miR399融合基因及其构建方法和在植物育种中的应用

摘要

miR399融合基因及其构建方法和在植物育种中的应用，本发明分别克隆植物环境胁迫特异性表达基因RD29A的启动子和低磷特异响应微小RNA基因miR399，并构建可以在环境胁迫条件下特异性诱导表达的RD29A-ath-miR399融合基因。将该融合基因转化植物，可获得环境胁迫特异性诱导表达的miR399，从而获得能高效利用土壤磷素资源的转基因农作物新品种，对于降低农业种植的生产成本和大量磷肥施用造成的水土污染具有重要意义。

说明书

技术领域

本发明属于植物基因工程领域，具体地说，是用拟南芥环境胁迫特异性表达基因RD29A的启动子和低磷特异响应微小RNA基因miR399构建RD29A-ath-miR399融合基因及其在转基因植物育种中应用。

背景技术

农业生产中，为保证作物的经济产量，往往会施用高量磷肥，使生产成本增加，磷肥利用率低。并且，长期过量磷肥对土壤环境和周围水体造成了巨大的压力。这种现象在设施农业生产中尤其明显。陷入了不施肥则作物产量下降，施肥则可能带来土壤次生盐渍化和酸化等土壤质量退化的两难境地。同时，世界人口的快速增长对农产品的供应造成了极大的压力。改变现代农业生产造成的高成本、低利用率及环境污染已经成为世界范围内尤其是发展中国家亟待解决的问题。解决这一难题的关键之一是提高栽培条件下作物对养分的吸收利用能力。利用基因工程技术改造农作物对土壤中养分的吸收利用能力已经成为国际上农业科学研究的重要课题。

现在已经有转磷酸盐转运子基因、酸性磷酸酶基因和有机酸合成酶等结构基因提高植物吸磷能力的报道。但是存在转结构基因能耗较大，且功能比较单一的缺点。近年来发现了一类新的调控基因——microRNA(miRNA)。成熟的miRNA长度仅为21-26nt，可调控植物的发育进程、对环境的适应能力等。其中，miR399对缺磷胁迫专一响应。近年来，科学家发现了磷胁迫响应途径的上游调控元件miR399s(Sunkar et al.，2004；Fujii et al.，2005)。过量表达ath-miR399基因拟南芥，在高磷水培下地上部含磷量提高了4-6倍(Aung et al.，2006；Chiou et al.，2006)，转ath-miR399基因烟草在高磷水培下显著提高地上部的含磷量(Lin et al.，2008)，转ah-miR399基因番茄在土壤条件下，可以显著提高地上部的含磷量(Gao et al.，2010)。这意味着该基因可以从土壤中高效利用磷素，因此被选为本实验的目的基因。但是，在野生型拟南芥中，ath-miR399只有在低磷胁迫的条件下才表达，不受环境和培养条件的影响。在过量表达ath-miR399的情况下，转基因植物的生物量明显减小，反而不利于增产。

为提高作物从土壤中吸收利用磷肥的能力，并且生长状态良好的转基因作物，我们选取了拟南芥中的一个受环境胁迫诱导上调的基因——RD29A基因(Liu et al.，1998；Kasuga et al.，1999)。该基因受高盐、干旱、高渗、低温等逆境和ABA等诱导表达(Yamaguchi-Shinozaki et al.，1993)。该基因与植物对磷的吸收利用毫无关系。在我们的实验设计中，将目的基因ath-miR399与RD29A基因的启动子融合，所构成的融合基因转入受体植物，所得到的转基因植株在正常的生长条件下不表达或微弱地表达微小RNA基因miR399，在环境胁迫的条件下能持续地表达微小RNA基因miR399，在土壤上种植，也能持续有效地吸收充足的磷供植物生长发育所用，并且，不影响转基因作物的生长，这种特性是野生型植株和过量表达ath-miR399转基因植株所无法获得的。同时，在天然野生型植物中，RD29A基因的启动子只能驱动RD29A基因表达，而无法驱动ath-miR399基因表达进而增强对磷的吸收利用。

种植能从土壤中高效吸收磷素的新品种作物可以大大降低磷肥利用率，降低生产成本和对水土的污染。基因工程技术的发展为获得这种作物新品种提供了可能性。但是，到目前为止，国内外还没有成功地诱导表达磷相关的微小RNA并获得土壤中高效吸收磷肥的转基因农作物的文献和专利报道。

