一种重楼属植物细胞的Giemsa-C带染色方法

摘要

本发明属于细胞生物学技术领域，具体为一种重楼属植物细胞的Giemsa-C带染色方法，包括以下步骤：(1)材料的准备 取生长旺盛的重楼植物白色幼嫩根尖，置于冰水混合物中预处理，卡诺Ⅰ固定备用；(2)制片 将备好的根尖用盐酸解离，然后用醋酸压片，液氮揭片，无水乙醇脱水，置室内自然干燥；(3)变性 盐酸预变性，氢氧化钡变性；(4)复性 2×SSC复性；(5)染色 Giemsa染液染色；(6)光学显微镜镜检。本发明采用的重楼属植物Giemsa-C带染色方法制片污染低，带型分辨率高，带型稳定且简单易于操作。

说明书

技术领域

本发明属于细胞生物学技术领域，具体为一种重楼属植物细胞的Giemsa-C带染色方法。

背景技术

重楼属（Paris）为黑药花科（Melanthiaceae）重楼组（Parideae），该属植物为我国传统中药材，具有清热解毒、消肿止痛、凉肝定惊功效，用于治疗痈疮、咽喉肿痛、毒蛇咬伤、跌打伤痛、惊风抽搐等症。近年来被广泛用于中成药和新药的制作。随着药物工业化生产的发展，该属植物需求量大，但其药用部位生长周期长，自然繁殖率低，生长缓慢，导致民间滥挖严重，野生资源面临枯竭，尤其是有些还未深入研究的种濒临灭绝。因此，对重楼属植物资源可持续利用和种质资源多样性保护研究迫在眉睫。

重楼属植物在全世界有24种，中国分布的有22种。种间形态差异小，不同居群在某些形态性状上存在较大变异，且不同居群间形态性状的进化速度常不同步，故很难对该属进行系统研究和属下分类单位进行鉴别，不利于该属种质资源多样性保护和资源可持续利用研究。

Giemsa-C带主要显示染色体上由重复DNA序列组成的异染色质，由于C带带型在同一物种内具有相对稳定性，而在种间具有丰富的多态性，因而可以作为物种鉴别的一种技术手段。

Giemsa-C带染色方法原理是，染色体经比较温和的碱或酸变性处理后，DNA双链解开，再在盐溶液中温育复性。复性时具有重复DNA序列组成的异染色质较常染色质复性速度快，可以优先与Giemsa染料结合，染色较深，而常染色质则着色较浅，从而在整条染色体上形成深浅不一的带纹。Giemsa-C带染色方法主要显示着丝粒、端粒、核仁组成区域或染色体臂上某些部位的重复DNA序列组成的异染色质，该法广泛用于动物细胞分析。近年来，该方法在植物细胞分析方面得到了较大的发展。目前常用的方法为HSG(Hydrochloride-Saline-Giemsa)、BSG（Barium-Saline-Giemsa）和HBSG（Hydrochloride-Barium-Saline-

Giemsa）。HSG法是采用盐酸变性，盐复性，Giemsa染液染色；BSG法是采用氢氧化钡变性，盐复性，Giemsa染液染色；HBSG法是采用盐酸预变性再用氢氧化钡变性，盐复性，Giemsa染液染色。HSG法盐酸变性处理时间和温度不便掌握，易导致染色浅或无带。BSG法由于氢氧化钡和空气中二氧化碳易生成碳酸钡沉淀使载片污染。HBSG法是HSG和BSG的改良方法，常用于禾本科等中小型染色体的植物。

重楼属植物染色体为大型染色体，其染色体较长。经过对现有大型染色体Giemsa-C带染色方法检索发现，张洪达等采用HSG法对洋葱染色体C带显带重复性和成功率进行了研究，其预处理药品为秋水仙素，易使科研人员受药品伤害；去壁低渗法制片，带纹影响因素较多；盐酸处理温度和时间不便于掌握，易使显带不充分，带纹模糊[河北大学学报，第10卷，第3期，65—69页（1990）]。梁顺祥和许永财采用BSG法对蚕豆Giemsa-C带进行了分析，该方法预处理药物同样为秋水仙素。实验操作过程中氢氧化钡和空气中二氧化碳反应生成的碳酸钡沉淀易附着于染色体上使分析困难[青海农林科技，第1期，62—64页（1995）]。胡凤荣等采用改良HBSG法对药百合根尖进行了Giemsa-C带分析，实验操作过程中盐酸处理温度和时间不易控制，使带纹模糊；碳酸钡沉淀易附着于染色体上，使分析困难；磷酸缓冲液pH易发生改变，造成染色颜色不稳定[南京林业大学学报，第33卷，第3期，17—19页（2009）]。

