对瘢痕成纤维细胞生长具有抑制作用的蛋白质的应用

摘要

本发明提供了如SEQIDNO：3所示序列的蛋白质及其在制备抑制瘢痕成纤维细胞生长和/或瘢痕形成的药物中的应用。

说明书

技术领域

本发明属于蛋白质工程技术领域，具体而言，本发明涉及对瘢痕成纤维细胞生长具有抑制作用的蛋白质的应用。

背景技术

皮肤的瘢痕形成能够产生功能、容貌和心理方面的病态，因此有必要进行治疗（参见Hunt，T.K.，World J Surg 4(3)：271-7(1980)；Nicolai，J.P.等，11(1)：29-32(1987)）。常规的瘢痕治疗包括，手术、注射皮质类固醇、放疗、硅胶薄膜敷贴和压力疗法等（参见Mustoe，T.A.等，Plast Reconstr Surg，110(2)：560-71(2002)）。这些方法大都治疗效果不好，有的副作用很大甚至影响修复和愈合。因此，寻求新的促修复分子，既能正向加速修复细胞增殖、促进愈合，又能降低胶原合成、负向调节瘢痕的形成，使两个矛盾的过程协调统一，对促进创伤愈合尤其是放创复合伤、大面积创伤、烧伤等难愈伤口愈合和具有纤维化倾向的组织修复，降低瘢痕形成，改善修复质量有着十分重要的意义。

皮肤瘢痕形成的发病机制和生物学模式尚未完全知晓。瘢痕形成的特征在于生长超出了原始外伤部位周边，与家族因素有关，并很少退化（参见Tredget，E.E.，Ann N Y Acad Sci，888：165-82(1999)）。增生性瘢痕是增生性红斑状纤 维病变，经常随时间而经历分解，与组织挛缩相关（参见Tredget，E.E.，Ann N Y Acad Sci，888：165-82(1999)）。尽管瘢痕疙瘩和增生性瘢痕在遗传连锁和免疫学参数方面不同，但二者均与成纤维细胞过度增殖和过量胞外基质(ECM)沉积相关(参见Rockwell，W.B.等，Plast Reconstr Surg，84(5)：827-37；Tsao，S.S.等，Semin Cutan Med Surg，21(1)：46-75(2002)；Nemeth，A.J.，J Dermatol Surg Oncol 19(8)：738-46(1993))。中国专利申请第201010106424.8号公开了一种人ski基因编码的蛋白质，其能够用于治疗皮肤瘢痕。

本发明人令人惊讶地从现有蛋白质中发现了一种新的蛋白质及其片段的应用，其对瘢痕成纤维细胞生长具有抑制作用，为皮肤瘢痕的治疗提供了新的分子，而且分子量可以较小，更适宜减轻工程菌负担从而使得表达量增加。

发明内容

本发明的目的在于提供一种新的蛋白质应用，其中所述蛋白质对瘢痕成纤维细胞生长具有抑制作用，为皮肤瘢痕的治疗提供了新的分子，而且该分子可以较短。本发明的有益效果是能够用于皮肤瘢痕的治疗，而且蛋白质的抑制瘢痕成纤维细胞生长的活性高，分子量可以较小，且活性成剂量依赖性。

具体而言，本发明提供了如SEQ ID NO：3所示序列的蛋白质。该蛋白质是本发明人长期研究获得的截短后的蛋白，甚至截去部分现有公开的蛋白质的结构域片段，在本发明人发现生物活性之前，无法被预期还能保持相应功能用途。