发明内容

解决的技术问题：本发明克服了现有技术中的缺点，分别克隆植物环境胁迫特异性表达基因RD29A的启动子和低磷特异响应微小RNA基因miR399，并构建可以在环境胁迫条件下特异性诱导表达的RD29A-ath-miR399融合基因。将该融合基因转化植物，可获得环境胁迫特异性诱导表达的miR399，从而获得能高效利用土壤磷素资源的转基因农作物新品种，对于降低农业种植的生产成本和大量磷肥施用造成的水土污染具有重要意义。

技术方案：miR399融合基因，记为RD29A-ath-miR399融合基因，它的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所述。

miR399融合基因的构建方法，步骤为：以拟南芥基因组DNA为模板，用PCR法扩增RD29A基因的启动子，回收扩增产物并进行TA克隆；以拟南芥基因组DNA为模板，用PCR法扩增ath-miR399基因，回收扩增产物并进行TA克隆；用BamHI/SacI双酶切含有ath-miR399基因的TA克隆质粒和pBI121质粒，回收ath-miR399基因片段和大的载体片段；混合上述ath-miR399基因片段和pBI121载体片段，在连接酶催化下进行连接反应，获得含ath-miR399基因的pBI载体；用HindIII/BamHI双酶切含有RD29A基因启动子的TA克隆质粒和含ath-miR399基因的pBI载体质粒，回收RD29A基因启动子片段和大的载体片段；混合上述RD29A基因启动子片段和含ath-miR399基因的pBI载体片段，在连接酶催化下进行连接反应，完成在pBI载体上的RD29A-ath-miR399融合基因的构建。

所述RD29A的启动子PCR扩增引物中的上游引物引入HindIII酶切位点，如SEQ ID NO.2所述；下游引物引入BamHI酶切位点，如SEQ ID NO.3所述。

所述ath-miR399的PCR扩增引物中的上游引物引入BamHI酶切位点，如SEQ ID NO.4所述；下游引物引入SacI酶切位点，如SEQ ID NO.5所述。

miR399融合基因在转化植物中的应用。

miR399融合基因在转化番茄中的应用，步骤为：用融合基因转化番茄：用YEP液体培养基培养带有RD29A-miR399融合基因的农杆菌LBA4404，至OD₆₀₀为1.0左右时收集菌体，然后用MS液体培养基重新悬浮菌体至OD₆₀₀为0.1；取番茄无菌幼苗的子叶，在上述菌液中浸染15min，然后倒向放置在共培养培养基上暗培养3d；将经过3d共培养的子叶转接到再生培养基上，每3周继代培养一次；直到抗性芽出现，并长到约5mm高时，将其自子叶切下，插入到生根培养基中诱导生根；将完整的转基因植株移栽在温室菜园土中。

有益效果：将该融合基因转入植物基因组中，可获得环境胁迫特异性诱导表达的miR399，从而获得能高效利用土壤磷素资源的转基因农作物新品种，对于降低农业种植的生产成本和大量磷肥施用造成的水土污染具有重要意义。

我们利用根癌农杆菌介导的转化方法，将RD29A-miR399融合基因成功地转入了栽培番茄品种中蔬四号中。与野生型番茄相比，转基因番茄表现出了极强的吸磷能力，转基因番茄在低磷土壤中的生长有很大改善。RD29A-miR399融合基因转入其他作物，也可以获得高效吸收磷肥、抗低磷胁迫，并减少磷肥施用量和面源污染的转基因作物新品种。

附图说明

图1：带有RD29A-miR399融合基因的双元表达载体图；

图2：转基因番茄的融合基因PCR检测；

图3：非转基因(WT)和转基因番茄的地上部含磷量；

图4：非转基因(WT)和转基因番茄的菌根侵染率。

具体实施方式

实施例1：拟南芥环境胁迫特异性表达启动子RD29A启动子克隆

以拟南芥基因组DNA为模板，利用PCR方法扩增652bp的RD29A基因启动子，回收扩增产物并进行TA克隆。

(1)PCR扩增目的片段

根据GenBank已公开的拟南芥环境胁迫特异性表达RD29A基因(GenBank accession number D13044)启动子区设计特异引物，在上游引物5′端加入HindIII酶切位点，下游引物5′端加入BamHI酶切位点。

上游引物：5′-TCGAAGCTTGGTGAATTAAGAGGAGAGAG-3′(加入HindIII酶切位点)

