用玉米秸秆纤维作载体制备固定化酵母细胞并用于餐厨废弃物发酵生产燃料乙醇的方法

摘要

本发明公开了一种利用玉米秸秆纤维作为载体制备固定化酵母细胞并用于餐厨废弃物发酵生产燃料乙醇的方法，是将玉米秸秆经过纤维素酶修饰后作为载体制备固定化酵母细胞，并通过对餐厨废弃物中的生物质废弃物进行酶解，离心分离，调节糖度和pH值，然后接种固定化酵母细胞进行厌氧发酵，蒸馏提纯得出工业乙醇。本发明采用的固定化细胞方法具有操作方便、成本低、发酵过程中传质效率高及可实现重复分批发酵和连续发酵等特点；此外本发明采用餐厨废弃物为原料生产燃料乙醇还具有原料便宜、投资少、成本低等特点，且实现了餐厨废弃物的无害化、减量化和资源化。

说明书

技术领域

本发明涉及生物工程领域细胞固定化和液态发酵的应用技术，具体涉及到一种经纤维素酶修饰后的玉米秸秆作为载体制备固定化细胞，并用该固定化细胞发酵餐厨废弃物生产燃料乙醇的方法。

背景技术

餐厨废弃物是指家庭、学校、机关、公共食堂以及餐饮行业的食物废料和餐饮剩余物，是城市生活垃圾的重要组成部分。我国厨厨废弃物产生量十分巨大，且随着城市规模的迅速扩大、城市人口的增多和人民生活水平的提高，餐厨废弃物的产生量有越来越多的趋势。尽管餐厨废弃物的组成、性质和产生量因社会经济条件、地区差异、居民生活习惯、饮食结构、季节变化的不同而有所差异，但从化学组成上，餐厨废弃物中含有淀粉、纤维素、蛋白质、脂类和无机盐。其主要特点有：①淀粉、纤维素、蛋白质等有机物含量较高，开发利用价值较大，但有可能为各种病源微生物及各种携带病源微生物的蝇虫提供良好的生长繁殖环境，导致疾病的传播并产生恶臭；②含水率高，不便收集运输，热值低，处理不当容易产生渗沥液等二次污染物；③脂类和盐类物质含量较其它垃圾高，对资源化产品品质影响较大，需要妥善处理。因此，餐厨废弃物具有典型的“废物和资源”双重属性，如果不能合理利用或处置，则是一种对环境和人体健康等有巨大潜在危险的废物，但是如果能够合理处置和利用，它又是一种具有较高使用价值的资源。

过去很长时间内，由于无序回收和管理缺失，不少餐厨垃圾被作为饲料直接喂养生猪。生猪一旦食用了未经处理或处理不当的餐厨废弃物，就极易引起疾病，一些病原体、有毒物质将会积蓄在猪的体内。除此之外，为了减少猪的发病率，养殖户还会加大对病猪的用药剂量，造成大量抗生素类药物在猪体内的残留。再者，这种方式很容易将人群中的疫病通过餐厨废弃物传染给畜禽，而且还可能通过禽畜体内毒素、有害物质积累的食物链再给人体健康带来危害，由此造成人畜 之间疫病的交叉感染。目前，国内许多大城市相继做出了“禁止用餐厨废弃物喂猪”规定。

