一种CD133高表达鼠肝肿瘤细胞系及制备方法

摘要

本发明提供了一种高表达CD133的鼠肝肿瘤细胞系及其制备方法，通过在p53-/-小鼠胚胎肝细胞中导入癌基因Hras后，利用单克隆打板技术得到源于CD133+细胞的单细胞克隆群，最后筛选建立含高比率CD133+细胞亚群的鼠肝肿瘤细胞系。该细胞系LPC-H12表达各肝干细胞相关基因以及干细胞Marker：CD133、EpCAM，具有高体外成球能力及体内致瘤能力。这一鼠肝肿瘤细胞系为研究CD133+肝癌干细胞亚群在肝癌发生及发展过程中的作用和机理以及针对肝肿瘤干细胞的药物的筛选提供有力工具。

说明书

技术领域

本发明涉及一种肿瘤细胞治疗领域，具体涉及一种高表达CD133的鼠肝肿瘤细胞系及其制备方法。

背景技术

近年来，越来越多的研究表明，在肿瘤细胞中存在一部分占极少比例的干细胞群，被称为肿瘤干细胞(cancer stem cells，CSCs)，这群细胞在肿瘤治疗抗性、复发和恶性转移中起关键作用。肿瘤干细胞具有与普通干细胞相似的无限增殖、自我更新等能力；表达干细胞的标志，如：CD133、EpCAM、CD44、CD90、CD24、CXCR4、ALDH1等；表达调节干性相关因子，如：Notch、Bmi1、Oct4、Nanog等。肿瘤干细胞虽然数量稀少，但是却具有高致瘤性并维持肿瘤生长与转移。原代分离的肿瘤细胞中，仅表达干细胞标志的少数细胞能够启动肿瘤的发生、发展。因此，靶向清除CSCs应该是今后有效治疗肿瘤的最佳策略。为此，需要一个较好的研究CSCs的工具，以研究肿瘤发生及发展的机理并开发靶向CSCs的药物。

肝癌是目前人类比较常见的肿瘤之一，其发病率在全世界范围内排第六位，而其死亡率则排在第三位。我国是肝癌的高发区，而且近年其发病率呈上升趋势。因此建立可靠有效的研究肝癌发生及发展的机制、开发有效靶向肝癌干细胞的治疗药物的肝癌研究工具成为当前急需解决的问题。目前，肝癌模型的建立主要有化学药物诱导、基因改造以及小鼠体内接种肝癌细胞等方法。化学药物诱导形成肝肿瘤的方法存在实验周期长、个体差异性大以及相关基因不明晰等问题；特定基因改造后的小鼠也可产生肝癌，虽然这种模型的分子机制明确，但是存在建立或引进动物品系困难以及实验周期长等缺点；在小鼠体内接种肝癌细胞是一种操作简单易行的方法，但是缺少细胞发生转化继而形成肿瘤的完整癌变过程。Zender L等人通过在胚胎肝前体细胞中导入癌基因信号使其可形成肝癌，这种动物模型具有相对完整的细胞转化及肿瘤形成的过程、且实验周期短等特点，有利于对肝癌相关基因或信号通路的研究。但是这种导入癌基因 信号的胚胎肝前体细胞中所含表达干细胞标志物CD133的肿瘤干细胞数量稀少，对于有效研究CSCs在肝癌发生及发展过程中的作用存在较大的局限性。纵观国内外，目前缺少良好的研究肝癌干细胞在肝癌发生及发展过程中的作用的实验平台。

发明内容

本发明所要解决的技术问题之一是针对目前肿瘤细胞系中表达干细胞标志物CD133的肿瘤干细胞数量稀少的问题，提供一种高表达CD133的鼠肝肿瘤细胞系LPC-H12，该肿瘤细胞系已于2010年12月8日保藏于中国典型培养物保藏中心(简称CCTCC)，保藏号为CCTCC No.C2010115，生物材料样品名称：小鼠肝肿瘤细胞LPC-H12，保藏单位地址：中国.武汉.武汉大学。