本发明还提供了包含如SEQ ID NO：3所示序列的蛋白质在制备抑制瘢痕成纤维细胞生长的药物中的应用。

其中，所述蛋白质的序列如SEQ ID NO：2所示。

其中，所述蛋白质的序列如SEQ ID NO：3所示。

其中，所述蛋白质是单独应用的，即本发明提供了包含如SEQ ID NO：3所示序列的蛋白质单独作为有效成分在制备抑制瘢痕成纤维细胞生长的药物中的应用。

另外，本发明还提供了包含如SEQ ID NO：3所示序列的蛋白质在制备抑制瘢痕形成的药物中的应用。

其中，所述蛋白质的序列如SEQ ID NO：2所示。

其中，所述蛋白质的序列如SEQ ID NO：3所示。

其中，所述蛋白质是单独应用的，即本发明提供了包含如SEQ ID NO：3所示序列的蛋白质单独作为有效成分在制备抑制瘢痕形成的药物中的应用。

另外，本发明还提供了包含如SEQ ID NO：3所示序列的蛋白质的制备方法，其包括：

（1）以如SEQ ID NO：1所示的 cDNA为模板，使用引物5’-TACCATATGACGATCGCATCGC-3’和 5’-TGGGATCCTCTAGGACGTGAT-3’进行PCR扩增；

（2）PCR扩增用NdeⅠ及BamHI酶双酶切后，克隆入pET-28a载体，构建成重组载体；

（3）将上述重组载体转化入大肠杆菌表达菌株BL21（DE3）中，IPTG诱导；

（4）对表达出的目的蛋白rsRII进行包涵体纯化和复性；和

（5）将复性产物经过Ni²⁺-NTA柱纯化，优选使用凝血酶进行酶切，这样获得的蛋白质的序列如SEQ ID NO：3所示。

附图说明

图1是本发明的对瘢痕成纤维细胞生长具有抑制作用的蛋白质基因在BL21(DE3)中的诱导表达，包涵体的提取，溶解和纯化，Ni⁺柱纯化的目的蛋白的SGS-PAGE鉴定和鼠抗His6-tag 的western-blotting鉴定结果，A图中泳道1是未经IPTG诱导5h后的全菌蛋白，2是经IPTG诱导5h的全菌蛋白，3是超声裂解后沉淀，4是超声裂解后上清；B图中泳道1是经break buffer洗脱后的沉淀，2是经extraction buffer洗脱后的上清，3-5：经过不同的咪唑浓度纯化后的目的蛋白；C图是泳道1是经Ni²⁺-NTA纯化后最终目的蛋白，2是经Ni²⁺-NTA纯化后目的蛋白的Western blot。

图2A表明不同浓度的本发明的对瘢痕成纤维细胞生长具有抑制作用的蛋白质对分离的瘢痕成纤维细胞作用48小时后，对兔的瘢痕成纤维细胞有明显抑制作用，且呈剂量依赖效应。

图2B表明以40μg/ml的本发明的蛋白浓度检测在24h，48h和72h对家兔瘢痕成纤维细胞生长的抑制作用，同时也说明本发明的蛋白对人的瘢痕成纤维细胞也具有明显抑制作用（图示黑柱状图）。

具体实施方式

在本发明中所使用的术语，除非有另外说明，一般具有本领域普通技术人员通常理解的含义。下面结合具体的制备实施例和应用实施例，并参照数据进一步详细地描述本发明。应理解，这些实施例只是为了举例说明本发明，而非以任何方式限制本发明的范围。在以下的实施例中，未详细描述的各种过程和方法是本领域中的常规方法，可参见《分子克隆实验指南执行》。所用到的引物，均在首次出现时标明，其后所用相同引物，均以首次标明的内容相同。

实施例1 基因的克隆

材料：家兔，人工饲养。

（1）引物设计：化学合成如下简并的正义寡核苷酸引物F1：5’-ATGGGTCGGGGGCTGCTCNGGG-3’，与反义寡核苷酸引物R1：5’- CTATTTGGTAGT GTTNAG NGAGCCNTCT-3’（N=A, T, C or G）

（2）提取总RNA：应用RNA抽提试剂TRIzol (Invitrogen 公司)提取出家兔血液中的总RNA，并通过甲醛变性琼脂糖凝胶电泳鉴定其质量和纯度，紫外分光光度计测定其浓度。