采用以上针对大型染色体的Giemsa-C带染色方法，对重楼属植物Giemsa-C带进行研究发现，易出现染色体缠绕、带纹模糊、制片污染严重等问题。因此，需要一种操作简便、染色体分散、带纹清晰、制片洁净的Giemsa-C带染色方法，以满足重楼属植物种质资源鉴定和杂交育种早期鉴定研究快速发展。

本发明采用的一种重楼属植物细胞的Giemsa-C带染色方法，是在大型染色体植物Giemsa-C带常用的几种染色方法的基础上，通过改变反应条件，如预处理方式、制片方法、空气干燥时间、变性时间和方式、复性时间和方式以及染液浓度和染色时间等达到染色体分散良好，C带带纹丰富清晰。建立了适宜于重楼属植物的Giemsa-C带染色方法，为重楼属植物进行种质资源鉴定和杂交育种早期鉴定提供有效的分析方法。

发明内容

本发明的具体技术方案如下：

一种重楼属植物细胞的Giemsa-C带染色方法包括以下步骤：

（1） 材料的准备  取生长旺盛的重楼植物白色幼嫩根尖，置于冰水混合物中预处理36—48h，卡诺Ⅰ（冰醋酸：酒精= 3：1）固定6—12h，转移至70%酒精中，然后在4℃冰箱中保存备用；

（2） 制片  将备好的重楼植物幼嫩根尖用盐酸解离后，用蒸馏水洗净，用45%的醋酸压片，液氮揭片（把制片置于液氮内冷冻一分钟，用刀片把盖玻片揭去），无水乙醇脱水12h，置室内自然干燥2—3d；

（3）变性  将步骤2中的制片，放入在染缸中已预热好的60℃的0.2 molL^-1盐酸中处理155s，再用蒸馏水洗净；然后用氢氧化钡饱和溶液处理9—12min后，用预热的蒸馏水置换洗至澄清，再用稀盐酸冲洗两次，除去残留的碳酸钡沉淀后，用蒸馏水洗净，洗净后将制片转另一干净染缸；

（4）复性  将步骤3中的制片，用2×SSC洗一次，然后加入2×SSC，放入预热至30℃的水浴锅内，缓慢升温至60℃开始计时1—1.5h；

（5）染色  将步骤4中的制片，用pH为6.8的磷酸缓冲液冲洗两次，然后置于Giemsa染液中，在37—38℃恒温箱内染色1.5—2.0h；

（6）镜检  在光学显微镜下观察，选取染色体分散良好，带纹清晰均匀的细胞拍照分析，得出结果，或用Eupara胶在盖片四周进行固封，制成半永久封片后观察，分析后得出结果。

作为优选，在步骤1中，所取生长旺盛的重楼植物上白色幼嫩根尖的长度为0.5—1.5cm，于10:00—11:30时或15:00—16:00时选取最佳。

作为优选，在步骤2中，采用浓度为0.2 molL^-1盐酸在室温（22—24 ℃）下解离1.0—1.5h；采用体积浓度为45%的醋酸压片。

在步骤3中，先称取过量氢氧化钡加热溶解，冷却后过滤，制得氢氧化钡饱和溶液；置换清洗用的预热蒸馏水温度为38℃；冲洗的稀盐酸的浓度为0.05 molL^-1盐酸。

在步骤5中，Giemsa染液的配比为Giemsa母液：磷酸缓冲液=1：9。

Giemsa色素粉剂（KH₂PO₄、Na₂HPO4·12H₂O、Ba(OH)₂、NaCl、HCl、冰乙

酸、甲醇、甘油、去离子水）购自上海楷洋生物技术有限公司。

本发明的积极效果体现在：提供一种制片污染低，带型分辨率高，带型稳定且简单易于操作的重楼属植物Giemsa-C带染色方法。

附图说明

图1为本发明中的实施例1的镜检效果图。

图2为本发明中的实施例2的镜检效果图。

图3为本发明中的实施例3的镜检效果图。

具体实施方式

为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，下面结合具体实施方式对本发明作进一步的详细描述，但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于下述实施例。

