德氏乳杆菌的降低血胆固醇菌株

摘要

本发明涉及具有降低血胆固醇特性的德氏乳杆菌(Lactobacillus delbrueckii)新菌株，及其用于生产降低血胆固醇的发酵产品(尤其是乳产品)的用途。

说明书

本发明涉及具有降低血胆固醇特性的德氏乳杆菌(Lactobacillus delbrueckii)新菌株。

据报道，某些发酵乳产品可发挥降低血胆固醇的作用。这些作用尤其依赖于这些产品中属于某些给定物种的乳酸菌之特定菌株的存在。它们尤其是肠球菌(例如粪肠球菌(Enterococcus faecium，申请EP0101209)或蒙氏肠球菌(Enterococcus mundtii，PCT申请WO 2007/108583))菌株、双歧杆菌菌株(PCT申请WO 2007/029773)(Xiao等，J Dairy Sci，86，2452-61，2003)和乳杆菌菌株。

在乳杆菌中，仅在少数物种中鉴定出降低血胆固醇的菌株，如干酪乳杆菌(Lactobacillus casei)(Brashears等，J Dairy Sci，81，2103-10，1998；Kapila & Sinha，Indian J Med Sci，60，361-70，2006；Kawase等，J Dairy Sci，83，255-63，2000)、发酵乳杆菌(Laactobacillus fermentum)(Gilliland & Walker，J Dairy Sci，73，905-11，1990；Pereira等，Appl Environ Microbiol，69，4743-52，2003)，并且特别是嗜酸乳杆菌(Lactobacillus acidophilus)(Gilliland等，Appl Environ Microbiol，49，377-81，1985；Lin等，J Dairy Sci，72，2885-99，1989；Gilliland & Walker，J Dairy Sci，73，905-11，1990；Gupta等，Int J Food Microbiol，29，105-9，1996；Anderson & Gilliland，J Am Coll Nutr，18，43-50，1999)。

另一方面，乳杆菌的其它种，尤其是德氏乳杆菌至今都被认为缺乏降低血胆固醇的作用，所述德氏乳杆菌是在发酵乳产品生产中最广泛使用的物种之一，因为它和嗜热链球菌(Streptococcus thermophilus)一起构成传统的“酸乳共生”。

因此，已表明传统的酸乳(通过用德氏乳杆菌和嗜热链球菌发酵而获得)不具有通过用嗜酸乳杆菌和嗜热链球菌(Akalin等，J Dairy Sci，80，2721-5，1997)发酵所获得的乳产品以及用长双歧杆菌(Bifidobacterium longum)(Xiao等，J Dairy Sci，86，2452-61，2003)发酵所获得的乳产品的降低血胆固醇的作用。还报道，对无菌小鼠施用德氏乳杆菌诱导粪便胆固醇排泄的降低，但不改变血液或肝脏的胆固醇水平。当对载脂蛋白E缺陷的小鼠(ApoE敲除小鼠)施用德氏乳杆菌时，没有观察到对粪便、肝脏或血液胆固醇的作用(Portugal等，Braz J Med Biol Res，39，629-35，2006)。

本发明人现已分离出了德氏乳杆菌菌株，出乎意料的是，该菌株具有降低血胆固醇的特性。该菌株还具有在乳中生长的能力，并具有通常用于酸乳生产的德氏乳杆菌的增殖能力。因此，该菌株可以方便地用于发酵乳产品的生产，尤其是酸乳的生产。

因此，本发明提供了德氏乳杆菌乳酸亚种(Lactobacillus delbrueckii subspecies lactis)菌株，其于2007年4月6日以编号I-3741保藏于CNCM(Collection Nationale de Cultures de Microorganismes)[法国国家培养物和微生物保藏中心]，巴黎Docteur Roux大街25号。

该菌株的特性如下：

—形态学：革兰氏阳性微生物，大致为很小的长粒状杆菌。

—发酵如下的糖类(结果来自API 50 CH strip——API MRS培养基，37℃，48小时)：D-葡萄糖、D-果糖、D-甘露糖、N-乙酰葡萄糖胺、麦芽糖、乳糖、蔗糖、海藻糖。