（3）应用RT-PCR方法，以上述F1和R1为特异性引物，扩增出TGF-βRII cDNA的一段序列，全长为1704bp，克隆入pMD18-T载体（可购自Invitrogen公司），并对其碱基序列进行测定。RT-PCR的反应条件为：以总RNA为模板，在50μl反应体系中，加入5×RT-PCR反应缓冲液10μl、25mM MgSO42μl、10mM dNTP混合物1μl、20μM的上下游引物各2.5μl、AMV逆转录酶（Takara公司）1μl、pfu高保真DNA聚合酶 1μl及RNA模板 2μl，补水至50μl。RT-PCR循环参数为：48℃逆转录45min，94℃变性2 min，再进行29个PCR循环（94℃变性30s，56℃退火30s，72℃延伸30s），最后于72℃延伸7 min。RT-PCR产物用1％的琼脂糖凝胶电泳分离后，用胶回收试剂盒回收约1704bp的DNA条带，克隆入pMD18-T载体，经含Amp抗生素（50mg/ml）的琼脂糖平板筛选转化子，挑取出8个阳性克隆送往上海生工测序公司进行碱基序列测定，得到如SEQ ID NO：1所示的全长cDNA 碱基序列，其编码的氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示。

实施例2 重组载体的构建及其在大肠杆菌中的诱导表达

以实施例1得到的全长 cDNA为模板，设计引物rsF1 (5’-TACCATATGACGATCGCATCGC-3’)和 rsR1 (5’-TGGGATCCTCTAGGACGTGAT-3’)扩增出cDNA片段(简称为rsRII，其编码的氨基酸序列如SEQ ID NO：3所示)，引物分别引入酶切位点NdeⅠ及BamHI，亚克隆入pET-28a载体，构建成重组载体pET28a-rsRII。将此重组载体转入大肠杆菌表达菌株BL21（DE3），诱导表达出目的蛋白rsRII （其N端带有His-tag）。

重组目的蛋白的包涵体的纯化和复性

IPTG诱导含有重组载体pET28a-rsRII的大肠杆菌表达菌株BL21（DE3）5小时后，将500 ml诱导表达菌离心后收集的菌体用break buffer (20 mM Tris-HCl, pH 7.9, 10 mM EDTA, 1% (v/v) Sucrose，0.2 mg/ml lysozyme) 重悬, 12 000 r/min离心15 min, 弃上清,再重悬于wash buffer (20 mM Tris-HCl, pH 7.9, 4 M Urea, 5 mM EDTA, 0.5 mM DTT)，12 000 r/min离心15 min, 弃上清,再重悬于extraction buffer (50 mM Glycine, 16 mM NaOH, 5 mM GSH, 5 mM DTT, 8 M guanidine·HCl)，超声裂解后, 离心后弃沉淀，留上清经refolding buffer I (20 mM Tris-HCl, pH 7.9, 0.1 mM DTT) 在4℃透析 3h，然后经refolding buffer II (20 mM Tris-HCl, pH 7.9, 1 mM EDTA, 1 mM GSH, 0.1 mM GSSG) 在4℃透析过夜，然后过Ni²⁺-NTA柱纯化，可以用凝血酶切除N端的His-tag，再SDS-PAGE检测纯化的目的蛋白和用BCA蛋白检测试剂盒测定蛋白浓度。

western 印迹分析

Western-blot中所用一抗为羊抗His6单抗，二抗为辣根过氧化酶标记的兔抗羊IgG。其简要步骤是：将诱导的产物先行SGS-PAGE，然后以半干法将蛋白电转移至PVDF膜上，用记号笔标记蛋白marker各条带，然而依次经5％脱脂奶粉室温封闭1h，与一抗孵育12h，与HRP标记的二抗IgG孵育2h，每步完成后均严格洗膜，最后加ECL避光显色。结果如图1C所示在目的蛋白位置出现了特异性条带。

