对用干酒糟预处理含木素纤维素材料的酶水解的改进

摘要

用于从含木素纤维素材料产生发酵产物的方法，包括将含木素纤维素材料与具有或不具有可溶物的干酒糟(DDG/S)合并；预处理合并的含木素纤维素材料和DDG/S；将经预处理的合并的含木素纤维素材料和DDG/S暴露于有效量的水解酶；和用发酵生物发酵以产生发酵产物。

说明书

技术领域

公开了用于从含木素纤维素材料产生发酵产物的方法，更具体而言，公开了通过用干酒糟(distillers dried grains)或具有可溶物的干酒糟处理含木素纤维素材料来增加从该材料产生发酵产物的效率的方法。

背景技术

含木素纤维素材料，即生物质，可用于产生可发酵的糖类，其又可用于产生发酵产物如可再生的(renewable)燃料和化学物。含木素纤维素材料具有纤维素纤维包裹于木质素和半纤维素鞘中的复杂结构。从含木素纤维素材料产生发酵产物包括预处理、水解并发酵所述含木素纤维素材料。

将含木素纤维素材料转化为可再生的燃料和化学物常常涉及对生物质的物理、生物、化学和/或(使用酶进行)酶处理。具体而言，酶将纤维素水解为D-葡萄糖，其为简单的可发酵的糖。在含木素纤维素材料中，需要高剂量的酶来降解纤维素以获得高产量，因为认为木质素和木质素衍生物抑制酶对纤维素的水解。上述抑制可至少以两种方式进行：木质素或木质素衍生物可优选结合所述酶，从而阻止该酶与纤维素结合或水解纤维素，和/或木质素或木质素衍生物可覆盖纤维素的一部分，从而减少酶与纤维素的接近。结果，当加工生物质时，能用来降解纤维素的酶可能较少，因为木质素及其衍生物可清除所述酶或阻断其活性。即使对于能用来降解纤维素的酶，可用的酶也可能无法与纤维素接触，因为木质素可覆盖纤维素。因此，降低了消化纤维素的工艺的有效性。此外，酶成本高。因此，当降解纤维素所需的酶量高时，加工成本高昂，在经济上不可取。

获得令人满意的糖产量所需的酶量的减少可对工艺经济有显著的影响。因此，改进酶使用效率是生物转化工艺中的主要需求。认为数种因素影响纤维素的酶水解。这些因素包括木质素含量、半纤维素含量、乙酰基含量、纤维素的表面积和纤维素结晶性。通常应理解的是，存在于复杂底物中的木质素对酶活性具有负面作用。

尚难确定木质素和木质素衍生物在限制水解中的准确作用。然而，已知去除木质素及其衍生物的作用增加纤维素的水解并增加可发酵的糖的产量。该作用可打开更多纤维素表面积以供酶攻击，且可减少非特异性吸附于木素纤维素底物上的酶量。因此，需要去除木质素及其衍生物的作用从而使得纤维素更易受酶降解的化合物。

发明内容

公开了在干酒糟和/或具有可溶物的干酒糟存在下通过预处理和/或水解含木素纤维素材料而从该材料产生发酵产物的方法。

一个实施方案包含用于从含木素纤维素材料产生发酵产物的方法，包括将所述含木素纤维素材料与具有或不具有可溶物的干酒糟(DDG/S)合并；预处理合并的含木素纤维素材料和DDG/S；将所述经预处理的合并的含木素纤维素材料和DDG/S暴露于有效量的水解酶；和用发酵微生物发酵以产生发酵产物。涵盖的是预处理可包括任何常规预处理方法，包括酸性预处理。其还可包括热预处理。

附图简述

图1.DDG对用DDG进行的经稀酸预处理的玉米秸秆酶水解的作用。

图2.DDG对用DDG进行的经稀酸预处理的玉米秸秆纤维素转化率的作用。

具体实施方式

公开了改进的并更有效的通过使用具有可溶物的干酒糟(DDG/S)酶水解含木质素的生物质的方法。虽然本文中讨论使用DDG/S作为木质素阻断物，涵盖了任何其它可用于通过减少后续酶水解和发酵工艺的成本来增加生物质预处理工艺效率的含有脂肪和蛋白质的工业副产物

木质素是可通过松柏醇和/或芥子醇的脱氢聚合获得的酚聚合物，并见于多种植物的细胞壁中。如本文中使用的术语“木质素”指木质素聚合物的完整结构以及由木质素结构破坏得到的所述完整聚合物的任何衍生片段或化合物，包括可溶性木质素衍生物、缩合的(condensed)木质素衍生物和不可溶性沉淀的木质素。认为木质素衍生物与DDG/S以多种方式相互作用。例如，不可溶的木质素可直接与DDG/S合并，DDG/S可吸附在预处理过程中产生的可溶性木质素衍生物。

如本文中使用的术语“生物质浆料”指经历酶水解的水性生物质材料。生物质浆料通过将生物质例如玉米秸秆、甘蔗渣等与水、缓冲液和其它预处理材料混合来产生。在水解之前可预处理生物质浆料。

如本文中使用的术语“木质素阻断(lignin blocking)”意指在将生物质转化为发酵产物的工艺中减少或消除木质素的有害作用。此外，如本文中使用的术语“有效的木质素阻断量”抑制任何可用于促进木质素阻断的量。

在一个实施方案中，本方法利用了DDG/S，认为其可优选地比纤维素更易结合木质素。含木质素的生物质可与DDG/S混合，例如通过将DDG/S与干生物质在将该生物质预处理之前直接混合。认为DDG/S可优选与木质素在合并的浆料中结合，从而覆盖了沉淀于纤维素表面的木质素，因此妨碍了沉淀的木质素与水解酶的结合。还认为DDG/S也许能够吸附未沉淀于纤维素表面的木质素。然后纤维素水解酶可更有效地和迅速地水解纤维素。如果不用DDG/S处理含木质素的生物质，木质素可与纤维素水解酶一部分结合使其无法水解纤维素，或可覆盖纤维素一部分，使其无法被水解酶接近。

不拘于任何具体理论，认为木质素以多种方式作用以抑制酶对生物质中纤维素的水解。木质素限制纤维素分解酶和半纤维素分解酶可将纤维素转化为单糖的程度。许多研究活动的焦点在于理解细胞壁中木质素的性质，并开发将其有效去除的预处理工艺。对木质素抑制酶活性模式的理解能够减少传统上由生物质中木质素导致的有害作用。如下详述，可在水解含木素纤维素材料或生物质之前对其进行预处理。例如，预处理可为蒸汽预处理、碱性预处理、酸性预处理或其某种组合的形式。蒸汽预处理物理地破坏生物质的结构，即至少部分地打断连接木质素、纤维素和半纤维素的键。碱性预处理通常包括用碱性物质如铵盐处理生物质。碱性预处理化学地改变生物质。对于生物质的木质素成分，认为碱性预处理至少部分地降解木质素，形生木质素衍生物和小的酚类片段，其可不利地影响酶的性能以及酵母的生长和发酵能力。酸性预处理也化学地改变生物质的木质素成分，形成包括缩合的木质素的木质素衍生物，其沉淀于纤维素纤维表面。所述缩合的木质素可通过覆盖纤维素纤维的表面抑制酶接近纤维素。其它在酸性预处理中生成的木质素衍生物包括可抑制酶功能的小的含酚片段和化合物。

还认为用DDG/S处理生物质至少部分是通过结合木质素，因而减少和/或抑制木质素对水解酶的非生产性吸附而起作用的。用DDG/S处理生物质可通过抑制木质素结合酶和改进酶活性来改进对含木质素底物的加工。DDG/S可减少酶加载和/或改进酶性能，因为所述酶可能不会结合于木质素从而仍可用其更有效地水解生物质底物。

认为本方法在生物质的水解中减少酶加载。通过用DDG/S处理生物质显著减少了提供水解所需的酶量。减少酶加载降低了生物质转化工艺的总成本。

根据一个实施方案，所述方法增强了纤维素的酶水解。该方法包括将生物质与有效的木质素阻断量的DDG/S合并，将合并的生物质和DDG/S制浆(slurry)并预处理，并将经预处理的生物质浆料暴露于有效量的水解酶。

如上所示，涵盖的是DDG/S可添加至干生物质。然后可将合并的生物质和DDG/S一起制浆并预处理。预处理可为任何常规的预处理方法，包括酸性预处理。其可进一步包括热处理。然后可洗涤经合并的和预处理的生物质浆料以协助去除可溶性木质素。然后可将经洗涤的生物质浆料暴露于水解酶。通常，任何木质素阻断添加剂在预处理之后添加。如此，常常分别预处理所述木质素阻断添加剂与生物质浆料，从而导致两个预处理工艺，一个用于生物质而一个用于所述添加剂。因此，在制浆和预处理之前，将DDG/S添加至干生物质是有利的，因为所述生物质和DDG/S可一起进行预处理，因此消除了分别对生物质和DDG/S进行预处理步骤的需要。

具有或不具有可溶物的干酒糟(DDG/S)

具有或不具有可溶物的干酒糟(DDG/S)是蒸馏工业的副产物。在北美，大多数DDG/S来自生产用于氧合(oxygenated)燃料的乙醇的植物，而剩余部分的DDG/S由醇类饮料工业产生。

具有或不具有可溶物的干酒糟是在玉米的淀粉部分用选定的酵母和酶发酵以产生醇类和二氧化碳之后剩余的干的残余物。在完全发酵之后，通过蒸馏去除醇类，而干燥剩余的发酵残余物。

进行乙醇生产的谷物的三分之一成为DDG/S。一般而言，每蒲式耳(bushel)用于乙醇制备工艺的谷物产生约2.7加仑乙醇；约18磅DDG/S以及约18磅二氧化碳。

