盐霉素在制备抗人类多种恶性肿瘤药物中的应用

摘要

本发明公开了一种盐霉素在制备抗人类多种恶性肿瘤药物中的应用。本发明采用盐霉素能够抑制多种人类肿瘤细胞及转移性肿瘤细胞的生长，不仅如此，盐霉素还能杀死肺癌干细胞等人类其他多种肿瘤干细胞。具有开发成针对肿瘤干细胞的抗癌药物的潜能，在制备治疗人肺癌、皮肤癌、胰腺癌、结肠癌、肝癌、直肠癌、脑癌、肾细胞癌、脑转移性前列腺癌等人类多种恶性肿瘤药物方面具有重要的开发应用前景。

说明书

一、技术领域

本发明涉及化学医药领域。具体涉及一种盐霉素在制备抗人类多种恶性肿瘤药物中的应用。

二、背景技术

近30年来，全世界恶性肿瘤的发病率、死亡率呈明显上升趋势。我国恶性肿瘤的死亡率每年递增1.8％，发病率则以每年2.5％的速度增加。与此同时，国内高发恶性肿瘤的排名也出现了明显变化。20世纪七八十年代主要恶性肿瘤的排序是：胃癌、食管癌、肝癌、肺癌、宫颈癌。目前已经演变为：肺癌(女性为乳腺癌)、肝癌、胃癌、食管癌、结肠/直肠癌或前列腺癌。由于其发病机理尚未探明，因此目前对于恶性肿瘤的治疗方法，不外乎手术、放疗、化疗、免疫及中药5种治疗方法，化疗仍然是治疗的主要措施之一，但由于化疗不仅是“敌友不分”而且很难达到根治的目的，其主要原因目前一些科学家认为是肿瘤干细胞存留所致。

癌症干细胞是肿瘤细胞中数量比较少但生命力很强的细胞，它们对化疗和放疗有抵抗性，不容易定位，还可以“生出”新的肿瘤细胞，导致癌症复发。正因为它们的这些特性，对付癌症干细胞成为治疗癌症的一个重要课题。Piyush B.Gupta等^【1】研究发现盐霉素(salinomycin)是一种可以“瞄准”并杀死癌症干细胞的化合物，其杀死小鼠身上乳腺癌干细胞的效力比普通抗癌药物泰克索(Taxol)高100倍。它不仅能杀死小鼠身上的乳腺癌干细胞，还能抑制它们生出新的肿瘤细胞，同时还能减缓已经存在的肿瘤的生长速度。

盐霉素(salinomycin)属于聚醚类一元羧酸，由白色链霉菌(Streptomyces albus)发酵产生，具有特殊的环状结构，是典型的离子载体抗生素，它对细胞 中的阳离子，尤其K+、Na+、Rb+的亲和力特别强，使生物所必需的阳离子通过膜上脂质屏障的浸透性增强，妨碍细胞内外阳离子的传递，使细胞内外离子浓度发生变化，从而影响渗透压，最终使细胞崩解，起到杀菌作用。有效成分：盐霉素钠，分子式：C42H69O11Na，分子量：772.99。性状：白色或淡黄色结晶性粉末，微有特异臭，熔点140-142℃。易溶于丙酮，三氯甲烷、苯、乙酸乙酯、乙醚和甲醇，几乎不溶于水。

虽然盐霉素能杀死小鼠身上的乳腺癌干细胞，抑制新生乳腺癌细胞并减缓其生长速度，但对人类的其他肿瘤的抑制情况及干细胞的影响情况尚不清楚，目前世界上尚未见有人进行深入研究。

三、发明内容

本发明的目的是根据上述存在的问题，对盐霉素对人类的非乳腺癌肿瘤的抑制情况及干细胞的影响情况进行深入研究。提供盐霉素在制备用作为抗人类多种肿瘤药物中的应用。研究人员经过大量的科学研究证实了该药物能够抑制多种人类肿瘤细胞及转移性肿瘤细胞的生长，不仅如此，盐霉素还能杀死肺癌干细胞等人类其他多种肿瘤干细胞。

