一种绿色木霉碱性蛋白酶及其真核表达方法与应用

摘要

本发明公开了一种绿色木霉碱性蛋白酶及其真核表达方法与应用。该绿色木霉碱性蛋白酶的编码序列通过RACE方法得到，氨基酸序列长度为410个氨基酸，编码序列长度为1233个核苷酸。该绿色木霉碱性蛋白酶的编码核苷酸序列构建于真核表达载体中，进行真核表达，能得到具有抑制黄曲霉生长的色木霉碱性蛋白酶。该绿色木霉碱性蛋白酶具有抑制黄曲霉生长的功能。

说明书

技术领域

本发明属于抗黄曲霉生长技术领域，具体涉及一种绿色木霉碱性蛋白酶及其真核表达方法与应用。

背景技术

绿色木霉菌(Trichoderma viride)属半知菌亚门，丛孢梗目，丛孢梗科，是当前公认的具有应用前景的生防菌，能够防治多种病害。绿色木霉菌以其资源丰富、持效期长、作用方式独特、对非靶标生物安全及不污染环境等优点而倍受重视。在国内外研究中，利用木霉菌防治作物的猝倒病、立枯病、灰霉病、纹枯病等均取得了良好的效果。

碱性蛋白酶(Alkaline Protease)，属于丝氨酸孢外高碱性蛋白酶，它能水解蛋白质分子，具有较强的分解蛋白质的能力，是重要的细胞壁裂解酶，在绿色木霉与其它病原菌的相互作用中起到主要作用。

目前，对碱性蛋白酶的研究较少，Geremia等(1993)从哈茨木霉(Trichoderma harzianum)IMI206040菌株中分离到1种丝氨酸蛋白酶基因prb1，并证明它与菌寄生过程有关。Jesús(2002)等从哈茨木霉中分离出1种天冬氨酰蛋白酶基因papA，并在酵母中高效表达。但到目前为止，对绿色木霉菌中碱性蛋白酶的研究则未见报道。