本发明所要解决的技术问题之二是提供一种高表达CD133的鼠肝肿瘤细胞系的制备方法

作为本发明所要解决的技术问题之一，一种高表达CD133的鼠肝肿瘤细胞系LPC-H12可以通过以下技术方案来实现：

在p53-/-小鼠胚胎肝细胞中导入癌基因Hras后，通过单克隆打板技术得到源于CD133+细胞的单细胞克隆群，最后通过筛选建立含高比率CD133+细胞亚群的鼠肝肿瘤细胞系。

具体技术方案如下：

建立CD133高表达的鼠肝肿瘤细胞系：

a)分离p53-/-小鼠胚胎肝细胞(LPC细胞)：取E13.5d的p53-/-小鼠胚胎，在PBS中漂洗2-3次；用无菌眼科剪及镊子完整剪取其肝脏。将其剪碎后，加入肝脏消化液于37℃消化30min成单细胞悬液。离心去上清，用PBS洗2-3次，将细胞与大鼠抗小鼠E-cadherin单抗一起4℃孵育30min(所用抗体量为4ug E-cadherin/1×10⁷个细胞)。用PBS洗2-3次，离心去上清，将细胞与羊抗大鼠的磁珠(20ul/l×10⁸细胞)一起4℃孵育15min。最后采用磁珠分选系统(MACS)分离出E-cadherin+胚胎肝细胞。分离出的细胞接种于预先铺有明胶的细胞培养皿中，采用含10％胎牛血清、0.01M尼古丁、10^-7mol/L地塞米松、1×ITS、1×巯基乙醇、40ng/ml的HGF、20ng/ml的EGF、100U/ml青霉素、100ug/ml链霉素的DMEM/F12培养液，于37℃、5％二氧化碳/95％空气的恒温培养箱中进行培养。

b)MSCV-IRES-GFP-Hras(MIG-Hras)逆转录病毒的制备：按照invitrogen公司lipofectAMINE^TM2000 Reagent说明书提供的参考方法进行操作，将MIG-Hras质粒转染包装细胞Ecotropic中，培养48及72h后分别收集病毒上清。

c)LPC-H鼠肝肿瘤细胞系的建立：感染LPC细胞前一天，将LPC细胞接种于预先铺有明胶的24孔板中(5×10³个细胞/孔)。感染时去培养液，加入b)中的病毒上清，每隔8h更换一次病毒上清，持续感染24h。去病毒，加入新鲜细胞培养液，隔天换液，每三天传代一次。收集1×10⁵～1×10⁷的细胞通过流式分选带GFP荧光的细胞，于新鲜细胞培养液中扩大培养。

d)含高比率CD133+细胞亚群并具有高致瘤性的鼠肝肿瘤细胞系的建立：将LPC-H鼠肝肿瘤细胞系培养至对数生长期，用0.25％胰酶+0.1％EDTA消化后，PBS洗涤两次，取1×10⁵～1×10⁷的细胞放入流式管中，离心去上清，加入100μl的10％山羊血清悬浮细胞，4℃封闭10min。随后加入带PE荧光的小鼠CD133抗体(0.5mg/ml)2.5ul，4℃孵育30min。用FACS缓冲液(PBS+0.5％BSA)洗涤两次，弃上清，加入1ml细胞培养液，通过流式分选仪将单个带GFP荧光、CD133+的LPC-H细胞打入加有新鲜细胞培养液的96孔板中。于37℃、5％二氧化碳/95％空气的恒温培养箱中进行培养。7-14d后，待各单个细胞扩增起来后，移入24孔板中继续培养。待细胞生长至生长对数期，各单克隆取一部分细胞进行CD133表达的检测，筛选得到高表达肿瘤干细胞标志物CD133的鼠肝肿瘤细胞系LPC-H12。

通过BD流式分析仪进行检测，本发明所述的CD133高表达的鼠肝肿瘤细胞系LPC-H12对干细胞标志物CD133及EpCAM的表达量均高于初始LPC-H细胞系。

通过RT-PCR方法证实，本发明所述的CD133高表达的鼠肝肿瘤细胞系LPC-H12表达多种干细胞相关基因，诸如Alb、AFP、CK19、Bmi1、ALDH1a1、SOX1、Nanog、Notch1。