上述的肿瘤细胞为人肺癌细胞、皮肤癌细胞、胰腺癌细胞、结肠癌细胞、肝癌细胞、直肠癌细胞、舌癌细胞、肾细胞癌细胞、脑转移性前列腺癌细胞等多种人类恶性肿瘤。

研究所用药物剂型包括片剂，胶囊，分散片，粉针剂，注射液，栓剂等所有剂型。其使用途径包括局部外用，皮下、静脉、腹腔、关节腔注射。

本发明的有益效果：本发明经过大量的实验研究发现盐霉素能抑制人类多种恶性肿瘤细胞生长，特别是其干细胞的生长。在制备治疗人肺癌、皮肤癌、 胰腺癌、结肠癌、肝癌、直肠癌、舌癌、肾细胞癌、脑转移性前列腺癌等人类多种恶性肿瘤药物方面具有重要的开发应用前景。

四、具体实施方式

实施例1：盐霉素的体外抗肿瘤细胞增殖实验

所选的细胞株包括人肺癌细胞A549、皮肤癌细胞A-431、胰腺癌细胞BxBCO、结肠癌细胞Caco2、结肠直肠癌细胞HT-29、肝癌细胞HepG2、舌癌细胞SCC-9、肾细胞癌细胞786-O、脑转移性前列腺癌细胞DU-145等。取对数生长期肿瘤细胞制成一定浓度的细胞悬液接种于96孔板中，细胞加药培养48小时后，取出培养板，于每孔加入50ul预冷的50％三氯醋酸，静置5分钟后移入4℃冰箱中静置1小时，取出用去离子水洗5遍，空气中干燥，待完全干燥后每孔加入1％的乙酸配制的0.4％的SRB 100ul，染色20分钟后倒掉染液，用1％乙酸洗5次，去除未结合的染料。空气中干燥后用pH 10.5的10mmol/L的非缓冲Tris碱液150ul溶解，在平板振荡器上振荡5分钟，在BioRad酶标仪上测定各孔在570nm的光吸收。本底对照板的细胞同样处理测定OD490。

1)盐霉素对人肺癌细胞株A549体外生长活性(IC₅₀，μM)的影响，见图1-1。

2)盐霉素对人皮肤癌细胞株A-431体外生长活性(IC₅₀，μM)的影响，见图1-2。

3)盐霉素对人胰腺癌细胞株BxBCO体外生长活性(IC₅₀，μM)的影响，见图1-3。

4)盐霉素对人结肠癌细胞株Caco2体外生长活性(IC₅₀，μM)的影响，见图1-4。

5)盐霉素对人结肠直肠癌细胞株HT-29体外生长活性(IC₅₀，μM)的影响，见图1-5。

6)盐霉素对人肝癌细胞株HepG2体外生长活性(IC₅₀，μM)的影响，见图1-6。

7)盐霉素对人舌癌细胞株SCC-9体外生长活性(IC₅₀，μM)的影响，见图1-7。

8)盐霉素对人肾细胞癌细胞株786-O体外生长活性(IC₅₀，μM)的影响，见图1-8。

9)盐霉素对人脑转移性前列腺癌细胞株DU-145体外生长活性(IC₅₀，μM)的影响，见图1-9。

实施例2：盐霉素对人肺癌细胞株A549干细胞的影响

1)从人肺癌细胞株A549中分离肺癌症干细胞：

A549细胞株，从美国菌种保藏中心获得(ATCC，Manassas，VA，USA)。这些细胞由ATCC建议的培养基培养，在对数增长期予以实验。应用ALDEFLUOR试剂盒(StemCell Technologies，Durham，NC，USA)与人类ALDH1A1尽可能的反应用来确定癌症干细胞.简单来说，就是有荧光标记ALDH1A1表达的细胞被流式细胞仪检测并分选出来(BD生物科学，圣何塞，美国加利福尼亚州)。具体来说是ALDH1A1激活是基于ALDEFLUOR抑制剂diethylaminobenzaldehyde(DEAB)表达与否。数据使用Quest软件分析(BD Biosciences)。