实施例1：

于10：30时，取花叶重楼植株白色新根，冰水混合物中处理48h；用卡诺Ⅰ固定6h，转移至浓度为70%酒精中，然后在4℃冰箱中保存备用；将备好的的根尖用0.2 molL^-1盐酸22℃温度下解离1h，蒸馏水洗净后用体积浓度为45%的醋酸压片，液氮揭片；在无水乙醇脱水12h，置室内自然干燥2d；在预热至60℃的0.2 molL^-1盐酸中处理155s，用蒸馏水洗净；然后在氢氧化钡饱和溶液处理10min，用预热的38℃蒸馏水置换洗至澄清，再用0.05 molL^-1盐酸冲洗两次，除去残留的碳酸钡沉淀，用蒸馏水洗净盐酸；洗净后将制片转至另一干净染缸，加入2×SSC，放入预热至30℃的水浴锅内缓慢升温至60℃开始计时60min；用pH为6.8的磷酸缓冲液冲洗制片两次，置于配比为Giemsa母液：磷酸缓冲液=1：9的Giemsa染液中，在37℃恒温箱内染色2.0h。

镜检效果：在放大1000倍（10倍目镜×100倍物镜）的情况下，有超过75%的根尖细胞分散良好，染色体带纹清晰均匀。

实施例2：

于11：30时，取华重楼植株白色新根，冰水混合物中处理36h；卡诺Ⅰ固定12h，转移至70%酒精，在4℃冰箱中保存备用；将备好的根尖用0.2 molL^-1盐酸23℃温度下解离1.5h，蒸馏水洗净后用体积浓度为45%的醋酸压片，液氮揭片；无水乙醇脱水12h，置室内自然干燥3d；在预热至60℃的0.2 molL^-1盐酸中处理155s，蒸馏水洗净；然后在氢氧化钡饱和溶液处理9min，用预热的38℃蒸馏水置换清洗至澄清，再用0.05 molL^-1盐酸冲洗两次，除去残留的碳酸钡沉淀，用蒸馏水洗净盐酸；洗净后将制片转至另一干净染缸，加入2×SSC，放入预热至30℃的水浴锅内缓慢升温至60℃开始计时60min；用pH为6.8的磷酸缓冲液冲洗制片两次，置于配比为Giemsa母液：磷酸缓冲液=1：9的Giemsa染液中，在37℃恒温箱内染色1.5h。

镜检效果：在放大1000倍（10倍目镜×100倍物镜）的情况下，有超过70%的根尖细胞分散良好，染色体带纹清晰均匀。

实施例3：

于15:30时，取白花重楼植株白色新根，冰水混合物中处理48h；卡诺Ⅰ固定6h，转移至70%酒精，在4℃冰箱中保存备用；将备好的的根尖用0.2 molL^-1盐酸24℃温度下解离1h，蒸馏水洗净后用体积浓度为45%的醋酸压片，液氮揭片；无水乙醇脱水12h，置室内自然干燥2d；在预热至60℃的0.2 molL^-1盐酸中处理155s，蒸馏水洗净；然后在氢氧化钡饱和溶液处理10min，预热的38℃蒸馏水置换清洗至澄清，再用0.05 molL^-1盐酸冲洗两次，除去残留的碳酸钡沉淀，再用蒸馏水洗净盐酸；洗净后将制片转至另一干净染缸。加入2×SSC，放入预热至30℃的水浴锅内缓慢升温至60℃开始计时90min；用pH为6.8的磷酸缓冲液冲洗制片两次，置于配比为Giemsa母液：磷酸缓冲液=1：9的Giemsa染液中，37℃恒温箱内染色2.0h。

镜检效果：在放大1000倍（10倍目镜×100倍物镜）的情况下，有超过85%的根尖细胞分散良好，染色体带纹清晰均匀。