下游引物：5′-GACGGATCCTGAGTAAAACAGAGGAGGGTC-3′(加入BamHI酶切位点)

按常规方法提取拟南芥基因组DNA，以基因组DNA为模板，利用上述引物进行PCR扩增，制备RD29A基因启动子片段。

PCR反应体系：

  试剂  加入量  Taq(5U/μL)  0.25μL  10×PCR Buffer(Mg²⁺ free)  5μL  dNTPs(2.5mM each)  4μL  MgCl₂(25mM)  3μL  上游引物(10μM)  2μL  下游引物(10μM)  2μL  模板DNA  2μL  超纯水  31.75μL

PCR反应程序：

94℃预变性5min；

94℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸30s，28个循环；

72℃延伸7min；

4℃保存。

(2)目的片段的克隆和阳性克隆的鉴定

①目的片段的回收

PCR产物经1.5％琼脂糖凝胶电泳，于紫外照射下，割下含目的条带的凝胶块，用Geneclean II Kit(Qbiogene)回收目的片段。

②连接

加入下列反应体系的试剂，16℃反应过夜，实现目的片段与pMD18-T SimpleVector的连接。

  试剂  加入量  2×Solution I  2.5μL  pMD18simple  0.5μL  PCR产物  2.0μL

③转化和阳性克隆的鉴定

按常规的CaCl₂诱导和转化方法，制备E.coli DH5α感受态细胞，用5μL连接产物转化感受态细胞，然后均匀涂布在含有50mg L^-1氨苄青霉素的LB平板上，37℃倒置培养过夜，挑选单菌落，接种至含有50mg L^-1氨苄青霉素的LB液体培养基中37℃震荡培养过夜，碱裂解法小量提取质粒DNA(萨姆布鲁克和拉塞尔，2002)，用HindIII和BamHI双酶切，产生约2700bp的pMD18simple载体片段和包含RD29A基因启动子的约650bp片段。按前面所述的PCR引物和扩增条件，以质粒DNA为模板，进行PCR扩增，经1.5％琼脂糖凝胶电泳检测，产生约650bp的RD29A基因启动子片段。这样的质粒即为含有RD29A基因启动子的阳性克隆。

④测序验证

经酶切和PCR鉴定的阳性克隆，送交菌液进行DNA测序，证明与GenBank中的序列完全一致。

实施例2：拟南芥微小RNA miR399基因克隆

根据ASRP已发表的拟南芥ath-miR399基因的DNA信息(DBE#2109)设计特异引物，上游引物5′端加入BamHI酶切位点，下游引物5′端加入SacI酶切位点。PCR产物为306bp

上游引物：5′-TCGGGATCCTTGCTAGTCCAACTTCCAAT-3′(加入BamHI酶切位点)

下游引物：5′-GCGAGCTCAGGATTCGATCTATAAAACCT-3′(加入SacI酶切位点)

按照常规方法提取拟南芥基因组DNA，以基因组DNA模板应用PCR方法扩增ath-miR399d基因前体，然后用pMD18simple载体进行TA克隆。PCR反应体系、反应条件、目的片段回收、克隆和测序，同实施例1。

实施例3：利用pBI121载体构建RD29A-miR399融合基因

(1)从大肠杆菌中提取载体质粒pBI121(该菌株可从试剂公司购买)，用BamHI/SacI双酶切回收大的载体片段。

(2)从实施例1所制备的TA克隆中提取质粒，用BamHI/SacI双酶切回ath-miR399基因片段。

(3)将上述2个片段在连接酶催化下于16℃连接过夜，完成pBI载体上的ath-miR399基因构建。

  试剂  加入量  10×T4DNA ligase Buffer  1.0μL  T4DNA ligase  0.5μL  pBI121载体回收片段  2.0μL  ath-miR399基因回收片段  6.5μL

(4)用连接混合物转化E.coli DH5α感受态细胞，挑选转化平板上的白色菌落，方法同实施例1。

(5)提取白色菌落的质粒，用BamHI和SacI双酶切产生2个片段，一个是约12800bp的pBI121载体片段，另一个是约300bp的ath-miR399基因片段。