实施例3 重组表达的蛋白对家兔瘢痕成纤维细胞生长的抑制作用实验

取正常和临床上鉴定为瘢痕样本的兔组织，于盛有带有双抗的PBS溶液的小平皿中剪碎，利用I型胶原酶组织消化法分离家兔正常和瘢痕成纤维细胞，在37℃、5％CO2 浓度条件下培养。取分离的兔瘢痕成纤维细胞，用DMEM（含10％FCS）培养液调整细胞浓度至约1×10⁵个/ml，在96孔板中每孔加入50 μl细胞，再分组依次加入实施例2所制备的重组蛋白rsRII,重组蛋白的终浓度分别为10、20、30、40、50μg/ml，以PBS为空白对照。在37℃、5％CO₂ 浓度条件下培养48h，在体外通过MTT细胞毒试验检测重组蛋白对兔瘢痕成纤维细胞生长的抑制作用实验，如图2所示，结果表明本发明克隆得到的重组蛋白以剂量依赖的方式抑制家兔瘢痕成纤维细胞生长，同时以40μg/ml的蛋白浓度检测在24h，48h和72h对家兔瘢痕成纤维细胞生长的抑制作用，结果表明本发明克隆得到的重组蛋白对家兔瘢痕成纤维细胞生长具有明显抑制作用。

直接选用实施例1所得的全长cDNA 碱基序列编码的蛋白质重复上述试验，以40μg/ml的蛋白浓度检测在72h对家兔瘢痕成纤维细胞生长的抑制作用，发现抑制率为7%，低于以上截短的片段的活性。

序列表

 

 

<110>  牡丹江医学院

 

<120>  对瘢痕成纤维细胞生长具有抑制作用的蛋白质的应用

 

<160>  3    

 

<170>  PatentIn version 3.3

 

<210>  1

<211>  1704

<212>  DNA

<213>  兔（Oryctolagus cuniculus）

 