通过体外球体形成实验，本发明所述的CD133高表达的鼠肝肿瘤细胞系LPC-H12具有高体外成球能力。

通过测量对比本发明与LPC-H，本发明LPC-H12细胞成瘤率为100％，肿 瘤生长速度明显高于LPC-H。

作为本发明所要解决的技术问题之二，一种高表达CD133的鼠肝肿瘤细胞系的制备方法具体步骤如下：

a)分离p53-/-小鼠胚胎肝细胞(LPC细胞)：取E13.5d的p53-/-小鼠胚胎，在PBS中漂洗2-3次；用无菌眼科剪及镊子完整剪取其肝脏。将其剪碎后，加入肝脏消化液于37℃消化30min成单细胞悬液。离心去上清，用PBS洗2-3次，将细胞与大鼠抗小鼠E-cadherin单抗一起4℃孵育30min(所用抗体量为4ug E-cadherin/1×10⁷个细胞)。用PBS洗2-3次，离心去上清，将细胞与羊抗大鼠的磁珠(20ul/l×10⁸细胞)一起4℃孵育15min。最后采用磁珠分选系统(MACS)分离出E-cadherin+胚胎肝细胞。分离出的细胞接种于预先铺有明胶的细胞培养皿中，采用含10％胎牛血清、0.01M尼古丁、10^-7mol/L地塞米松、1×ITS、1×巯基乙醇、40ng/ml的HGF、20ng/ml的EGF、100U/ml青霉素、100ug/ml链霉素的DMEM/F12培养液，于37℃、5％二氧化碳/95％空气的恒温培养箱中进行培养。

b)MSCV-IRES-GFP-Hras(MIG-Hras)逆转录病毒的制备：按照invitrogen公司lipofectAMINE^TM2000 Reagent说明书提供的参考方法进行操作，将MIG-Hras质粒转染包装细胞Ecotropic中，培养48及72h后分别收集病毒上清。

c)LPC-H鼠肝肿瘤细胞系的建立：感染LPC细胞前一天，将LPC细胞接种于预先铺有明胶的24孔板中(5×10³个细胞/孔)。感染时去培养液，加入b)中的病毒上清，每隔8h更换一次病毒上清，持续感染24h。去病毒，加入新鲜细胞培养液，隔天换液，每三天传代一次。收集1×10⁵～1×10⁷的细胞通过流式分选带GFP荧光的细胞，于新鲜细胞培养液中扩大培养。

d)含高比率CD133+细胞亚群并具有高致瘤性的鼠肝肿瘤细胞系的建立：将LPC-H鼠肝肿瘤细胞系培养至对数生长期，用0.25％胰酶+0.1％EDTA消化后，PBS洗涤两次，取1×105～1×107的细胞放入流式管中，离心去上清，加入100μl的10％山羊血清悬浮细胞，4℃封闭10min。随后加入带PE荧光的小鼠CD133抗体2.5ul(0.5mg/ml)，4℃孵育30min。用FACS缓冲液(PBS+0.5％BSA)洗涤两次，弃上清，加入1ml细胞培养液，通过流式分选仪将单个带GFP荧光、CD133+的LPC-H细胞打入加有新鲜细胞培 养液的96孔板中。于37℃、5％二氧化碳/95％空气的恒温培养箱中进行培养。7-14d后，待各单个细胞扩增起来后，移入24孔板中继续培养。待细胞生长至生长对数期，各单克隆取一部分细胞进行CD133表达的检测，筛选得到高表达肿瘤干细胞标志物CD133的鼠肝肿瘤细胞系LPC-H12。

本发明具有如下有益效果和实质性特点：

1)该细胞系表达各肝干细胞相关基因以及干细胞Marker：CD133、EpCAM，其中CD133的表达量较以往有大幅度提高；

2)具有高体外成球能力

3)具有高体内致瘤能力；

4)这一鼠肝肿瘤细胞系为研究CD133+肝癌干细胞亚群在肝癌发生及发展过程中的作用和机理以及抗肝肿瘤干细胞药物的筛选提供有力工具。

附图说明：

图1LPC-H12细胞的相差图。

图2不同LPC-H单细胞克隆中表达CD133情况示意图。

图3LPC-H12细胞系中CD133及EpCAM的表达情况示意图。

图4LPC-H12细胞系中肝干细胞相关基因的表达情况示意图。A为阳性对照；B为LPC-H12样本。

图5LPC-H及LPC-H12细胞形成球体的情况比较示意图。A为LPC-H及LPC-H12细胞悬浮培养所形成的球体相差图，Bar＝100um；B为LPC-H及LPC-H12细胞所形成的球体数对比。