DDG/S用作动物饲料。其富含谷物和剩余酵母蛋白、能量、矿物质和维生素。其对于牛而言是优秀的可消化蛋白质和能量来源。其还可用于火鸡和猪的应用。DDG/S一般包含约30％粗蛋白、约10％脂肪、约6％纤维和约50％糖。

DDG/S对于生物转化工艺而言经济上更为有利，因为除了来自含木素纤维素材料的纤维素更有效地水解为可发酵的糖之外，部分DDG/S也可转化为糖。因此，除了间接地通过抑制木质素的有害作用来促进糖产量之外，DDG/S还通过其糖组分的转化来直接促进糖产量。涵盖的是可在水解一段时间之后例如水解72小时之后，将淀粉酶添加至所述生物质浆料，以将DDG/S中的糖转化为葡萄糖；特别是其中使用了酸性预处理时。使用DDG/S的另一个经济上的益处是DDG/S的预处理导致多肽的释放。某些发酵生物如酵母需要足够的氮以供繁殖和发酵。从DDG/S释放的多肽可提供所需的氮，从而无需另一个外源(exogenous source)。

如前所示，使用DDG/S的另一个益处是可将其在制浆和预处理之前添加至干生物质。在生物质转化工艺中，略过额外的对DDG/S添加剂的预处理步骤在经济上是有利的。

涵盖了首先将干生物质与DDG/S混合，然后将混合物制浆并预处理，然后将纤维素分解酶添加至混合物，提供了纤维素转化的最高效率。因为DDG/S包含其自身可被水解的糖，所以可能水解DDG/S自身的一部分，从而进一步增加糖的产生。用DDG/S处理生物质产生从纤维素的水解产量，其可测量为最终糖产量或纤维素转化率提高的百分数。举例而言，与来自未经DDG/S处理的生物质浆料的纤维素的水解产量相比，可于最终的糖产量方面得到大约12％的改进。再举一例，与来自未经DDG/S处理的生物质浆料的纤维素的水解产量相比，可于纤维素转化率方面得到大约12％的提高。

不拘于任何具体理论，认为DDG/S对木质素的非特异性结合可减少了酶对木质素表面的非生产性结合或由于与木质素的相互作用对酶活性的抑制。因此，在用于木素纤维素转化的工艺中使用DDG/S促使酶加载水平下降而取得了相同的目标转化百分数。

含木素纤维素材料

“木素纤维素”或“含木素纤维素材料”意指主要由纤维素、半纤维素和木质素组成的材料。上述材料常常被称作“生物质”。

生物质具有纤维素纤维包裹于木质素和半纤维素鞘中的分子结构。生物质的结构使其不易受酶水解。为了增强酶水解，必须预处理生物质例如通过在足够的压力和温度条件下进行酸水解以打破木质素的密封，糖化并溶解半纤维素，并破坏纤维素的晶体结构。然后可将纤维素用酶水解，例如通过纤维素分解酶水解，来将糖聚合物转化为可发酵为所需发酵产物如乙醇的可发酵的糖。还可使用半纤维素分解酶处理来水解经预处理的生物质中任何残留的半纤维素。

生物质可为任何含有木素纤维素的材料。在一个优选实施方案中，生物质含有至少约30wt.％，优选至少约50wt.％，更优选至少约70wt.％，甚至更优选至少约90wt.％木素纤维素。应理解的是，所述生物质还可包含其它成分如蛋白质材料、淀粉和糖如可发酵或不可发酵的糖，或其混合物。

生物质通常见于例如植物的茎、叶、壳/荚(hull)、壳/皮/荚/苞(husk)和穗轴或树的叶、枝和木材。生物质包括但不仅限于草本材料、农业残余物、林业残余物、城市固体废物、废纸和纸浆及造纸厂残余物。应理解的是，生物质可为在混合的基质中含有木质素、纤维素和半纤维素的植物细胞壁材料的形式。

其它合适的生物质的实例包括玉米纤维、稻秆、松木、刨花、甘蔗渣、纸和纸浆加工废物、玉米秸秆、玉米穗轴、硬木如白杨和白桦、软木、谷物秸秆如麦秆、稻秆、柳枝稷、芒属(Miscanthus)、稻壳、城市固体废物(MSW)、工业有机废物、办公室用纸或其混合物。

在一个优选实施方案中，所述生物质选自玉米秸秆、玉米穗轴、玉米纤维、麦秆、稻秆、柳枝稷和甘蔗渣中的一种或多种。

预处理

所述生物质可用任何合适的方式进行预处理。根据本发明，预处理可包括在制浆或被认为是常规的预处理步骤之前将DDG/S或类似化合物引入所述干生物质。

预处理在水解和/或发酵之前进行。预处理的目标是分离或释放纤维素、半纤维素和木质素，从而增加水解速率。预处理方法(包括湿法氧化和碱性预处理)靶向木质素释放，而稀酸处理和自水解(auto-hydrolysis)靶向半纤维素释放。蒸汽爆炸是靶向纤维素释放的预处理方法。

预处理步骤可包括其中将DDG/S添加至生物质的步骤。如前所示，当添加DDG/S时，生物质通常为干的形式。对合并的生物质和DDG/S进行常规制浆和预处理。预处理可为任何常规预处理，包括酸性预处理。其还包括热处理。DDG/S可以以约4-48wt.％干生物质的量添加。在预处理过程中生物质可以以约10-80wt.％的量，优选约20-70wt.％的量，特别是约30-60wt.％的量存在，如约50wt.％的量存在。

化学、机械和/或生物预处理

在水解之前或过程中，所述生物质可经化学、机械、生物预处理，或其任意组合。

优选所述化学、机械或生物预处理实在水解之前实施的。或者，所述化学、机械或生物预处理可与水解同时实施，如与添加一种或多种纤维素分解酶或其它酶活性同时，以释放例如可发酵的糖如葡萄糖或麦芽糖。

在一个实施方案中，经预处理的生物质可以以另一种方式洗涤或解毒。然而，洗涤或解毒并非必需的。在一个优选实施方案中，经预处理的生物质经洗涤或解毒。

化学预处理

短语“化学预处理”指促进纤维素、半纤维素或木质素的分离或释放的任何化学预处理。合适的化学预处理方法的实例包括用例如稀酸、石灰、碱、有机溶剂、氨、二氧化硫或二氧化碳进行处理。此外，湿法氧化和控制pH的水热解(hydrothermolysis)也视为化学预处理。

在一个优选实施方案中，所述化学预处理为酸处理，更优选，为连续的稀酸或弱酸(mild acid)处理，例如，用硫酸，或用其它有机酸，如乙酸、柠檬酸、酒石酸、琥珀酸、盐酸或其混合物处理。也可使用其它酸。弱酸处理意为处理的pH在约pH 1-5，优选在约pH 1-3的范围内。在一个具体实施方案中，所述酸浓度在0.1到2.0wt％酸的范围内，并优选为硫酸。该酸可与所述生物质相接触，且混合物可保持在约160-220℃，如约165-195℃范围内的温度，处理时间为数分钟到数秒，例如，1-60分钟，如2-30分钟或3-12分钟。可运用强酸(如硫酸)来移除半纤维素。强酸的添加增强了纤维素的可消化性。

根据本发明也涵盖其它化学预处理技术。已经显示纤维素溶剂处理将约90％的纤维素转化为葡萄糖。也显示了当木素纤维素结构被破坏时，极大增强了酶水解。碱、H₂O₂、臭氧、有机溶剂(使用含水醇中的路易斯酸，FeCl₃，(Al)₂SO₄)、甘油、二烷，苯酚或乙二醇属于已知破坏纤维素结构并促进水解的溶剂(Mosier等，2005，Bioresource Technology 96：673-686)。

本发明也涵盖了使用碱，例如NaOH，Na₂CO₃和氨等的碱性化学预处理。使用氨的预处理方法描述于例如WO 2006/110891、WO 2006/110899、WO2006/110900、WO 2006/110901，其通过提述并入本文。

湿氧化技术涉及使用氧化剂，如，基于亚硫酸盐的氧化剂等。溶剂预处理的实例包括用DMSO(二甲亚砜)等的处理。化学预处理通常进行1到60分钟，如5到30分钟，但可依赖于待进行预处理的材料进行较短或较长的时间。

其它合适的预处理方法的实例描述于Schell等，2003，Appl.Biochem andBiotechn.105-108卷：69-85和Mosier等，2005，Bioresource Technology 96：673-686，以及美国申请公开2002/0164730号，其每一个均通过提述并入本文。

机械预处理

短语“机械预处理”指任何机械的或物理的预处理，其促进自生物质分离或释放纤维素、半纤维素或木质素。举例而言，机械预处理包括多种类型的磨制、辐射、汽蒸/蒸汽爆炸(steam explosion)，以及水热解。

机械预处理包括粉碎，即机械减小大小。粉碎包括干磨、湿磨和振动球磨(vibratory ball milling)。机械预处理可涉及高压和/或高温(蒸汽爆炸)。“高压”意指压力在约300到600psi，优选400到500psi，例如约450psi的范围内。高温意指温度在约100到300℃，优选约140到235℃的范围内。在一个优选实施方案中，机械预处理是分批工艺的蒸汽枪水解器系统，其使用如上定义的高压和高温。也可为此使用Sunds Hydrolyzer(可由Sunds DefibratorAB(Sweden)得到)。

组合的化学和机械预处理

在一个优选实施方案中，对生物质进行了化学和机械预处理。例如，所述预处理步骤可涉及稀酸或弱酸处理以及高温和/或高压处理。所述化学和机械预处理可根据需要顺序或同时进行。