(6)提取(5)所述含ath-miR399基因片段的pBI121载体的质粒，用HindIII/BamHI双酶切回收大的载体片段。

(7)从实施例2所制备的TA克隆中提取质粒，用HindIII/BamHI双酶切回收RD29A基因启动子片段。

(8)将(6)和(7)所述2个片段在连接酶催化下于16℃连接过夜，完成pBI载体上的RD29A-miR399融合基因构建(见图1)。

  试剂  加入量  10×T4DNA ligase Buffer  1.0μL  T4DNA ligase  0.5μL  含ath-miR399基因片段的pBI121载体回收片段  2.0μL  RD29A基因启动子回收片段  6.5μL

(9)用连接混合物转化E.coli DH5α感受态细胞，挑选转化平板上的白色菌落，方法同实施例1。

(10)提取白色菌落的质粒，用HindIII和BamHI双酶切产生2个片段，一个是约12300bp的pBI121载体片段，另一个是约650bp的ath-miR399基因片段。

(11)经过酶切鉴定的阳性克隆，送交测序公司测序。

(12)从测序正确的阳性克隆中提取质粒，用常规方法转化农杆菌LBA4404，获得工程农杆菌，用于植物转化。

实施例4：转基因番茄的制备

用RD29A-miR399融合基因转化番茄的步骤如下：

(1)农杆菌的培养：从平板上挑取单菌落，接种于含100mg L^-1 kanamycin(Kan)，25mg L^-1 rifampicin(Rif)和50mg L^-1 streptomycin(Strep)的Luria-Bertani(LB)液体培养基中，28℃，250rpm震荡培养至OD_600nm＝1.0，用LB液体培养基稀释菌液10倍，继续震荡培养4h；将菌液倒入无菌螺口带盖离心管内，盖上管盖，4000rpm离心10min；弃去上清，倒置离心管1min，流尽残余液体；向离心管中加入适量共培养培养基-I(MS，30g L^-1蔗糖，pH 5.8)，悬浮起菌体，转入无菌容器中，用共培养液体培养基-I，再次稀释至OD_600nm＝0.1。

(2)子叶的预培养：番茄种子在自来水下冲洗15min，转移至超净工作台。用无菌水冲洗4次，先用75％酒精浸泡30s，无菌水冲洗4次；再用2％(W/V)的次氯酸钠剧烈振荡灭菌15-20min，无菌水冲洗8次且持续时间不少于30min。表面灭菌后的种子接种于种子萌发培养基(MS，30gL^-1蔗糖，8gL^-1琼脂，pH5.8)上。放置无培养室培养，光周期16h/8h，光照强度为72μmolm^-2s^-1，培养温度为23±1℃。将6-8d苗龄的番茄无菌苗的子叶剪成约25mm²的块状，正向放置在预培养培养基(MS培养基，2mg L^-1玉米素，30g L^-1蔗糖，8g L^-1琼脂，pH 5.8)上预培养1d。

(3)农杆菌介导测转化：将经过预培养的子叶浸入制备好的菌悬液中，浸染15min。将浸染后的子叶在无菌滤纸上轻轻吸干，接种到共培养培养基-II(MS培养基，100μM乙酰丁香酮，2mg L^-1玉米素，0.1mg L^-1吲哚乙酸，30g L^-1蔗糖，8g L^-1琼脂，pH 5.2)上共培养3d。

(4)转基因植株的再生和培育：将经过3d共培养的子叶转接到再生培养基(MS培养基，50mg L^-1kanamycin，200mg L^-1timentin，1mg L^-1玉米素，0.1mg L^-1吲哚乙酸，30g L^-1蔗糖，8g L^-1琼脂，pH 5.8)上，每3周继代培养一次。直到抗性芽出现，并长到约5mm高时，将其自子叶切下，插入到生根培养基-I(MS培养基，50mg L^-1kanamycin，200mg L^-1timentin，0.2mg L^-1吲哚乙酸，30gL^-1蔗糖，8g L^-1琼脂，pH 5.8)中诱导生根。再将生根的植株转接到生根培养基-II(MS培养基，50mg L^-1kanamycin，30g L^-1蔗糖，8g L^-1琼脂，pH 5.8)上继续培养1周。将完整的转基因植株移栽在温室菜园土中，继续培养至开花、结实。

(5)转基因番茄植株的PCR检测：分别剪取每棵转化植株的一片叶片，提取总DNA，以总DNA为模板，用引物：

上游引物：5′-TCGGGATCCTTGCTAGTCCAACTTCCAAT-3′

下游引物：5′-GCGAGCTCAGGATTCGATCTATAAAACCT-3′

进行PCR反应，然后进行琼脂糖凝胶电泳，出现约650bp的RD29A-miR399融合基因带，以野生型番茄的总DNA为负对照进行PCR反应，未出现融合基因条带，证明目的基因的片段已经整合到植物基因组中(见图2)。

