在生物芯片扫描以前，先把入射的激光束调到没有生物样品点的表面，分别调节普克盒3和分析器4，使输出信号为“0”，以便提高灵敏度。然后用计算机16和光栅尺8控制x轴扫描台7的扫描，用计算机系统16控制y轴扫描台9的步进马达进行y轴扫描。并用计算机16进行数据和图像的采集与处理，输出检测结果。

实施例3：

按实施例1实施，y轴扫描和实施例1一样，y轴扫描台9和光栅尺10与计算机系统16连接，计算机系统16通过光栅尺10的信号控制y轴扫描台9的扫描；x轴扫描台7和步进马达与计算机系统16连接，x轴扫描台7直接通过计算机系统16控制x轴扫描台7的步进马达进行x轴扫描。第二透镜12选用焦距为50厘米的透镜，

具体检测方法同实施例1和2，选用1000个蛋白质样品点的芯片作生物芯片6，其中选择雷尼绍公司的SIGNUM^TMRELM高精度光栅尺做第一光栅尺8控制x轴扫描台的扫描；y轴扫描台利用计算机控制的步进马达进行扫描；小孔部件13的小孔孔径选取直径为0.5毫米。检测蛋白质的杂交反应。

利用精密光栅尺提供的信号严格与扫描台位移一致的特点，采用精密光栅尺控制生物芯片的二维快速扫描，实现了高通量的探测，克服了一般扫描系统由于加速度和不均匀性的影响，难以快速探测的缺点。采用透镜和小孔装置提高了探测的灵敏度和分辨率。该方法和装置不仅可高通量的探测生物芯片，而且具有高的灵敏度和分辨率。适用于检测蛋白质与蛋白质、蛋白与核酸、核酸与核酸等生物大分子相互作用的不同的生物样品和不同的生物芯片。