因此，在一个优选实施方案中，对生物质进行化学和机械预处理以促进纤维素、半纤维素或木质素的分离或释放。

在一个优选实施方案中，所述预处理作为稀酸或弱酸预处理步骤进行。在另一个优选实施方案中，预处理作为氨纤维爆炸(fiber explosion)步骤(或AFEX预处理步骤)进行。

生物预处理

短语“生物预处理”指促进自生物质分离或释放纤维素、半纤维素或木质素的任何生物预处理。生物预处理技术可涉及应用溶化木质素的微生物(参见，例如，Hsu，T.-A.，1996，Pre-treatment of biomass，于Handbook on Bioethanol：Production and Utilization，Wyman，C.E.编，Taylor & Francis，Washington，DC，179-212；Ghosh，P.和Singh，A.，1993，Physicochemical and biological treatmentsfor enzymatic/microbial conversion of lignocellulosic biomass，Adv.Appl.Microbiol.39：295-333；McMillan，J.D.，1994，Pre-treating lignocellulosic biomass：a review，于Enzymatic Conversion of Biomass for Fuels Production，Himmel，M.E.，Baker，J.O.和Overend，R.P.编，ACS Symposium Series 566，AmericanChemical Society，Washington，DC，第15章；Gong，C.S.，Cao，N.J.，Du，J.和Tsao，G.T.，1999，Ethanol production from renewable resources，于Advances inBiochemical Engineering/Biotechnology，Scheper，T.编，Springer-Verlag BerlinHeidelberg，Germany，65：207-241；Olsson，L.和Hahn-Hagerdal，B.，1996，Fermentation of lignocellulosic hydrolysates for ethanol production，Enz.Microb.Tech.18：312-331；以及Vallander，L.和Eriksson，K.-E.L.，1990，Production ofethanol from lignocellulosic materials：State of the art，Adv.Biochem.Eng./Biotechnol.42：63-95)。

水解

在发酵经预处理的生物质(优选为生物质浆料的形式)之前，可将其水解以将纤维素和半纤维素分解为可发酵的糖。在一个优选实施方案中，经预处理的材料在发酵之前经水解，优选酶水解。

水解过程中的干固体含量可为约5-50wt.％，优选约10-40wt.％，优选约20-30wt.％的范围。在一个优选实施方案中，水解可作为补料分批工艺实施，其中将经预处理的生物质(即，底物)逐渐加料于例如含有酶的水解溶液。

在一个优选实施方案中，水解是通过酶实施的。根据本发明，经预处理的生物质浆料可由一种或多种纤维素分解酶如纤维素酶或半纤维素酶或其组合来水解。

在一个优选实施方案中，水解是使用下述纤维素分解酶制备物来进行的，其包含一种或多种具有纤维素分解增强活性的多肽。在一个优选实施方案中，具有纤维素分解增强活性的多肽是家族GH61A来源的。合适和优选的纤维素分解酶制备物和具有纤维素分解增强活性的多肽的实例描述于下面的“纤维素分解酶”部分。

因为生物质可含有除了木质素、纤维素和半纤维素之外的组分，水解和/或发酵可在其它酶活性如蛋白酶活性、淀粉酶活性、糖生成酶活性和酯酶活性如脂肪酶活性存在下进行。

酶水解优选在合适的水性环境中在本领域技术人员可容易地确定的条件下进行。在一个优选实施方案中，水解在对所述酶合适的，优选为最佳的条件下进行。合适的工艺时间、温度和pH条件可容易地由本领域技术人员确定。优选地，水解在25至70℃，优选40至60℃，特别是约50℃的温度进行。水解优选在pH 3-8，优选pH 4-6，特别是约pH 5的pH范围中进行。此外，水解通常进行12至96小时，优选16至72小时，更优选24至48小时。

发酵

来自经预处理和/或水解的生物质的可发酵糖可以通过一种或多种发酵生物发酵，所述发酵生物能够直接或间接地将糖类，如葡萄糖、木糖、甘露糖和半乳糖发酵成想要的发酵产物。发酵条件依赖于想要的发酵产物和发酵生物，并且能够由本领域普通技术人员容易地确定。

特别是在乙醇发酵的情况下，发酵可以进行1-48小时，优选1-24小时。在一个实施方案中，所述发酵在20-40℃，优选26-34℃，特别是大约32℃的温度进行。在一个实施方案中，pH大于5。在另一个实施方案中，pH为pH 3-7，优选4-6。然而，某些发酵生物，例如细菌发酵生物具有较高的最佳发酵温度。因此，在一个实施方案中，发酵在40-60℃，如50-60℃的温度进行。本领域技术人员能够容易地确定合适的发酵条件。

发酵可以在分批、补料分批或连续反应器中进行。补料分批发酵可以是固定体积或可变体积的补料分批。在一个实施方案中，采用补料分批发酵。补料分批发酵的体积和速率依赖于，例如，发酵生物、可发酵糖类的性质(identity)和浓度、和想要的发酵产物。这样的发酵速率和体积能够由本领域普通技术人员容易地确定。

SSF、HHF和SHF

水解和发酵可作为同时水解和发酵步骤(SSF)进行。通常这意味组合的/同时水解和发酵在对所述发酵生物合适，优选最佳的条件(例如，温度和/或pH)下实施。

水解步骤和发酵步骤可作为混合水解和发酵(HHF)进行。HHF通常以单独的部分水解步骤开始，并以同时水解和发酵步骤结束。单独的部分水解步骤为酶法纤维素糖化步骤，通常在对所述的水解酶合适，优选最佳的条件(例如在较高温度)下进行。后续的同时水解和发酵步骤通常在对发酵生物合适的条件(常常在比所述单独水解步骤更低的温度)下进行。

水解和发酵步骤也可作为单独的水解和发酵步骤进行，其中所述水解在起始发酵之前已经完成。这常常称作“SHF”。

回收

在发酵之后，可任选地自发酵培养基中以任何合适的方式分离发酵产物。例如，可蒸馏发酵培养基以提取发酵产物，或可自发酵培养基中通过微滤或膜过滤技术提取发酵产物。或者，可通过汽提(stripping)回收发酵产物。回收方法在本领域为众所周知的。

发酵产物

本发明可用于产生任何发酵产物。优选的发酵产物包括醇类(例如，乙醇、甲醇、丁醇)；有机酸(例如，柠檬酸、乙酸、衣康酸、乳酸、葡糖酸)；酮类(例如，丙酮)；氨基酸(例如，谷氨酸)；气体(例如，H₂和CO₂)；抗生素(例如，青霉素和四环素)；酶；维生素(例如，核黄素、B₁₂、β-胡萝卜素)；以及激素。

其它产物包括消费醇类工业产物，例如，啤酒和葡萄酒；乳制品工业产物，例如，发酵的乳制品；皮革工业产物和烟草工业产物。在一个优选实施方案中，所述发酵产物是醇，特别是乙醇。根据本发明方法获得的发酵产物(如乙醇)可优选用作燃料醇/乙醇。然而，在乙醇的情况下，其也可用作饮用乙醇。

发酵生物

短语“发酵生物”指任何适于产生所需的发酵产物的生物，包括细菌和真菌生物。发酵生物可为C6或C5发酵生物，或其组合。C6和C5发酵生物在本领域均为众所周知的。

合适的发酵生物能够将可发酵的糖如葡萄糖、果糖、麦芽糖、木糖、甘露糖和/或阿拉伯糖直接或间接发酵(即转化)为所需的发酵产物。

发酵生物的实例包括真菌生物，如酵母。优选的酵母包括酵母属(Saccharomyces)的菌株，特别是酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)或葡萄汁酵母(Saccharomyces uvarum)的菌株，毕赤酵母属(Pichia)的菌株，特别是树干毕赤酵母(Pichia stipitis)的菌株如树干毕赤酵母CBS5773或巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)的菌株；假丝酵母属(Candida)的菌株，特别是产朊假丝酵母(Candida utilis)，阿糖发酵假丝酵母(Candida arabinofermentans)，迪丹氏假丝酵母(Candida diddensii)，Candida sonorensis，休哈塔假丝酵母(Candidashehatae)，热带假丝酵母(Candida tropicalis)或博伊丁氏假丝酵母(Candidaboidinii)的菌株。其它发酵生物包括包括汉逊酵母属(Hansenula)的菌株，特别是多形汉逊酵母(Hansenula polymorpha)或异常汉逊酵母(Hansenula anomala)的菌株；克鲁维酵母属(Kluyveromyces)的菌株，特别是马克斯克鲁维酵母(Kluyveromyces marxianus)或脆壁克鲁维酵母(Kluyveromyces fragilis)的菌株；和裂殖酵母属(Schizosaccharomyces)的菌株，特别是粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomyces pombe)的菌株。

优选的细菌发酵生物包括埃希氏菌属(Escherichia)，特别是大肠杆菌(Escherichia coli)的菌株，发酵单胞菌属(Zymomonas)的菌株，特别是运动发酵单胞菌(Zymomonas mobilis)的菌株，发酵细菌属(Zymobacter)的菌株，特别是棕榈发酵细菌(Zymobactor palmae)的菌株，克雷伯氏菌属(Klebsiella)的菌株，特别是产酸克雷伯氏菌(Klebsiella oxytoca)的菌株，明串珠菌属(Leuconostoc)的菌株，特别是肠膜明串珠菌(Leuconostoc mesenteroides)的菌株，梭菌属(Clostridium)的菌株，特别是丁酸梭菌(Clostridium butyricum)的菌株，肠杆菌属(Enterobacter)的菌株，特别是产气肠杆菌(Enterobacter aerogenes)的菌株，以及热厌氧杆菌属(Thermoanaerobacter)的菌株，特别是热厌氧杆菌BG1L1(Appl.Micrbiol.Biotech.77：61-86)和乙醇热厌氧杆菌(Thermoanarobacter ethanolicus)的菌株，热解糖热厌氧杆菌(Thermoanaerobacter thermosaccharolyticum)或马瑞氏热厌氧杆菌(Thermoanaerobacter mathrani)的菌株。还涵盖了乳杆菌属(Lactobacillus)以及谷氨酸棒状杆菌R(Corynebacterium glutamicum R)，热葡糖苷酶芽孢杆菌(Bacillusthermoglucosidaisus)和热葡糖苷酶地芽孢杆菌(Geobacillus thermoglucosidasius)的菌株。