<400>  1

atgggtcggg ggctgctccg gggcctgtgg ccgctgcata tcgtcctgtg gacgcgcatc     60

gccagcacga tccccccgca cgttcataag tcggttaata acgacatgat ggtcacggac    120

aacaatggcg ccgtcaagtt cccacaactg tgcaagtttt gcgatgtgcg atcttccacc    180

tgtgacaacc agaagtcctg catgagcaac tgcagcatca cgtccatctg tgagaaggca    240

cacgaagtct gcgtggccgt ctggaggaag aacgatgaaa acataaccct ggagactgtg    300

tgtcacgacc ccaagctcgc ctaccatgga ttccttctgg aagattctgc ctctccaaag    360

tgtatcatga aagaaaagaa ggtgtttggg gagactttct tcatgtgttc ctgcagcact    420

gacgagtgca atgaccacat catcttctct gaggaataca ccaccagcag tccggatctg    480

ctgctagtca tatttcaagt gaccggcgtc agcctcctgc caccgctggg aattgccatc    540

gccgtcatcg tcaccttcta ctgctaccgc gttcaccggc agcagaagct gagtccctcc    600

tgggagacca gcaagccgcg gaagctcatg gagttcagcg agcactgcgc catcattctg    660

gaagacgacc gctccgacat cagctccacg tgcgccaaca acatcaacca caacacggag    720

ctgctgccca tcgagctgga caccctggtg ggcaaaggtc gattcgccga ggtctacaag    780

gccaagctga ggcagaacac atccgagcag ttcgagaccg tggccgtcaa gatcttcccc    840

tacgaggagt acgcctcttg gaagacggag aaagacatct tctcggacat caacctgaag    900

cacgagaaca tcctgcagtt cctgacggcc gaggagcgca agactgagct cgggaagcag    960

tactggctga tcaccgcctt ccatgccaag ggcaacctgc aggagtatct cacacgccac   1020

gtcatcagct gggaggacct gcgcaagctg ggcagctccc tggcccgggg cattgcccac   1080

ctccacagcg accacacccc ctgtgggagg cccaagatgc ccatcgtgca tagagacctc   1140

aagagctcca acatcctggt gaagaacgac ctgacctgct gcctgtgtga ctttgggctg   1200

tccctgcgcc tggaccctac gctgtctgtg gatgacctgg ctaacagtgg gcaggtgggg   1260

actgcaagat acatggcgcc ggaagtcctg gaatccagga tgaatctgga gaacgtggag   1320

tccttcaagc agactgatgt ctactccatg gcgctggtgc tctgggaaat gacgtcccgc   1380

tgcaatgcgg tgggggaggt caaagattac gagcctccgt ttggttccaa ggtgcgggag   1440

cacccctgtg tggagagcat gaaagacaat gtgctgcgag gtcgaggtcg accagaaatc   1500

cccagcttct ggcttaacca ccagggcata cagatggtgt gtgagacact gaccgaatgc   1560

tgggaccatg acccggaggc ccgtctcacg gcccagtgcg tggcggaacg cttcagcgag   1620

ttggagtacc tggacagact ctcgggaagg agctgctctg aggagaagat tccagaagaa   1680

ggctcactta acactaccaa atag                                          1704

 

<210>  2

<211>  567

<212>  PRT

<213>  兔（Oryctolagus cuniculus）

 