图6LPC-H及LPC-H12细胞致瘤性的情况比较示意图。

具体实施方式：

以下对本发明的实施例作详细说明：本实施例在以本发明技术方案为前提下进行实施，给出了详细的实施方式和过程，但本发明的保护范围不限于下述的实施例。

实施例1

建立CD133高表达的鼠肝肿瘤细胞系LPC-H12：

a)分离p53-/-小鼠胚胎肝细胞(LPC细胞)：取E13.5d的p53-/-小鼠胚胎，在PBS中漂洗2-3次；用无菌眼科剪及镊子完整剪取其肝脏。将其剪碎 后，加入肝脏消化液于37℃消化30min成单细胞悬液。离心去上清，用PBS洗2-3次，将细胞与大鼠抗小鼠E-cadherin单抗一起4℃孵育30min(所用抗体量为4ug E-cadherin/1×10⁷个细胞)。用PBS洗2-3次，离心去上清，将细胞与羊抗大鼠的磁珠(20ul/l×10⁸细胞)一起4℃孵育15min。最后采用磁珠分选系统(MACS)分离出E-cadherin+胚胎肝细胞。分离出的细胞接种于预先铺有明胶的细胞培养皿中，采用含10％胎牛血清、0.01M尼古丁、10^-7mol/L地塞米松、1×ITS、1×巯基乙醇、40ng/ml的HGF、20ng/ml的EGF、100U/ml青霉素、100ug/ml链霉素的DMEM/F12培养液，于37℃、5％二氧化碳/95％空气的恒温培养箱中进行培养。

b)MSCV-IRES-GFP-Hras(MIG-Hras)逆转录病毒的制备：按照invitrogen公司lipofectAMINE^TM2000 Reagent说明书提供的参考方法进行操作，将MIG-Hras质粒转染包装细胞Ecotropic中，培养48及72h后分别收集病毒上清。

c)LPC-H鼠肝肿瘤细胞系的建立：感染LPC细胞前一天，将LPC细胞接种于预先铺有明胶的24孔板中(5×10³个细胞/孔)。感染时去培养液，加入b)中的病毒上清，每隔8h更换一次病毒上清，持续感染24h。去病毒，加入新鲜细胞培养液，隔天换液，每三天传代一次。收集1×10⁵～1×10⁷的细胞通过流式分选带GFP荧光的细胞，于新鲜细胞培养液中扩大培养。

d)含高比率CD133+细胞亚群并具有高致瘤性的鼠肝肿瘤细胞系的建立：将LPC-H鼠肝肿瘤细胞系培养至对数生长期，用0.25％胰酶+0.1％EDTA消化后，PBS洗涤两次，取1×10⁵～1×10⁷的细胞放入流式管中，离心去上清，加入100μl的10％山羊血清悬浮细胞，4℃封闭10min。随后加入带PE荧光的小鼠CD133抗体2.5ul(0.5mg/ml)，4℃孵育30min。用FACS缓冲液(PBS+0.5％BSA)洗涤两次，弃上清，加入1ml细胞培养液，通过流式分选仪将单个带GFP荧光、CD133+的LPC-H细胞打入加有新鲜细胞培养液的96孔板中。于37℃、5％二氧化碳/95％空气的恒温培养箱中进行培养。7-14d后，待各单个细胞扩增起来后，移入24孔板中继续培养，细胞形态如图1所示。待细胞生长至生长对数期，各单克隆取一部分细胞进行CD133表达的检测，筛选得到高表达肿瘤干细胞标志物 CD133的鼠肝肿瘤细胞系LPC-H12。(各组LPC-H的CD133表达量对比如图2所示)