在一个实施方案中，所述发酵生物为C6糖类发酵生物，例如，酿酒酵母的菌株。

与发酵木素纤维素衍生材料相关，涵盖了C5糖发酵生物。大多数C5糖发酵生物也发酵C6糖。C5糖发酵生物的实例包括毕赤酵母属的菌株，例如树干毕赤酵母菌种的菌株。C5糖发酵细菌也是已知的。而且，一些酿酒酵母菌株发酵C5(和C6)糖。实例为能够发酵C5糖的酵母属菌种的经遗传修饰的菌株，包括，例如，Ho等，1998，Applied and Environmental Microbiology，p.1852-1859和Karhumaa等，2006，Microbial Cell Factories 5：18和Kuyper等，2005，FEMS Yeast Research 5：925-934中关注的那些。

某些发酵生物的发酵性能可受发酵培养基中的抑制剂的存在所抑制，因此减少了乙醇产生能力。已知在生物质水解物中的化合物和高浓度的乙醇抑制某些酵母细胞的发酵能力。预适应或适应方法可减少该抑制作用。通常酵母细胞的预适应或适应涉及在发酵前顺序地培养酵母细胞，以增加所述酵母的发酵性能并增加乙醇产生。酵母预适应和适应方法在本领域为已知的。上述方法可包括例如在粗生物质水解物的存在下培养酵母细胞；在抑制剂例如酚化合物、糠醛和有机酸的存在下培养酵母细胞；在非抑制量的乙醇存在下培养酵母细胞；以及在酵母培养物中补充乙醛。在一个实施例中，所述发酵生物为在发酵之前进行一种或多种预适应或适应方法的酵母菌株。

某些发酵生物如酵母需要足够的氮源以供繁殖和发酵。许多氮源可供使用，且上述氮源在本领域是众所周知的。在一个实施方案中，使用了低成本的氮源。这样的低成本氮源可为有机的，如尿素，DDG，湿饼(wet cake)或玉米醪(corn mash)，或无机的，例如氨或氢氧化铵。

适用于乙醇产生的商业上可得到的酵母包括，例如，ETHANOL RED^TM酵母(可由Fermentis/Lesaffre，USA得到)，FALI^TM(可由Fleischmann’s Yeast，USA得到)，SUPERSTART和THERMOSACC^TM新鲜酵母(可由EthanolTechnology，WI，USA得到)，BIOFERM AFT和XR(可由NABC-NorthAmerican Bioproducts Corporation，GA，USA得到)，GERT STRAND(可由GertStrandAB，Sweden得到)，以及FERMIOL(可由DSM Specialties得到)。

酶

在本发明的方法或工艺的上下文中，即使未特别提及，也可理解的是酶以及其它化合物是以有效量使用的。可使用一种或多种酶。

本文所使用的短语“纤维素分解活性”应理解为包括具有纤维二糖水解酶活性(EC 3.2.1.91)的酶，例如，纤维二糖水解酶I和纤维二糖水解酶II，以及具有内切葡聚糖酶活性(EC 3.2.1.4)和β-葡糖苷酶活性(EC3.2.1.21)的酶。

在一个优选实施方案中，所述纤维素分解活性可为真菌来源的酶制备物的形式，如来自木霉属(Trichoderma)的菌株，优选里氏木霉(Trichoderma reesei)的菌株；腐质霉属(Humicola)的菌株，优选特异腐质霉(Humicola insolens)的菌株；或金孢子菌属(Chrysosporium)的菌株，优选Chrysosporium lucknowense的菌株。

所述纤维素分解酶制备物可含有一种或多种下述活性：酶、半酶(hemienzyme)、纤维素分解酶增强活性、β-葡糖苷酶活性、内切葡聚糖酶、纤维二糖水解酶或木糖异构酶。

所述酶可为如PCT/US2008/065417中定义的组合物，其通过提述并入本文。例如，所述纤维素分解酶制备物包括具有纤维素分解增强活性的多肽，优选家族GH61A的多肽，优选WO 2005/074656(Novozymes)中公开的多肽。所述纤维素分解酶制备物还可包括β-葡糖苷酶，例如来源于木霉属、曲霉属或青霉属(Penicillium)菌株的β-葡糖苷酶，包括WO 2008/057637中公开的具有β-葡糖苷酶活性的融合蛋白。所述纤维素分解酶制备物还可包括CBH II酶，优选土生梭孢霉(Thielavia terrestris)纤维二糖水解酶II CEL6A。所述纤维素分解酶制备物还可包含纤维素分解酶，优选来源于里氏木霉或特异腐质霉的纤维素分解酶。

所述纤维素分解酶制备物还可包含公开于WO2005/074656中的具有纤维素分解增强活性(GH61A)的多肽；β-葡糖苷酶(公开于WO/2008057637中的融合蛋白)以及来源于里氏木霉的纤维素分解酶。

纤维素分解酶组合物可为商业上可以获得的产品1.5L或CELLUZYME^TM(可得自Novozymes A/S，Denmark)或ACCELERASE^TM1000(来自Genencor Inc.USA)。

可以加入纤维素分解酶以供水解经预处理的生物质浆料。纤维素分解酶可以以0.1-100FPU每克总固体(TS)，优选0.5-50FPU每克TS，特别是1-20FPU每克TS范围内的剂量加入。在另一个实施方案中，将至少0.1mg纤维素分解酶每克总固体(TS)，优选至少3mg纤维素分解酶每克TS，如5-10mg纤维素分解酶每克TS用于水解。

内切葡聚糖酶(EG)

在水解过程中可存在一种或多种内切葡聚糖酶。术语“内切葡聚糖酶”意指内-1，4-(1，3；1，4)-β-D-葡聚糖-4-葡聚糖水解酶(E.C.No.3.2.1.4)，其催化纤维素、纤维素衍生物(如羧甲基纤维素和羟乙基纤维素)、地衣淀粉中的1，4-β-D-糖苷联结，混合型β-1，3-葡聚糖如谷物β-D-葡聚糖或木葡聚糖，以及其它含有纤维素成分的植物材料中β-1，4-键的内水解。内切葡聚糖酶活性可使用羧甲基纤维素(CMC)水解根据Ghose，1987，Pure and Appl.Chem.59：257-268的方法确定。

内切葡聚糖酶可来源于木霉属的菌株，优选里氏木霉的菌株；腐质霉属的菌株，如特异腐质霉的菌株；或金孢子菌属的菌株，优选Chrysosporiumlucknowense的菌株。

纤维二糖水解酶(CBH)

在水解过程中可存在一种或多种纤维二糖水解酶。术语“纤维二糖水解酶”意指1，4-β-D-葡聚糖纤维二糖水解酶(E.C.3.2.1.91)，其在纤维素，纤维寡糖或任何含有β-1，4-连接的葡萄糖的聚合物中催化1，4-β-D-葡糖苷联结的水解，自链的还原或非还原末端释放纤维二糖。

纤维二糖水解酶的实例为上面提及的，包括来自里氏木霉、特异腐质霉的CBH I和CBH II；和来自土生梭孢霉的CBH II纤维二糖水解酶(CELL6A)。

纤维二糖水解酶活性可根据由Lever等，1972，Anal.Biochem.47：273-279和由van Tilbeurgh等，1982，FEBS Letters 149：152-156；van Tilbeurgh和Claeyssens，1985，FEBS Letters 187：283-288描述的方法来确定。所述Lever等的方法适用于评估玉米秸杆中纤维素的水解，而van Tilbeurgh等的方法适用于基于荧光二糖衍生物确定纤维二糖水解酶的活性。

β-葡糖苷酶

在水解过程中可存在一种或多种β-葡糖苷酶。

术语“β-葡糖苷酶”意指β-D-葡糖苷葡萄糖水解酶(E.C.3.2.1.21)，其催化末端非还原性β-D-葡萄糖残基的水解，及β-D-葡萄糖的释放。就本发明而言，β-葡糖苷酶的活性根据由Venturi等，2002，J.Basic Microbiol.42：55-66描述的基本方法确定，只是如本文所述使用不同的条件。一单位的β-葡糖苷酶活性定义为在100mM柠檬酸钠、0.01％20中在50℃、pH 5自作为底物的4mM p-硝基苯酚-β-D-吡喃葡糖苷每分钟产生1.0微摩尔的p-硝基苯酚。

所述β-葡糖苷酶可为真菌来源，例如木霉属、曲霉属或青霉属的菌株。所述β-葡糖苷酶可来源于里氏木霉，如由bgl1基因编码的β-葡糖苷酶(参见EP562003的图1)。所述β-葡糖苷酶可来源于米曲霉(根据WO 2002/095014在米曲霉中重组产生)，烟曲霉(Aspergillus fumigatus)(根据WO 2002/095014的实施例22在米曲霉中重组产生)，或黑曲霉(1981，J.Appl.第3卷，pp157-163)。