<400>  2

Met Gly Arg Gly Leu Leu Arg Gly Leu Trp Pro Leu His Ile Val Leu

1               5                   10                  15     

Trp Thr Arg Ile Ala Ser Thr Ile Pro Pro His Val His Lys Ser Val

            20                  25                  30         

Asn Asn Asp Met Met Val Thr Asp Asn Asn Gly Ala Val Lys Phe Pro

        35                  40                  45             

Gln Leu Cys Lys Phe Cys Asp Val Arg Ser Ser Thr Cys Asp Asn Gln

    50                  55                  60                 

Lys Ser Cys Met Ser Asn Cys Ser Ile Thr Ser Ile Cys Glu Lys Ala

65                  70                  75                  80 

His Glu Val Cys Val Ala Val Trp Arg Lys Asn Asp Glu Asn Ile Thr

                85                  90                  95     

Leu Glu Thr Val Cys His Asp Pro Lys Leu Ala Tyr His Gly Phe Leu

            100                 105                 110        

Leu Glu Asp Ser Ala Ser Pro Lys Cys Ile Met Lys Glu Lys Lys Val

        115                 120                 125            

Phe Gly Glu Thr Phe Phe Met Cys Ser Cys Ser Thr Asp Glu Cys Asn

    130                 135                 140                

Asp His Ile Ile Phe Ser Glu Glu Tyr Thr Thr Ser Ser Pro Asp Leu

145                 150                 155                 160

Leu Leu Val Ile Phe Gln Val Thr Gly Val Ser Leu Leu Pro Pro Leu

                165                 170                 175    

Gly Ile Ala Ile Ala Val Ile Val Thr Phe Tyr Cys Tyr Arg Val His

            180                 185                 190        

Arg Gln Gln Lys Leu Ser Pro Ser Trp Glu Thr Ser Lys Pro Arg Lys

        195                 200                 205            

Leu Met Glu Phe Ser Glu His Cys Ala Ile Ile Leu Glu Asp Asp Arg

    210                 215                 220                

Ser Asp Ile Ser Ser Thr Cys Ala Asn Asn Ile Asn His Asn Thr Glu

225                 230                 235                 240

Leu Leu Pro Ile Glu Leu Asp Thr Leu Val Gly Lys Gly Arg Phe Ala

                245                 250                 255    

Glu Val Tyr Lys Ala Lys Leu Arg Gln Asn Thr Ser Glu Gln Phe Glu

            260                 265                 270        

Thr Val Ala Val Lys Ile Phe Pro Tyr Glu Glu Tyr Ala Ser Trp Lys

        275                 280                 285            

Thr Glu Lys Asp Ile Phe Ser Asp Ile Asn Leu Lys His Glu Asn Ile

    290                 295                 300                

Leu Gln Phe Leu Thr Ala Glu Glu Arg Lys Thr Glu Leu Gly Lys Gln

305                 310                 315                 320

Tyr Trp Leu Ile Thr Ala Phe His Ala Lys Gly Asn Leu Gln Glu Tyr

                325                 330                 335    

Leu Thr Arg His Val Ile Ser Trp Glu Asp Leu Arg Lys Leu Gly Ser

            340                 345                 350        

Ser Leu Ala Arg Gly Ile Ala His Leu His Ser Asp His Thr Pro Cys

        355                 360                 365            

Gly Arg Pro Lys Met Pro Ile Val His Arg Asp Leu Lys Ser Ser Asn

    370                 375                 380                

Ile Leu Val Lys Asn Asp Leu Thr Cys Cys Leu Cys Asp Phe Gly Leu

385                 390                 395                 400

Ser Leu Arg Leu Asp Pro Thr Leu Ser Val Asp Asp Leu Ala Asn Ser

                405                 410                 415    

Gly Gln Val Gly Thr Ala Arg Tyr Met Ala Pro Glu Val Leu Glu Ser

            420                 425                 430        

Arg Met Asn Leu Glu Asn Val Glu Ser Phe Lys Gln Thr Asp Val Tyr

        435                 440                 445            

Ser Met Ala Leu Val Leu Trp Glu Met Thr Ser Arg Cys Asn Ala Val

    450                 455                 460                

Gly Glu Val Lys Asp Tyr Glu Pro Pro Phe Gly Ser Lys Val Arg Glu

465                 470                 475                 480

His Pro Cys Val Glu Ser Met Lys Asp Asn Val Leu Arg Gly Arg Gly

                485                 490                 495    

Arg Pro Glu Ile Pro Ser Phe Trp Leu Asn His Gln Gly Ile Gln Met

            500                 505                 510        

Val Cys Glu Thr Leu Thr Glu Cys Trp Asp His Asp Pro Glu Ala Arg

        515                 520                 525            

Leu Thr Ala Gln Cys Val Ala Glu Arg Phe Ser Glu Leu Glu Tyr Leu

    530                 535                 540                

Asp Arg Leu Ser Gly Arg Ser Cys Ser Glu Glu Lys Ile Pro Glu Glu

545                 550                 555                 560

Gly Ser Leu Asn Thr Thr Lys

                565        

 

<210>  3

<211>  202

<212>  PRT

<213>  兔（Oryctolagus cuniculus）

 

<400>  3

Arg Ile Ala Ser Thr Ile Pro Pro His Val His Lys Ser Val Asn Asn

1               5                   10                  15     

Asp Met Met Val Thr Asp Asn Asn Gly Ala Val Lys Phe Pro Gln Leu

            20                  25                  30         

Cys Lys Phe Cys Asp Val Arg Ser Ser Thr Cys Asp Asn Gln Lys Ser

        35                  40                  45             

Cys Met Ser Asn Cys Ser Ile Thr Ser Ile Cys Glu Lys Ala His Glu

    50                  55                  60                 

Val Cys Val Ala Val Trp Arg Lys Asn Asp Glu Asn Ile Thr Leu Glu

65                  70                  75                  80 

Thr Val Cys His Asp Pro Lys Leu Ala Tyr His Gly Phe Leu Leu Glu

                85                  90                  95     

Asp Ser Ala Ser Pro Lys Cys Ile Met Lys Glu Lys Lys Val Phe Gly

            100                 105                 110        

Glu Thr Phe Phe Met Cys Ser Cys Ser Thr Asp Glu Cys Asn Asp His

        115                 120                 125            

Ile Ile Phe Ser Glu Glu Tyr Thr Thr Ser Ser Pro Asp Leu Leu Leu

    130                 135                 140                

Val Ile Phe Gln Val Thr Gly Val Ser Leu Leu Pro Pro Leu Gly Ile

145                 150                 155                 160

Ala Ile Ala Val Ile Val Thr Phe Tyr Cys Tyr Arg Val His Arg Gln

                165                 170                 175    

Gln Lys Leu Ser Pro Ser Trp Glu Thr Ser Lys Pro Arg Lys Leu Met

            180                 185                 190        

Glu Phe Ser Glu His Cys Ala Ile Ile Leu

        195                 200