随着国际原油价格的不断攀升，生物质能源的研究越来越受到人们的重视.在众多的生物质能源中，燃料酒精由于其生产工艺简单，可生产乙醇汽油，向环境净排放的温室气体为零等优点，得到了美国、巴西等国家的青睐，，我国也在“十一五”规划中提出了大力发展燃料酒精的目标。当前我国的酒精生产主要以玉米、稻谷、小麦等粮食作物为原料，从资源有效利用和降低生产成本方面考虑，利用含丰富淀粉及纤维素类的废弃物作为原料无疑更具有优势。利用餐厨废弃物进行生物燃料的生产，具有资源二次利用和降低成本的双重优势，并能改变餐厨废弃物生产畜禽饲料或饲料添加剂的传统路线，避免餐厨废弃物再次进入食物链，从根本上解决地沟油、泔水猪对食品安全的潜在威胁。中国专利CN101255447A报道了一种将餐厨垃圾进行打浆，蒸汽、微波协同灭菌处理，接种经选育过的酒精高产酵母生产乙醇。但是该发明没有添加任何水解酶类，很难将餐厨垃圾中的各种营养物质充分利用。中国专利CN101139577A报道了利用酒槽混合液发酵产糖化酶及利用此糖化酶发酵餐厨垃圾生产乙醇的方法。该法首先将酒槽槽液和固态酒槽的混合物进行高温灭菌，然后接入黑曲霉摇瓶发酵，得到的发酵液为糖化酶液。再向粉碎后的餐厨垃圾中加入适量糖化酶液进行酶解反应，酶解结束后，接入酒精酵母发酵生产乙醇。然而该发明采用的糖化酶液是黑曲霉的直接发酵液，糖化酶液中含有较多的黑曲霉孢子，孢子易对餐厨垃圾水解后的固、液相产生污染，另外，孢子萌发后会对乙醇发酵产生不利因素。

细胞固定化技术，是利用物理或化学手段将游离细胞定位于限定的空间区域并使其保持活性和可以反复使用的一种基础技术。同传统的游离细胞发酵相比，细胞固定化可以提高次生物质的合成和积累，能长时间保持细胞活力，可以反复利用，抗剪切能力强，简化工艺设备，成本低，优化了工艺流程。固定化酵母细胞的常用载体是海藻酸钠和聚乙烯醇。其中海藻酸钠因具有制备方法简单、条件温和、无毒、不被绝大多数微生物分解、成本低廉等优点成为广泛使用的载体材料。但海藻酸钙凝胶在含较多的柠檬酸盐、EDTA、Ca²⁺、K⁺、Na⁺溶液中不稳定，钙离子易脱落导致凝胶变软并逐渐溶解。由于餐厨废弃物成分复杂，尤其含有较高浓度的Na⁺，选用海藻酸钠不适宜。聚乙烯醇微粒的机械强度高，但是其聚合 物网络的形成条件比较剧烈，对微生物细胞的损害很大，也限制了它的应用。近年来，天然生物质类纤维材料受到国外研究人员的关注，天然纤维材料因具有机械强度高、分批发酵批次高、无毒、通透性好及纤维组织中的空隙适于细胞生长繁殖的优点，而具有很强的研究价值。国外相继报道了利用天然纤维素类物质如甘蔗茎、制糖后的甘蔗残渣等作为酵母细胞固定化材料(Chandel AK et al..>

发明内容

本发明是为了解决餐厨废弃物难以合理、有效的处置以及现有的制备燃料乙醇方法成本高的问题。从而提出一种利用玉米秸秆作为载体制备固定化细胞，并用该固定化细胞发酵餐厨废弃物生产燃料乙醇的方法。

为了实现上述目的本发明采用如下技术方案：

利用玉米秸秆纤维作为载体制备固定化酵母细胞并用于餐厨废弃物发酵生产燃料乙醇的方法，包括以下步骤：

(1)将干玉米秸秆去皮、切成小块，称取一定量秸秆小块转入pH＝4.8，0.05M磷酸盐缓冲液中，再加入纤维素酶在40℃条件下进行酶解反应，纤维素酶用量是5-50FPU/g秸秆，酶解时间为0.5-6h，反应结束后，用自来水冲洗，直至pH呈中性；

(2)载体干燥：将上述制备好的玉米秸秆载体在50℃条件下干燥至恒重，待用；

(3)细胞预培养：将酵母菌接入装有YPD培养基的发酵罐中，30℃，150rpm条件下培养24h，再在4℃，8000rpm条件下离心得到菌体，最后重悬于生理盐水制成1×10⁹cells/mL酵母细胞浓缩液，待用；