实施例5：转RD29A-miR399融合基因番茄磷高效吸收能力检测

(1)转基因番茄的含磷量测定：T₂代转基因番茄栽种于中国科学院南京土壤研究所温室内。温室盆栽所用土壤采自江苏省宜兴市的蔬菜种植区(温室大棚土)：表层(0-20cm)土壤基本理化性状为pH 5.1，有效磷89.5mg kg^-1干土(以P₂O₅计)。T₂代转基因番茄移栽至土壤中1个月后，收获转基因番茄的地上部样品和对照样品，用去离子水洗净，分成不同的部分，105℃杀青30min，65℃烘干至恒重；粉碎；称重；H₂SO₄-H₂O₂消化，钒钼黄比色法测定植物样品的全磷含量(鲁如坤，1999)。结果表明，在相同的供磷条件下，转基因番茄的含磷量显著提高，生物量有所改善(见图3：C6、C7、C12、C17和C30是转RD29A-miR399融合基因的番茄；D2是转35S-miR399基因的番茄，用作RD29A基因启动子功能的对照；G是转35S-GUS基因的番茄，用作miR399基因功能的对照)。说明了转RD29A-miR399融合基因番茄有高效吸收磷的能力。

(2)转基因番茄的菌根侵染率测定：土壤培养后，采集番茄的根，用曲利苯蓝染色-显微镜观察的方法估测菌根侵染率。结果表明，转基因番茄的菌根侵染率显著高于野生型番茄(见图4)。进一步说明了转RD29A-miR399融合基因番茄对磷的高效吸收能力。

SEQUENCE LISTING

<110>中国科学院南京土壤研究所

<120>miR399融合基因及其构建方法和在植物育种中的应用

<130>

<160>5

<170>PatentIn version 3.3

<210>1

<211>960

<212>DNA

<213>人工序列

<400>1

aagcttggtg aattaagagg agagaggagg taaacatttt cttctatttt ttcatatttt    60

caggataaat tattgtaaaa gtttacaaga tttccatttg actagtgtaa atgaggaata    120

ttctctagta agatcattat ttcatctact tcttttatct tctaccagta gaggaataaa    180

caatatttag ctcctttgta aatacaaatt aattttcctt cttgacatca ttcaatttta    240

attttacgta taaaataaaa gatcatacct attagaacga ttaaggagaa atacaattcg    300

aatgagaagg atgtgccgtt tgttataata aacagccaca cgacgtaaac gtaaaatgac    360

cacatgatgg gccaatagac atggaccgac tactaataat agtaagttac attttaggat    420

ggaataaata tcataccgac atcagttttg aaagaaaagg gaaaaaaaga aaaaataaat    480

aaaagatata ctaccgacat gagttccaaa aagcaaaaaa aaagatcaag ccgacacaga    540

cacgcgtaga gagcaaaatg actttgacgt cacaccacga aaacagacgc ttcatacgtg    600

tccctttatc tctctcagtc tctctataaa cttagtgaga ccctcctctg ttttactcag    660

gatccttgct agtccaactt ccaataactc aaaatgcaat gtgaaatatg aagaatatat    720

taaatagtag tgaagatgca tgtttatgaa gacagagaga taatgtatgg ttggattact    780

gggcgaatac tcctatggca gatcgcattg gctagatatg caagtaaaat gcttctctgc    840

caaaggagat ttgccccgca attcatccca tgcaaaacaa tatatctttc tttatagtct    900

ctaggcaatt tatggttata tttcttggtt atcaggtttt atagatcgaa tcctgagctc    960

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<110>  中国科学院南京土壤研究所

 

<120>  miR399融合基因及其构建方法和在植物育种中的应用

 

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<170>  PatentIn version 3.3

 

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<212>  DNA

<213>  人工序列

 

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caggataaat tattgtaaaa gtttacaaga tttccatttg actagtgtaa atgaggaata    120

 

ttctctagta agatcattat ttcatctact tcttttatct tctaccagta gaggaataaa    180

 

caatatttag ctcctttgta aatacaaatt aattttcctt cttgacatca ttcaatttta    240

 

attttacgta taaaataaaa gatcatacct attagaacga ttaaggagaa atacaattcg    300

 

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