实施例2

LPC-H12细胞系高表达干细胞标志物CD133及EpCAM：

a)LPC-H12细胞系体外常规培养条件为：10％FBS以及50mM2-mercaptoethanol所配制的DMEM/F12培养液，37℃，5％二氧化碳/95％空气，饱和湿度。

b)生长至对数生长期的LPC-H12细胞，用0.25％胰酶+0.1％EDTA消化后，PBS洗涤两次，取1×10⁵～1×10⁷的细胞放入流式管中，离心，去上清，加入100μl的10％山羊血清悬浮细胞，4℃封闭10min。

c)在步骤b)中加入CD133-PE或EpCAM-PE荧光抗体2.5ul(0.5mg/ml)，4℃孵育30min。

d)加入FACS缓冲液，轻轻混匀，300g离心5min，弃上清。

e)加入300-500ul的FACS缓冲液，用BD流式分析仪进行检测。如图3所示：LPC-H12对干细胞标志物CD133及EpCAM的表达量均高于初始LPC-H细胞系。

实施例3

LPC-H12细胞系中肝干细胞相关基因的表达：

a)将体外常规培养、生长至对数生长期的LPC-H12细胞，用0.25％胰酶+0.1％EDTA消化后收集细胞，PBS洗涤细胞两次，细胞沉淀用TaKara公司的总RNA提取试剂盒进行总RNA的提取。

b)取2ug总RNA使用TaKara公司的逆转录试剂盒将其反转成cDNA。

c)PCR检测肝干细胞增殖、自我更新相关基因的表达情况。所扩增的目的基因及其引物序列如表1所示，所述引物由英俊生物技术有限公司合成。PCR反应条件为预变性95℃5min，循环反应35次，循环条件为：变性95℃130s，退火30s，退火温度见表1，延伸72℃30s。末轮延伸为72℃，10min。

d)PCR产物经1.5％琼脂糖电泳进行检测，并在凝胶成像系统上观察，结果如图4所示。通过RT-PCR检测，LPC-H12细胞系中与肝干细胞相关基因Alb、 AFP、CK19、Bmi1、ALDH1a1、SOX1、Nanog、Notch1均有表达。

表1.PCR扩增中各基因的特异性引物序列

实施例4

LPC-H及LPC-H12细胞形成球体的情况比较：

a)将体外常规培养、生长至对数生长期的LPC-H12细胞，用0.25％胰酶+0.1％EDTA消化后，PBS洗涤细胞两次，加入无血清sphere培养液(含1×B27、20ng/ml EGF、20ng/ml FGF的DMEM/F12培养液)制备细胞悬液。采用台盼蓝排除法计数活细胞，以每孔250个细胞铺于24孔低吸附 细胞培

b)培养1-2周后可形成悬浮生长的球体(hepatospheres，肝球体)，然后镜下计数。

结果如图5所示：相同细胞数的LPC-H12细胞所形成的球体数多于LPC-H细胞。其中，LPC-H12细胞所形成的直径大于100um的球体数显著多于LPC-H细胞。

实施例5

LPC-H及LPC-H12细胞致瘤性的情况比较：

a)将体外正常培养、生长至对数生长期的LPC-H12细胞，用0.25％胰酶+0.1％EDTA消化后，PBS洗涤细胞两次。台盼蓝排除法计数活细胞，并制备细胞悬液，浓度为1×10⁷/ml。

b)取上述细胞悬液100ul(1×10⁶个)，接种于5只4-6周龄的BALB/C-nu/nu雄性裸鼠的皮下。

c)每两天观察一次肿瘤生长状况，形成肿瘤后，每隔一天测量一次肿瘤大小。

结果如图6所示：LPC-H12细胞成瘤率为100％，肿瘤生长速度明显高于LPC-H。

以上显示和描述了本发明的基本原理和主要特征和本发明的优点。本行业的技术人员应该了解，本发明不受上述实施例的限制，上述实施例和说明书中描述的只是说明本发明的原理，在不脱离本发明精神和范围的前提下，本发明还会有各种变化和改进，这些变化和改进都落入要求保护的本发明范围内。本发明要求保护范围由所附的权利要求书及其等效物界定。