半纤维素酶

半纤维素可由半酶和/或酸水解分解以释放其五和六碳糖组分。木素纤维素衍生材料可用一种或多种半纤维素酶进行处理。可使用任何适用于水解半纤维素(优选水解为木糖)的半纤维素酶。

优选的半纤维素酶包括木聚糖酶、阿拉伯呋喃糖苷酶、乙酰木聚糖酯酶、阿魏酸酯酶，葡糖醛酸糖苷酶、内切半乳聚糖酶、甘露聚糖酶，内切或外切阿拉伯糖酶、外切半乳聚糖酶以及上述两种或更多种的混合物。优选的，用于本发明的半纤维素酶为外作用的(exo-acting)半纤维素酶，且更优选地，所述半纤维素酶为下述的外作用的半纤维素酶，其具有在pH小于7，优选3-7的酸性条件下水解半纤维素的能力。适用于本发明的半纤维素酶的实例包括VISCOZYME^TM(可自Novozymes A/S，Denmark得到)。

所述半纤维素酶可为木聚糖酶。所述木聚糖酶可优选为微生物来源的，如真菌来源的(例如，木霉属、多孔菌属(Meripilus)、腐质霉属、曲霉属、镰孢属(Fusarium))或来自细菌(例如，芽孢杆菌属(Bacillus))。所述木聚糖酶可来源于丝状真菌，优选来源于曲霉属，如棘孢曲霉(Aspergillus aculeatus)的菌株，或腐质霉属，优选疏棉状腐质霉(Humicola lanuginosa)的菌株。所述木聚糖酶可优选为内切-1，4-β-木聚糖酶，更优选GH10或GH11的内切-1，4-β-木聚糖酶。商业木聚糖酶的实例包括来自Novozymes A/S，Denmark的SHEARZYME^TM和BIOFEED WHEAT^TM。

所述半纤维素酶也可以有效水解半纤维素的量添加，如，以不溶性固体的约0.001到0.5wt％总固体(TS)，更优选约0.05到0.5wt％TS的量添加。

木聚糖酶也可以0.001-1.0g/kg干物质(DM)底物的量，优选以0.005-0.5g/kg DM底物的量，且最优选以0.05-0.10g/kg DM底物的量添加。

木糖异构酶

木糖异构酶(D-木糖酮异构酶)(E.C 5.3.1.5)为催化D-木糖变为D-木酮糖的可逆异构化反应的酶。葡糖异构酶转化D-葡萄糖到D-果糖的可逆异构化。然而，葡糖异构酶时称作木糖异构酶。

木糖异构酶可用于本发明方法或工艺，且可为任何具有木糖异构酶活性的酶，且可得自任何来源，优选细菌或真菌来源，如丝状真菌或酵母。细菌木糖异构酶的实例包括属于链霉菌属(Streptomyces)、游动放线菌属(Actinoplanes)、芽孢杆菌属和黄杆菌属(Flavobacterium)的那些，以及栖热袍菌属(Thermotoga)的，例如新阿波罗栖热袍菌(T.neapolitana)(Vieille等，1995，Appl.Environ.Microbiol.61(5)，1867-1875)和海栖热袍菌(T.maritime)。真菌木糖异构酶的实例为担子菌纲(Basidiomycetes)来源的菌种。

优选的木糖异构酶来源于酵母假丝酵母属的菌株，优选博伊丁氏假丝酵母，特别是由例如Vongsuvanlert等，1988，Agric.Biol.Chem.，52(7)：1817-1824公开的博伊丁氏假丝酵母木糖异构酶。所述木糖异构酶可优选来源于博伊丁氏假丝酵母的菌株(Kloeckera 2201)，其以DSM 70034和ATCC 48180保藏，公开于Ogata等，Agric.Biol.Chem，33，1519-1520或Vongsuvanlert等，1988，Agric.Biol.Chem，52(2)，1519-1520。

在一个实施方案中，所述木糖异构酶来源于链霉菌属的菌株，例如，来源于鼠灰链霉菌(Streptomyces murinus)的菌株(美国专利号4,687,742)、黄微绿链霉菌(S.flavovirens)、白色链霉菌(S.albus)、不产色链霉菌(S.achromogenus)、多刺链霉菌(S.echinatus)、威德莫尔链霉菌(S.wedmorensis)，其均公开于美国专利3,616,221号。其它的木糖异构酶公开于美国专利3,622,463号，美国专利4,351,903号，美国专利4,137,126号，美国专利3,625,828号，HU专利12,415号，DE专利2,417,642，JP专利69,28,473号，以及WO 2004/044129，每个均通过提述并入本文。所述木糖异构酶可为固定化或液体形式。优选液体形式。商业上可得到的木糖异构酶的实例包括来自Novozymes A/S，Denmark的SWEETZYME^TM T。添加的木糖异构酶的量提供0.01-100 IGIU每克不溶性固体范围内的活性水平。

α-淀粉酶

可使用一种或多种α-淀粉酶。优选的淀粉酶是微生物来源的，如细菌或真菌来源。虽然最适合的α-淀粉酶是基于工艺条件确定的，但本领域技术人员可容易地确定。

优选的α-淀粉酶为酸性α-淀粉酶，例如，真菌酸性α-淀粉酶或细菌酸性α-淀粉酶。短语“酸性α-淀粉酶”意指α-淀粉酶(E.C.3.2.1.1)，当其以有效量添加时，在3到7，优选3.5到6，或更优选4-5的范围内的pH具有最佳活性。

细菌α-淀粉酶

如上所示，所述α-淀粉酶可为芽孢杆菌来源。所述芽孢杆菌属α-淀粉酶可优选来源于地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)，解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)，枯草杆菌(Bacillus subtilis)或嗜热脂肪芽孢杆菌(Bacillus stearothermophilus)的菌株，但也可来源于其它芽孢杆菌属菌种。涵盖的α-淀粉酶的特定实例包括示于WO 1999/19467的SEQ ID NO：4的地衣芽孢杆菌α-淀粉酶，示于WO 1999/19467的SEQ ID NO：5的解淀粉芽孢杆菌α-淀粉酶，和示于WO 1999/19467的SEQ ID NO：3的嗜热脂肪芽孢杆菌α-淀粉酶(所有序列通过提述并入本文)。在一个实施方案中，所述α-淀粉酶可为分别与示于WO 1999/19467(通过提述并入本文)的SEQ ID NO：1，2或3中的任何序列具有至少60％，优选至少70％，更优选至少80％，甚至更优选至少90％，例如至少95％，至少96％，至少97％，至少98％或至少99％的同一性程度的酶。

所述芽孢杆菌属α-淀粉酶也可为变体和/或杂合体，特别是描述于WO1996/23873、WO 1996/23874、WO 1997/41213、WO 1999/19467、WO 2000/60059和WO 2002/10355(所有文件通过提述并入本文)中任一的变体和/或杂合体。特别涵盖的α-淀粉酶变体公开于美国专利6,093,562、6,297,038号或美国专利6,187,576号(通过提述并入本文)，并包括在位置R179到G182具有一个或两个氨基酸缺失的嗜热脂肪芽孢杆菌α-淀粉酶(BSG α-淀粉酶)变体，优选WO1996/023873公开的双缺失-参见，例如，第20页第1-10行(通过提述并入本文)，优选与WO 1999/19467公开的SEQ ID NO：3所列的野生型BSGα-淀粉酶氨基酸序列相比对应于Δ(181-182)，或使用WO 1999/19467中的SEQ ID NO：3的编号方式缺失氨基酸R179和G180。甚至更优选的是芽孢杆菌属α-淀粉酶，特别是嗜热脂肪芽孢杆菌α-淀粉酶，其较之WO 99/19467公开的SEQ ID NO：3所列的野生型BSGα-淀粉酶氨基酸序列具有对应于Δ(181-182)的双缺失，且进一步包括N193F取代(也表示为I181^*+G182^*+N193F)。

细菌杂合体α-淀粉酶

可使用一种或多种细菌杂合体淀粉酶。特别涵盖的杂合体α-淀粉酶包括地衣芽孢杆菌α-淀粉酶(示于WO 99/19467的SEQ ID NO：4)的445个C-末端氨基酸残基，以及来源于解淀粉芽孢杆菌的α淀粉酶(示于WO 99/19467的SEQ ID NO：5)的37个N-末端氨基酸残基，并具有下列取代中的一个或多个，特别是全部：

G48A+T49I+G107A+H156Y+A181T+N190F+I201F+A209V+Q264S(使用WO 99/19467的SEQ ID NO：4的地衣芽孢杆菌编号)。也优选具有一个或更多下述突变的变体(或在其它芽孢杆菌属α-淀粉酶骨架中的对应突变)：H154Y，A181T，N190F，A209V和Q264S和/或位置176和179之间两个残基的缺失，优选E178和G179的缺失(使用WO 99/19467的SEQ ID NO：5编号)。

真菌α-淀粉酶

可使用一种或多种真菌α-淀粉酶。真菌α-淀粉酶包括来源于曲霉属菌株的α-淀粉酶，如米曲霉(Aspergillus oryzae)，黑曲霉(Aspergillus niger)和川地曲霉(Aspergillis kawachii)α-淀粉酶。

优选的酸性真菌α-淀粉酶为Fungamyl样α-淀粉酶，其来源于米曲霉的菌株。短语“Fungamyl样α-淀粉酶”指下述的α-淀粉酶，即与WO 1996/23874的SEQ ID NO：10中所示氨基酸序列的成熟部分显示高同一性，即，多于70％，多于75％，多于80％，多于85％，多于90％，多于95％，多于96％，多于97％，多于98％，多于99％或甚至100％的同一性。