[流式细胞仪检测并分选荧光标记ALDH1A1表达阳性的细胞情况见附图说明2-1]

2)肿瘤球微体细胞和盐霉素治疗实验。

对于肿瘤球微体细胞分析运用的是修改版Dontu(25)，简单地说，10,000个分离出来的ALDH1A1阳性的细胞种植在特制的干细胞培养6孔板上(纽约州康宁)，每空加入2毫升无血清缓冲液，(DMEM/F12，含20纳克/毫升碱性成纤维细胞生长因子，20纳克(DMEM/F12/毫升表皮生长因子，B27，100微克/毫升庆大霉素，抗菌，防霉，所有来自Invitrogen公司)。这些细胞每3d更换培养液，一旦球微体细胞形成(超过50cells)，第7天，在培养液中加入终浓度为5uM的盐霉素。倒置荧光显微镜(Inverted Research Microscope ECLIPSE Ti)照相记录肿瘤球微体细胞并描述盐霉素作用后肿瘤球微体细胞的形态和数目的变化，见图2-2～图2-6。

实施例3：盐霉素对人肺癌A549干细胞作用的动物实验正在实验过程中。

nod-scid免疫三缺陷小鼠购自上海斯莱克实验动物有限责任公司。5000ALDH-阳性A549细胞悬浮于1毫升Matrigel培养液(威格拉斯生物技术(北京)有限公司)再按1∶2DMEM稀释，然后皮下注射于NOD-SCID小鼠。用触诊法检测肿瘤形成。24小时后盐霉素注射治疗。动物使用按国家有关规定执行，盐霉素(5毫克/千克/天)，或紫杉醇(5毫克/千克/天)每组6只小鼠，每天腹腔注射一次，共四周。

综上所述，盐霉素有发展成为抗肿瘤药物的潜力和前景。

参考文献：

[1]Piyush B.Gupta，Tamer T.Onder，Guozhi Jiang.et al.(2009).ldentification of Selective InhibitorS of Cancer Stem Cells by High-Throughput Screening.Cell.138(4).645-659.

五、附图说明如下：

图1-1：盐霉素对人肺癌细胞株A549体外生长活性(IC50，μM)的影响。

图1-2：盐霉素对人皮肤癌细胞株A-431体外生长活性(IC50，μM)的影响。

图1-3：盐霉素对人胰腺癌细胞株BxBCO体外生长活性(IC50，μM)的影响。

图1-4：盐霉素对人结肠癌细胞株Caco2体外生长活性(IC50，μM)的影响。

图1-5：盐霉素对人结肠直肠癌细胞株HT-29体外生长活性(IC50，μM)的影响。

图1-6：盐霉素对人肝癌细胞株HepG2体外生长活性(IC50，μM)的影响。

图1-7：盐霉素对人舌癌细胞株SCC-9体外生长活性(IC50，μM)的影响。

图1-8：盐霉素对人肾细胞癌细胞株786-0体外生长活性(IC50，μM)的影响。

图1-9：盐霉素对人脑转移性前列腺癌细胞株DU-145体外生长活性(IC50，μM)的影响。

图2-1：流式细胞仪检测并分选荧光标记ALDH1A1表达阳性的细胞情况。

图2-2：盐霉素对人肺癌细胞株A549干细胞球微体细胞的影响。

图2-3：盐霉素作用1天后球微体细胞的变化10x。

图2-4：盐霉素作用3天后球微体细胞的变化10x。

图2-5：盐霉素作用5天后球微体细胞的变化10x。

图2-6：盐霉素作用5天后球微体细胞的变化40x 。