本发明还提供了包含德氏乳杆菌乳酸亚种菌株CNCM I-3741以及一种或更多种其它乳酸菌菌株的乳酸发酵剂(ferment)。

特别地，所述其它菌株可属于如下物种：嗜酸乳杆菌、植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)、干酪乳杆菌干酪亚种(Lactobacillus casei subsp.casei)、干酪乳杆菌鼠李糖亚种(Lactobacillus casei subsp.rhamnosus)、玉米乳杆菌(Lactobacillus zeae)、唾液乳杆菌(Lactobacillus salivarius)、乳酸乳杆菌(Lactobacillus lactis)、瑞士乳杆菌(Lactobacillus helveticus)、干酪乳杆菌、副干酪乳杆菌(Lactobacillus paracasei)、乳脂乳杆菌(Lactobacillus cremoris)、鼠李糖乳杆菌(Lactobacillus rhamnosus)、戈氏乳杆菌(Lactobacillus gasseri)、德氏乳杆菌保加利亚亚种(Lactobacillus delbrueckii subsp.bulgaricus)、德氏乳杆菌乳酸亚种(Lactobacillus delbrueckii subsp.lactis)、德氏乳杆菌德氏亚种(Lactobacillus delbrueckii subsp.delbrueckii)、德氏乳杆菌保加利亚亚种(Lactobacillus delbrueckii subsp.bulgaricus)、罗伊氏乳杆菌(Lactobacillus reuteri)、噬淀粉乳杆菌(Lactobacillus amylovorus)、卷曲乳杆菌(Lactobacillus crispatus)、弯曲乳杆菌(Lactobacillus curvatus)、约氏乳杆菌(Lactobacillus johnsonii)、发酵乳杆菌、短乳杆菌(Lactobacillus brevis)、嗜热链球菌、乳酸乳球菌乳酸亚种(Lactococcus lactis subsp.Lactis)、乳酸链球菌乳脂亚种(Lactococcus lactis subsp.cremoris)、粪肠球菌、戊糖片球菌(Pediococcus pentosaceus)、乳酸片球菌(Pediococcus acidilactici)、长双歧杆菌(Bifidobacterium longum)、短双歧杆菌(Bifidobacterium breve)，双岐双岐杆菌(Bifidobacterium bifidum)、婴儿双歧杆菌(Bifidobacterium infantis)、乳酸双歧杆菌(Bifidobacterium lactis)、动物双歧杆菌(Bifdobacterium animalis)、动物双歧杆菌乳酸亚种(Bifidobacterium animalis sp.lactis)、婴儿双歧杆菌(Bifidobacterium infantis)、青春双歧杆菌(Bifidobacterium adolescentis)。

根据本发明乳酸发酵剂的一个优选的实施方案，将德氏乳杆菌乳酸亚种CNCM I-3741菌株与德氏乳杆菌保加利亚亚种的至少一种菌株和嗜热链球菌的至少一种菌株相组合。

本发明还提供了制备发酵产品的方法，该方法的特征是其包括将合适的基质与CNCM I-3714株或与包含所述菌株的本发明乳酸发酵剂一起发酵。根据该方法的一个优选的实施方案，用于发酵的所述基质是乳或基于乳的基质，或植物汁液(果汁和/或蔬菜汁)或这些基质的混合物。

本发明还提供了发酵产品，尤其是发酵乳产品，其包含CNCM I-3741菌株的细菌和任选地一种或更多种其它乳酸菌菌株的细菌。

根据本发明发酵产品的一个优选的实施方案，发酵后，其每毫升包含至少1×10⁶个CFU(集落形成单位)的CNCM I-3741菌株细菌，优选至少1×10⁷个CFU，更优选1×10⁷到1×10⁹个CFU。

本发明还涉及CNCM I-3741菌株或包含所述菌株的乳酸发酵剂或发酵产品用于获得诱导血胆固醇水平尤其是LDL胆固醇水平降低的产品的用途。

通过如下对举例说明CNCM I-3741菌株降低血胆固醇特性的实施例的进一步描述，对本发明的理解会更加清楚。但是需要清楚理解的是，这些实施例仅是通过举例说明本发明主题的方式给出，其决不对本发明的主题构成限制。

实施例1：CNCM I-3741菌株的体内降低血胆固醇作用

在载脂蛋白E缺陷(apoE敲除)小鼠体内评价了摄取CNCM I-3741菌株(以下也称为DN 111 244)和作为阳性对照的嗜酸乳杆菌I-2273菌株(在专利EP1251860中描述，以下也称为DN 112 001)的作用。I-2273菌株是在体外具有降低血胆固醇活性的菌株，但由于其在乳中的生长很差而不易于获得发酵乳产品。

实验方案如下：

将9-10周龄的40只apoE敲除小鼠分成4组，每组10只。这些小鼠由L′Arbresle(法国)的Charles River实验室提供。

将所有小鼠通过管饲法补充28天的富脂饮食：

—300μl/天的培养物，包含在乳-MRS培养基的培养条件下获取的6×10⁸个CFU的DN 111 244菌株(第1组)；

—300μl/天的培养物，包含采用与上述DN 111 244菌株相同的乳-MRS培养基的培养条件下获取的6×10⁸个CFU的DN 112 001菌株(第2组)；

—300μl/天的对照乳，其组成如下：脱脂乳(对照组)。

DN 112 001和DN 111 244(CNCM I-3741)菌株均以MRS培养基培养。然后将其用乳重悬以获取含6×10⁸个细菌CFU的乳。

三组动物每天的摄入量相同。在实验开始时对动物进行称重，在之后的治疗过程中以5天为间隔进行称重。各组之间未观察到显著差异。

在实验开始时和治疗28天后测定血浆总胆固醇水平和LDL胆固醇水平。

血浆脂质测定

结果参见图1和2。

这些结果表明，经过28天的处理，第1组和第2组的动物与对照组的动物相比，总胆固醇和LDL胆固醇(“不良”胆固醇)降低。

实施例2.：CNCM I-3741菌株的乳生长

采用如下方案来检测CNCM I-3741菌株的乳生长特性：

在重构的脱脂乳(120g脱脂乳粉溶于1L蒸馏水，补充2g/L的酵母提取物)制成的培养基中接种CNCM I-3741菌株或与之对比的德氏乳杆菌保加利亚亚种CNCM I-1519菌株(描述于申请EP 0858501中，其具有常规发酵特性)。

通过持续地控制生长培养基的pH测定菌株的与其生长相关的发酵活性。

结果参见图3。

这些结果表明，CNCM I-3741菌株能够在乳中有效地生长，因而，该菌株可用于生产发酵乳产品。