(4)固定化细胞制备：向上述每升细胞悬浮液中浸入1-1000g干燥后载体，30℃、100rpm条件下培养24h，再过滤、除去游离细胞，待用；

(5)对餐厨废弃物进行分拣，将其中的非生物质废弃物挑选出来进行分类回收；

(6)经过分拣后的餐厨废弃物按照1∶0.5-2的比例与水混合，然后加入α-淀粉酶和糖化酶酶解，温度保持在40-80℃，时间为1-8h；每克生物质废弃物添加α-淀粉酶1-50u、糖化酶1-200u；

(7)分拣后的餐厨废弃物经过酶解后再经过离心，得到酶解液，酶解液用于乙醇发酵，固形物残渣送入沼气池中；

(8)检测酶解液的糖度和pH值，并对这两个参数进行调整，调整后的糖度为18-22％，pH值为4-7；

(9)然后酶解液接种工业酒精酵母进行厌氧发酵，接种量为1％-10％(w/v)，发酵温度30-34℃，最后制得含有8％-11％乙醇发酵液；

(10)乙醇提纯，将乙醇发酵液进行蒸馏提纯，获得燃料乙醇产品。

所述的利用玉米秸秆纤维作为载体制备固定化酵母细胞并用于餐厨废弃物发酵生产燃料乙醇的方法，所述的糖度调整选用添加葡萄糖、真空浓缩及膜浓缩方法的其中一种或几种的结合。

本发明的有益效果：

本发明采用的固定化细胞方法具有操作方便、成本低、发酵过程中传质效率高及可实现重复分批发酵和连续发酵等特点；此外本发明采用餐厨废弃物为原料生产燃料乙醇还具有原料便宜、投资少、成本低等特点，且实现了餐厨废弃物的无害化、减量化和资源化。

附图说明

图1本发明的工艺流程示意图。

图2扫描电镜下拍摄的经纤维素酶修饰后的玉米秸秆纤维(酶解时间：4h)。

具体实施方式

实施例：一种利用玉米秸秆纤维作为载体制备固定化酵母细胞并用于餐厨废弃物发酵生产燃料乙醇的方法，包括以下步骤：

(1)将干玉米秸秆去皮、切成小块，各小块尺寸约2cm×2cm，称取秸秆小块500g转入装有1.5L 0.05M磷酸盐缓冲液(pH4.8)的5L发酵罐中，再加入纤维素酶在40℃条件下进行酶解反应，纤维素酶用量是50FPU/g秸秆，酶解时间为4h。反应结束后，用自来水冲洗，直至pH呈中性；图2B为扫描电镜所拍摄的经纤维素酶修饰后的玉米秸秆纤维图片。

(2)载体干燥：将上述制备好的玉米秸秆载体在50℃条件下干燥至恒重，待用；

(3)细胞预培养：将酵母菌接入装有2L YPD培养基的5L发酵罐中，30℃，150rpm条件下培养48h。再在4℃，8000rpm条件下离心得到菌体，最后重悬于生理盐水制成酵母细胞浓缩液(约1×10⁹cells/mL)，待用；

(4)固定化细胞制备：将100g干燥后载体浸入0.5L上述细胞悬浮液中，30℃、100rpm条件下培养24h，再过滤、除去游离细胞，待用；

(5)对餐厨废弃物进行分拣，将其中的非生物质废弃物挑选出来进行分类回收；

(6)经过分拣后的餐厨废弃物按照1∶0.5的比例与水混合，然后加入α-淀粉酶和糖化酶酶解，温度保持在55℃，时间为2h；

每克生物质废弃物添加α-淀粉酶50u、糖化酶140u；

(7)分拣后的餐厨废弃物经过酶解后再经过离心，酶解液用于乙醇发酵，固形物残渣送入沼气池中；

(8)检测酶解液的糖度和pH值，并对这两个参数进行调整，调整后的糖度为20％，pH值为4.5；其中糖度调整采用真空浓缩的方法；

(9)然后酶解液接种工业酒精酵母进行重复分批发酵，接种量为2％(w/v)，发酵温度30℃，最后制得含9.91％乙醇发酵液。

(10)乙醇提纯，9.91％乙醇发酵液蒸馏提纯，获得工业乙醇产品。