另一个优选的酸性α-淀粉酶来源于黑曲霉的菌株。所述酸性真菌α-淀粉酶可为来自黑曲霉，作为“AMYA_ASPNG”以原始登录号P56271公开于Swiss-prot/TeEMBL数据库中，并描述于WO 1989/01969(实施例3)。来源于黑曲霉的商业上可得到的酸性真菌α-淀粉酶是SP288(可由Novozymes A/S，Denmark得到)。

所述真菌α-淀粉酶也可为包含淀粉结合域(SBD)和α-淀粉酶催化域的野生型酶(即非杂合体)或其变体。在一个实施方案中，所述野生型α-淀粉酶可来源于川地曲霉(Aspergillus kawachii)的菌株。

其它涵盖的野生型α-淀粉酶包括来源于根毛霉属(Rhizomucor)和多孔菌属(Meripilus)的菌株，优选微小根毛霉(Rhizomucor pusillus)(WO 2004/055178通过提述并入本文)或巨多孔菌(Meripilus giganteus)菌株的那些α-淀粉酶。

在一个优选实施方案中，所述α-淀粉酶来源于川地曲霉，并如Kaneko等1996，J.Ferment.Bioeng.81：292-298“Molecular-cloning and determinationof the nucleotide-sequence of a gene encoding an acid-stable α-amylase fromAspergillus kawachii”公开，并进一步作为EMBL：#AB008370公开。

真菌杂合体α-淀粉酶

可使用一种或多种真菌杂合体α-淀粉酶。所述真菌酸性α-淀粉酶可为杂合体α-淀粉酶。真菌杂合体α-淀粉酶的实例包括公开于WO 2005/003311或美国申请公开2005/0054071号(Novozymes)或美国专利申请60/638,614号(Novozymes)中的那些，将其通过提述并入本文。杂合体α-淀粉酶可包括α-淀粉酶催化域(CD)和糖结合域/模块(CBM)，如淀粉结合域，以及任选的接头。

所涵盖的杂合体α-淀粉酶的特定实例包括美国专利申请号60/638,614实施例中的表1到5中公开的那些，包括具有催化域JA118和罗耳阿太菌(Athelia rolfsii)SBD(US申请60/638,614号中的SEQ ID NO：100)的Fungamyl变体，具有罗耳阿太菌AMG接头和SBD(US申请60/638,614号中的SEQ IDNO：101)的微小根毛霉α-淀粉酶，具有黑曲霉葡糖淀粉酶接头和SBD的微小根毛霉α-淀粉酶(其作为美国申请号11/316,535中氨基酸序列SEQ ID NO：20，SEQ ID NO：72和SEQ ID NO：96的组合公开于表5)，或作为WO2006/069290中表5中的V039，和具有罗耳阿太菌葡糖淀粉酶接头和SBD的巨多孔菌α-淀粉酶(US 60/638,614中的SEQ ID NO：102)。其它特别涵盖的杂合体α-淀粉酶为美国申请号11/316,535和WO 2006/069290(每个均通过提述并入本文)实施例4中表3、4、5和6中所列的任何杂合体α-淀粉酶。

涵盖的杂合体α-淀粉酶的其它特定实例包括美国申请公开2005/0054071号中公开的那些，包括第15页表3公开的那些，如具有川地曲霉接头和淀粉结合域的黑曲霉α-淀粉酶。

也涵盖下述α-淀粉酶，其与任何上面提及的α-淀粉酶显示高同一性，即，与成熟酶序列显示多于70％，多于75％，多于80％，多于85％，多于90％，多于95％，多于96％，多于97％，多于98％，多于99％或甚至100％同一性。

酸性α-淀粉酶可根据本发明以0.1至10AFAU/g DS，优选0.10至5AFAU/g DS，特别是0.3至2AFAU/g DS的量添加。

商业性α-淀粉酶产品

优选的包含α-淀粉酶的商业组合物包括来自DSM的MYCOLASE^TM、BAN^TM、TERMAMYL^TMSC、FUNGAMYL^TM、LIQUOZYME^TM X和SAN^TMSUPER、SAN^TM EXTRA L(Novozymes A/S)和CLARASE^TM L-40,000、DEX-LO^TM、SPEZYME^TM FRED、SPEZYME^TMAA和SPEZYME^TM DELTAAA(Genencor Int.)，以及以商品名SP288出售的酸性真菌α-淀粉酶(可由Novozymes A/S，Denmark得到)。

糖源生成酶

短语“糖源生成酶”包括葡糖淀粉酶(其为葡萄糖生成者)，β-淀粉酶和产麦芽糖淀粉酶(其为麦芽糖生成者)。糖源生成酶能够产生碳水化合物，其可由所述发酵生物用作能量源，例如，当用于工艺以供产生发酵产物，例如乙醇时。所产生的碳水化合物可直接或间接的转化为期望的发酵产物，优选乙醇。可存在糖源生成酶的混合物。特别涵盖的混合物为至少葡糖淀粉酶和α-淀粉酶，特别是酸性淀粉酶，甚至更优选酸性真菌α-淀粉酶的混合物。

葡糖淀粉酶

可使用一种或多种葡糖淀粉酶。根据本发明使用的葡糖淀粉酶可来源于任何合适的来源，例如来源于微生物或植物。优选的葡糖淀粉酶是真菌或细菌来源的，选自下组：曲霉属葡糖淀粉酶，特别是黑曲霉G1或G2葡糖淀粉酶(Boel等，1984，EMBO J.3(5)：p.1097-1102)，及其变体，如公开于WO1992/00381，WO 2000/04136和WO 2001/04273(来自Novozymes，Denmark)的那些；公开于WO 8194/02921的泡盛曲霉(A.awamori)葡糖淀粉酶，米曲霉葡糖淀粉酶(Agric.Biol.Chem.，1991，55(4)：p.941-949)，及其变体或片段。其它曲霉属葡糖淀粉酶变体包括具有增强的热稳定性的变体：G137A和G139A(Chen等，1996，Prot.Eng.9：499-505)；D257E和D293 E/Q(Chen等，1995，Prot.Eng.8，575-582)；N182(Chen等，1994，Biochem.J.301：275-281)；二硫键、A246C(Fierobe等，1996，Biochemistry，35：8698-8704)；以及在A435和S436位置导入Pro残基(Li等，1997，Protein Eng.10：1199-1204)。

其它的葡糖淀粉酶包括罗耳阿太菌(之前表示为罗耳伏革菌(Corticiumrolfsii))葡糖淀粉酶(参见美国专利4,727,026号和Nagasaka等，1998，“Purification and properties of the raw-starch-degrading glucoamylases fromCorticium rolfsii，Appl Microbiol Biotechnol.50：323-330)，以及踝节菌属(Talaromyces)葡糖淀粉酶，特别是来源于埃莫森踝节菌(Talaromyces emersonii)(WO 1999/28448)、Talaromyces leycettanus(美国专利Re.32,153号)、杜邦踝节菌(Talaromyces duponti)和嗜热踝节菌(Talaromyces thermophilus)(美国专利4,587,215号)。

涵盖的细菌葡糖淀粉酶包括来自梭菌属，特别是热解淀粉梭菌(C.thermoamylolyticum)(EP 135，138)和热硫化氢梭菌(C.thermohydrosulfuricum)(WO 1986/01831)以及瓣环栓菌(Trametes cingulata)，其披露于WO2006/069289(通过提述并入本文)。

还涵盖了杂合体葡糖淀粉酶。所述杂合体葡糖淀粉酶的实例公开于WO2005/045018。具体实例包括公开于WO 2005/045018实施例1表1和4的杂合体葡糖淀粉酶，其以其教导杂合体葡糖淀粉酶的程度通过提述并入本文。

还涵盖了与任何上面提及的葡糖淀粉酶显示高同一性的葡糖淀粉酶，即，与成熟酶序列显示多于70％，多于75％，多于80％，多于85％，多于90％，多于95％，多于96％，多于97％，多于98％，多于99％或甚至100％的同一性。

商业上可得到的包含葡糖淀粉酶的组合物包括AMG 200L、AMG 300L、SAN^TM SUPER、SAN^TM EXTRA L、SPIRIZYME^TM PLUS、SPIRIZYME^TMFUEL、SPIRIZYME^TM B4U和AMG^TM E(来自Novozymes A/S)；OPTIDEX^TM300(来自Genencor Int.)；AMIGASE^TM和AMIGASE^TM PLUS(来自DSM)；G-ZYME^TM G900、G-ZYME^TM和G990 ZR(来自Genencor Int.)。

葡糖淀粉酶可以以0.02-20 AGU/g DS，优选0.1-10 AGU/g DS，特别是在1-5 AGU/g DS，如0.5 AGU/g DS的量添加。

β-淀粉酶

可使用一种或多种β-淀粉酶。术语“β-淀粉酶”(E.C 3.2.1.2)为传统上给予外作用的(exo-acting)产麦芽糖淀粉酶的名称，其催化直链淀粉、支链淀粉以及相关的葡萄糖聚合物中1，4-α-葡糖苷联结的水解。自非还原的链末端以逐步的方式连续移除麦芽糖单元直至分子降解，或者，在支链淀粉的情况下，直至到达分枝点。释放的麦芽糖具有β异头物构象，由此得到β-淀粉酶的名称。

已经从多种植物和微生物中分离了β-淀粉酶(W.M.Fogarty和C.T.Kelly，Progress in Industrial Microbiology，第15卷，pp.112-115，1979)。这些β-淀粉酶的特征在于具有40℃到65℃的最适温度以及4.5到7的最适pH。来自大麦的商业上可得到的β-淀粉酶为来自Novozymes A/S，Denmark的NOVOZYM^TM WBA和来自Genencor Int.，USA的SPEZYME^TM BBA 1500。

产麦芽糖淀粉酶

可使用一种或多种产麦芽糖淀粉酶。淀粉酶也可为产麦芽糖α-淀粉酶。“产麦芽糖α-淀粉酶”(葡聚糖1，4-α-麦芽糖水解酶，E.C.3.2.1.133)能够将直链淀粉和支链淀粉水解成α构象的麦芽糖。来自嗜热脂肪芽孢杆菌菌株NCIB 11837的产麦芽糖淀粉酶商业上可由Novozymes A/S得到。产麦芽糖的α-淀粉酶描述于美国专利4,598,048，4,604,355和6,162,628号，其通过提述并入本文。

所述产麦芽糖淀粉酶可以0.05-5mg总蛋白/克DS或0.05-5MANU/g DS的量添加。

蛋白酶

蛋白酶可在水解、发酵或同时水解和发酵过程中添加。可添加蛋白酶在发酵过程中反絮凝发酵生物，特别是酵母。所述蛋白酶可为任何蛋白酶。在一个优选实施方案中，所述蛋白酶为微生物来源的酸性蛋白酶，优选真菌或细菌来源的。酸性真菌蛋白酶是优选的，但也可使用其它蛋白酶。

合适的蛋白酶包括微生物蛋白酶，例如真菌和细菌蛋白酶。优选的蛋白酶为酸性蛋白酶，即，特征为能够在pH7以下的酸性条件下水解蛋白质的蛋白酶。

涵盖的酸性真菌蛋白酶包括来源于曲霉属，毛霉属(Mucor)、根霉属(Rhizopus)、假丝酵母属、革盖菌属(Coriolus)、内座壳属(Endothia)、虫霉属(Enthomophtra)、耙齿菌属(Irpex)、青霉属(Penicillium)、小核菌属(Sclerotium)和球拟酵母属(Torulopsis)的真菌蛋白酶。特别涵盖的是来源于黑曲霉(参见，例如，Koaze等，1964，Agr.Biol.Chem.Japan，28，216)，斋藤曲霉(Aspergillussattoi)(参见，例如，Yoshida，1954，J.Agr.Chem.Soc.Japan，28，66)，泡盛曲霉(Hayashida等，1977 Agric.Biol.Chem.，42(5)，927-933)，棘孢曲霉(WO1995/02044)或米曲霉的蛋白酶，如pepA蛋白酶，以及来自微小毛霉(Mucorpusillus)和米黑毛霉(Mucor miehei)的酸性蛋白酶。

还涵盖了中性或碱性蛋白酶，如来源于芽孢杆菌属菌株的蛋白酶。例如，本发明涵盖的蛋白酶来源于解淀粉芽孢杆菌，且具有在Swissprot可作为登录号P06832得到的序列。也涵盖与在Swissprot可作为登录号P06832得到的氨基酸序列具有至少90％同一性，如至少92％，至少95％，至少96％，至少97％，至少98％或特别为至少99％同一性的蛋白酶。

进一步涵盖的是与WO 2003/048353中作为SEQ ID NO：1公开的氨基酸序列具有至少90％的同一性，如至92％，至少95％，至少96％，至少97％，至少98％或特别为至少99％的同一性的蛋白酶。

还涵盖木瓜蛋白酶样蛋白酶，如E.C.3.4.22.*(半胱氨酸蛋白酶)内的蛋白酶，如EC 3.4.22.2(木瓜蛋白酶)、EC 3.4.22.6(木瓜凝乳蛋白酶)、EC 3.4.22.7(萝藦蛋白酶(asclepain))、EC 3.4.22.14(猕猴桃蛋白酶(actinidain))、EC3.4.22.15(组织蛋白酶L)、EC 3.4.22.25(甘氨酰内肽酶)和EC 3.4.22.30(番木瓜蛋白酶(caricain))。

在一个实施方案中，所述蛋白酶可来源于曲霉属，如米曲霉的菌株的蛋白酶制备物。在另一个实施例中，所述蛋白酶可来源于根毛霉属，优选曼赫根毛霉(Rhizomucor miehei)的菌株。在另一个涵盖的实施方案中，所述蛋白酶可为蛋白酶制备物，优选来源于曲霉属(如米曲霉)的菌株的蛋白水解制备物以及来源于根毛霉属(优选曼赫根毛霉)的菌株的蛋白酶的混合物。

天冬氨酸蛋白酶描述于，例如，Handbook of Proteolytic Enzymes，A.J.Barrett，N.D.Rawlings和J.F.Woessner编，Academic Press，San Diego，1998，Chapter 270)。天冬氨酸蛋白酶的合适的实例包括，例如，R.M.Berka等，Gene，96，313)(1990)；(R.M.Berka等Gene，125，195-198)(1993)；以及Gomi等，Biosci.Biotech.Biochem.57，1095-1100(1993)公开的那些，其通过提述并入本文。

商业上可得到的产品包括ESPERASE^TM、FLAVOURZYME^TM、PROMIX^TM、NOVOZYM^TMFM 2.0L、以及NOVOZYM^TM 50006(可由Novozymes A/S、Denmark得到)以及来自Genencor Int.，Inc.USA.的GC106^TM和SPEZYME^TM FAN。

所述蛋白酶可以0.0001-1mg酶蛋白每克DS，优选0.001到0.1mg酶蛋白每克DS的量存在。或者，所述蛋白酶可以0.0001到1LAPU/g DS，优选0.001到0.1LAPU/g DS和/或0.0001到1mAU-RH/g DS，优选0.001到0.1mAU-RH/g DS的量存在。

本申请描述和要求保护的发明的范围不受本文公开的具体实施方案的限制，因为这些实施方案旨在说明本发明的数个方面。任何等同的实施方案以及所述实施方案中一种或多种的组合意欲在本发明的范围内。根据上文的描述，除本文所示和描述的修饰之外对本发明的多种修饰对于本领域技术人员会是显而易见的。这些修饰也意欲落入所附权利要求的范围内。

此处引用了多篇文献，将它们公开的内容通过提述以整体并入。通过以下实施例进一步描述本发明，不应将这些实施例理解为对本发明范围的限制。

材料和方法

同一性

两个氨基酸序列或两个核苷酸序列间的相关性由参数“同一性”描述。

就本发明而言，两个氨基酸序列间的同一性程度可通过Clustal方法(Higgins，1989，CABIOS 5：151-153)使用LASERGENE^TM MEGALIGN^TM软件(DNASTAR，Inc.，Madison，WI)及同一性表和下述多重比对(multiplealignment)参数确定：缺口罚分为10，而缺口长度罚分为10。配对比对参数(pairwise alignment parameter)为K元组(Ktuple)＝1，缺口罚分＝3，窗口＝5和对角线＝5。

就本发明而言，两个多核苷酸序列间的同一性可通过Wilbur-Lipman方法(Wilbur和Lipman，1983，Proceedings of the National Academy of ScienceUSA 80：726-730)使用LASERGENE^TM MEGALIGN^TM软件(DNASTAR，Inc.，Madison，WI)及同一性表和下述多重比对参数确定：缺口罚分为10，而缺口长度罚分为10。配对比对参数为K元组＝3，缺口罚分＝3和窗口＝20。

蛋白质测定法

AZCL-酪蛋白测定法

将0.2％蓝色底物AZCL-酪蛋白溶液搅拌悬于硼砂/NaH₂PO₄缓冲液pH 9中。一边搅拌一边将所述溶液分配到微滴定板上(每孔100μL)，添加30μL酶试样，然后将板在Eppendorf热混合器中在45℃和600rpm温育30分钟。使用变性的酶试样(100℃沸腾20分钟)作为空白。在温育后，通过将微滴定板转移至冰上而终止反应，且通过在4℃以3000rpm离心5分钟来分离有色溶液与固体。将60μL上清转移至微滴定板，并使用BioRad微板读数器测定在595nm的吸光度。

pNA测定法

将50μL含蛋白酶的试样添加至微滴定板，并通过添加100μL 1mM pNA底物(5mg溶于100μL DMSO，并进一步用硼砂/NaH₂PO₄缓冲液pH9.0稀释至10mL)来起始所述测定法。监测OD₄₀₅在室温的增加作为蛋白酶活性的量度。

葡糖淀粉酶活性(AGU)

葡糖淀粉酶活性可以以葡糖淀粉酶单位(AGU)测定。

Novo葡糖淀粉酶单位(AGU)定义为在37℃，pH4.3，底物：麦芽糖23.2mM，缓冲液：乙酸盐0.1M，反应时间5分钟的标准条件下每分钟水解1微摩尔麦芽糖的酶量。

可使用自动分析仪系统。将变旋酶(mutarotase)添加到葡萄糖脱氢酶试剂中，使得存在的任何α-D-葡萄糖转化为β-D-葡萄糖。葡萄糖脱氢酶特异性地与β-D-葡萄糖在上述反应中反应，形成NADH，其使用光度计在340nm处测定作为起始葡萄糖浓度的量度。

  AMG温育：  底物：  麦芽糖23.2mM  缓冲液：  乙酸盐0.1M  pH：  4.30±0.05  温育温度：  37℃±1

  反应时间：  5分钟  酶工作范围：  0.5-4.0 AGU/mL

  颜色反应：  GlucDH：  430U/L  变旋酶：  9U/L  NAD：  0.21mM  缓冲液：  磷酸盐0.12M；0.15M NaCl  pH：  7.60±0.05  温育温度  37℃±1  反应时间：  5分钟  波长：  340nm

更详细描述此分析方法的文件夹(EB-SM-0131.02/01)可根据要求由Novozymes A/S，Denmark得到，其通过提述并入本文。

α-淀粉酶活性(KNU)

α-淀粉酶活性可使用马铃薯淀粉作为底物来确定。该方法基于酶对于改性马铃薯淀粉的分解，并通过将淀粉/酶溶液的样本与碘溶液混合来跟踪反应。起初，形成了蓝黑色(blackish blue)，但在淀粉分解过程中，蓝色越来越淡，并逐渐变为红棕色(reddish-brown)，将其和有色玻璃标准(colored glassstandard)进行比较。

一个千Novo α-淀粉酶单位(KNU)定义为在标准条件下(即，在37℃+/-0.05；0.0003 M Ca²⁺；以及pH 5.6)糊精化5260mg的淀粉干物质MerckAmylum Solubile所需的酶量。

更详细描述该分析方法的文件夹EB-SM-0009.02/01可根据要求由Novozymes A/S，Denmark得到，其通过提述并入本文。

酸性α-淀粉酶活性(AFAU)

当根据本发明使用时，酸性α-淀粉酶的活性可以以AFAU(酸性真菌α-淀粉酶单位)测定。或者，酸性α-淀粉酶的活性可以以AAU(酸性α-淀粉酶单位)测定。

酸性α-淀粉酶单位(AAU)

酸性α-淀粉酶活性可以AAU(酸性α-淀粉酶单位)测定，其为绝对方法。一个酸性淀粉酶活性(AAU)为在标准化条件下每小时将1g淀粉(100％干物质)转化为下述产物的酶量，所述产物在与已知浓度的碘溶液反应后在620nm的透射与颜色参照之一相同。

标准条件/反应条件

底物：      可溶性淀粉，浓度约20g DS/L

缓冲液：    柠檬酸盐，约0.13M，pH＝4.2

碘溶液：    40.176g碘化钾+0.088g碘/L

自来水：    15°-20°dH(德国硬度)

pH：         4.2

温育温度：   30℃

反应时间：   11分钟

波长         620nm

酶浓度：     0.13-0.19AAU/mL

酶的工作范围 0.13-0.19AAU/mL

所述淀粉应为Litner淀粉。其为在实验室中用作比色指示剂的稀糊淀粉。Litner通过用稀盐酸处理天然淀粉而得到，因而其保留与碘变蓝色的能力。进一步的细节可见于EP 0140,410 B2，其通过提述并入本文。

确定FAU-F

FAU-F真菌α-淀粉酶单位(Fungamyl)相对于已知强度的酶标准物进行测量。

更详细描述该分析方法的文件夹(EB-SM-0216.02)可根据要求由Novozymes A/S，Denmark得到，其通过提述并入本文。

酸性α-淀粉酶活性(AFAU)

酸性α-淀粉酶活性可以AFAU(酸性真菌α-淀粉酶单位)进行测量，其相对于酶标准物来确定。1AFAU定义为在下面提及的标准条件下每小时降解5.260mg淀粉干物质的酶量。

酸性α-淀粉酶，其为内切α-淀粉酶(1，4-α-D-葡聚糖-葡聚糖水解酶，E.C.3.2.1.1)水解淀粉分子内部区域中的α-1，4-葡糖苷键以形成具有不同链长的寡糖和糊精。与碘形成的颜色的强度与淀粉浓度成正比。使用反向比色法(reversecolorimetry)在规定的分析条件下测定淀粉浓度的降低作为淀粉酶活性。

α-淀粉酶

淀粉+碘    →                  糊精+寡糖

λ＝590nm  40℃，pH 2.5

蓝色/紫色  t＝23秒             脱色

标准条件/反应条件

底物：        可溶性淀粉，大约0.17g/L

缓冲液：    柠檬酸盐，大约0.03M

碘(I₂)：    0.03g/L

CaCl₂：     1.85mM

pH：        2.50±0.05

温育温度：  40℃

反应时间：  23秒

波长：      590nm

酶浓度：    0.025AFAU/mL

酶工作范围：0.01-0.04AFAU/mL

更详细描述该分析方法的文件夹EB-SM-0259.02/01可根据要求由Novozymes A/S，Denmark得到，其通过提述并入本文。

使用滤纸分析法(FPU分析法)测定纤维素酶活性

方法来源

本方法公开于Adney，B.和Baker，J.1996.Laboratory Analytical Procedure，LAP-006，National Renewable Energy Laboratory(NREL)的题为“Measurementof Cellulase Activities”的文件。其基于供测定纤维素酶活性的IUPAC方法(Ghose，T.K.，1987，Measurement of Cellulse Activities，Pure & Appl.Chem.59，pp.257-268)。

方法

该方法如Adney和Baker，1996，见上文所述实施，只是使用96孔板来读取显色后的吸光度值，如下文所述。

酶测定管：

将成卷的(rolled)滤纸条(#1 Whatman；1X 6cm；50mg)添加至试管(13X100mm)的底部。

向管中添加1.0mL 0.05M柠檬酸钠缓冲液(pH 4.80)。

将含有滤纸和缓冲液的管在循环水浴中在50℃(±0.1℃)温育5分钟。

温育后，向管中添加0.5mL柠檬酸盐缓冲液中的酶稀释液。

酶稀释液设计成产生略高于和略低于目标值2.0mg葡萄糖的值。

通过温和涡旋震荡3秒将管内容物混合。

涡旋震荡后，将管在循环水浴中在50℃(±0.1℃)温育60分钟。

在60分钟温育后立即将管从水浴中取出，并向每个管中添加3.0mLDNS试剂以终止反应。将管涡旋震荡3秒钟以混合。

2.3空白和对照

通过向试管中添加1.5mL柠檬酸盐缓冲液来制备试剂空白。

通过将成卷的滤纸条置于试管的底部并添加1.5mL柠檬酸盐缓冲液来制备底物对照。

通过将1.0mL柠檬酸盐缓冲液与0.5mL适宜的酶稀释液混合来制备每种酶稀释液的酶对照。

以与酶测定管相同的方式测定试剂空白、底物对照和酶对照，而且与酶测定管一起进行。

葡萄糖标准品

制备100mL葡萄糖储液(10.0mg/mL)，并冷冻5mL等分试样。在使用前，将等分试样解冻并涡旋震荡以混合。

如下在柠檬酸盐缓冲液中制备储液的稀释液：

G1＝1.0mL储液+0.5mL缓冲液＝6.7mg/mL＝3.3mg/0.5mL

G2＝0.75mL储液+0.75mL缓冲液＝5.0mg/mL＝2.5mg/0.5mL

G3＝0.5mL储液+1.0mL缓冲液＝3.3mg/mL＝1.7mg/0.5mL

G4＝0.2mL储液+0.8mL缓冲液＝2.0mg/mL＝1.0mg/0.5mL

通过向1.0mL柠檬酸盐缓冲液中添加0.5mL每种稀释液来制备葡萄糖标准品管。

以与酶测定管相同的方式测定葡萄糖标准品管，而且与酶测定管一起进行。

显色

在60分钟温育和添加DNS后，将所有管一起在水浴中煮沸5分钟。

煮沸后，立即将它们在冰/水浴中冷却。

冷却时，将管短暂地涡旋震荡，并让纸浆沉降。然后通过将来自每个管的50微升添加至96孔板中的200微升ddH₂O来稀释每个管。将每个孔混合，并在540nm读取吸光度。

计算(例子在NREL文件中给出)

通过将四种标准品(G1-G4)的葡萄糖浓度(mg/0.5mL)对A₅₄₀绘图来绘制葡萄糖标准曲线。这是使用线性回归(Prism Software)来拟合的，并使用该线的方程来确定每个酶测定管所生成的葡萄糖。

绘制所生成的葡萄糖(mg/0.5mL)对总酶稀释度的曲线，其中Y轴(酶稀释度)为对数标度。

在生成刚刚高于2.0mg葡萄糖的酶稀释度与生成刚刚低于该值的稀释度之间画一条线。根据此线确定会精确生成2.0mg葡萄糖的酶稀释度。

如下计算滤纸单位/mL(FPU/mL)：

FPU/mL＝0.37/生成2.0mg葡萄糖的酶稀释度

实施例

测试了DDG的添加对糖产量的影响。在预处理之前，将DDG添加至经磨制的干玉米秸秆。在水解开始后24、48和72小时测量糖含量。

纤维素酶制备物A：纤维素酶制备物A是包含具有WO 2005/074656中公开的纤维素分解增强活性(GH61A)的多肽；β-葡糖苷酶(公开于WO2008/057637)的融合蛋白)；和来源于里氏木霉的纤维素分解酶制备物的纤维素分解组合物。纤维素酶制备物A公开于共同未决的国际申请PCT/US2008/065417号

DDG从ADKINS ENERGY LLC(Lena，IL)获得。将纤维素酶制备物A以6mg酶蛋白/g TS的量以5％TS加载用于水解。将磨制的玉米秸秆与DDG混合，并在稀H₂SO₄(基于干固体为1％，固体对液体1∶10)中制浆。将制浆的混合物在沙浴中在170℃热处理8分钟。将DDG以4wt.％DDG的量(基于玉米秸秆)和16wt.％DDG(基于玉米秸秆)的量添加。在添加纤维素酶制备物A之前洗涤用DDG预处理的玉米秸秆。将洗涤的混合物在50℃通过纤维素酶制备物A水解。释放的糖含量通过YSI 7000SELECT方法(YSI LifeSciences，Yellow Springs，OH)确定。如图1和2所示，在预处理过程中DDG的添加增加了最终的糖产量和转化率。当在预处理之前将16wt.％的DDG添加至玉米秸秆时，糖产量从18.6g/L增加至20.8g/L，而糖转化率从59.7％改进至66.8％。