发明内容

本发明的首要目的在于克服现有技术的缺点与不足，提供一种绿色木霉碱性蛋白酶。

本发明的另一目的在于提供所述绿色木霉碱性蛋白酶的真核表达方法。

本发明的再一目的在于提供上述绿色木霉碱性蛋白酶的应用。

本发明的目的通过下述技术方案实现：一种绿色木霉碱性蛋白酶，其氨基酸序列如下所示：

MAIIRRLALYLGALLPAVLAAPAALHKKPFAVPNKFIVTLKFGASIDTDSHLAWVNDLHRRSLTKRST

AGVEKTYNIHTWSAYAGEFDDETIEQIKSSPDVGCVCGARLHHVPVGHCDRQACFDYTIRCSLGSRHC

FPSHIWVHKLHLSSLSWRWNFCLRSSLRYQHLPSAIRRACQPWLACCRGAACTYSWSWYSCFRNNCWI

YIWRCQAGLPNLRVSLLWRALHHLYYPRRLWLGRERHCLAEPCKQICYMYVAWRTCFIYLDDRHQRSL

QPGCAYHCRRWGWRLSRKPPTSLQHFSCVRTARHHCCSTGHQLAHCFLHQLWCWCVRFCPWCICSVSW

IGSNTATNTISGTSMATPHVVGLALYLQSLEGLSTPTAVTNRIKALATTGRVTGSLRGSPNSIIFNGH

SA；

所述绿色木霉碱性蛋白酶，其核苷酸序列如下所示：

ATGGCCATCATCCGTCGTCTTGCTCTCTATCTCGGAGCCTTGCTCCCGGCTGTCCTCGCCGCTCCCGC

AGCTCTTCATAAGAAGCCGGAGGCTGTACCTAACAAGTTTATTGTCACTCTGAAAGAGGGCGCTTCCA

TTGATACAGACTCTCATCTCGCCTGGGTAAATGACCTCCACCGTCGATCTTTGACCAAGCGTAGCACT

GCTGGTGTTGAAAAGACTTATAACATTCATACTTGGAGTGCTTATGCGGGCGAGTTTGATGACGAGAC

AATTGAGCAGATCAAGTCTAGTCCCGATGTAGGTTGCGTCTGTGGAGCCAGACTACATCATGTACCTG

TCGGACATTGTGACAGACAAGCGTGCTTTGACTACACAATCCGGTGCTCCTTGGGGTCTCGGCACTGT

TTCCCATCGCACATCTGGGTCCACAAGCTACATTTAAGCTCACTCAGCTGGCGCTGGAACTTTTGCCT

ACGTAGTTCCCTCCGGTATCAACACCTCCCATCAGCAATTCGGCGGGCGTGCCAGCCTTGGCTAGCTT

GCTGCAGGGGGGCAGCATGTACTTACTCTTGGTCATGGTACTCATGTTTCCGGAACAATTGCTGGATC

TACATTTGGCGTTGCCAGGCAGGCCTACCTAATCTCCGTGTCAGTCTTCTCTGGAGAGCTCTCCACCA

CCTCTATTATCCTCGACGGCTATGGCTGGGCCGTGAACGACATTGTCTCGCGGAACCGTGCAAACAAA

TCTGCTATATGTATGTCGCTTGGAGGACCTGCTTCATCTACCTGGACGACCGCCATCAACGCAGCCTT

CAGCCAGGGTGTGCTTACCATTGTCGCCGCTGGGGCTGGAGACTCTCTAGGAAACCCCCAACCAGTCT

CCAGCACTTCTCCTGCGTTCGTACCGCTCGCCATCACTGTTGCAGCACTGGACATCAATTGGCGCACT

GCTTCCTTCACCAACTATGGTGCTGGTGTGTCCGTTTTTGCCCCTGGTGTATTTGTTCTGTCTCATGG

ATTGGATCTAACACTGCCACCAACACAATTAGCGGCACTTCAATGGCTACACCTCACGTTGTCGGTCT

GGCTCTCTATCTTCAATCCCTTGAAGGTCTCTCCACTCCCACCGCTGTCACTAATCGGATCAAAGCTC

TGGCTACCACTGGCCGCGTAACCGGCAGCCTTAGAGGTAGCCCTAACTCTATCATCTTCAACGGACAC

AGTGCTTAA；

所述绿色木霉碱性蛋白酶的真核表达方法，包含以下步骤：将绿色木霉碱性蛋白酶的编码序列克隆至真核表达载体中，转化宿主细胞，进行诱导和表达。

所述的真核表达载体优选pPICZαA载体；所述宿主优选为毕赤酵母表达菌株GS115。

所述绿色木霉碱性蛋白酶应用于制备抑制黄曲霉生长的制剂。

本发明相对于现有技术具有如下的优点及效果：

本发明首次从绿色木霉中分离得到一种碱性蛋白酶，并且证实了该碱性蛋白酶具有抑制黄曲霉生长的功能。

附图说明

图1是绿色木霉碱性蛋白酶全长cDNA的PCR扩增产物的电泳检测图，其中：

泳道M为DL2000 Marker；

泳道1为PCR扩增产物，箭头处为目的片段。

图2是SDS-PAGE电泳图，其中箭头处为目标蛋白。

具体实施方式

下面结合实施例及附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。

实施例1

(1)绿色木霉菌株的分离及鉴定

①分离土样取自广东省汕头市花生种植田土壤。称取土样10g，放入盛有100ml无菌水的带有玻璃珠的三角瓶中，振荡摇匀10min使土和水充分混合。在无菌操作条件下，用移液枪从三角瓶中吸取1ml，加入另一盛有9ml无菌水的试管中，混合均匀，依此类推分别制成10^-2、10^-3、10^-4不同稀释度的土壤溶液。

②涂布培养及划线分离：以10^-2及10^-3两个浓度的土壤稀释液作为涂布平板培养的对象，将其涂布在PDA(马铃薯葡萄糖琼脂)固体培养基(马铃薯200g，葡萄糖20g，琼脂15g，pH6.8，蒸馏水定容至1000ml)上，每个样3个重复，28℃培养3天后，对平板中的微生物进行观察，用接种环挑取平板中长势旺盛的拟拮抗菌株进行划线分离，得到纯培养物。接着对纯培养进一步筛选：利用牛津杯双层平板法将纯培养物的发酵液对黄曲霉进行抑菌活力的测定(所用的黄曲霉为黄曲霉GIM3.17，购于中科院微生物所)，得到了不仅能抑制黄曲霉菌丝的生长，还能抑制黄曲霉孢子的萌发的黄曲霉拮抗菌GZ101。

③菌株鉴定：

A、形态学鉴定

平板上菌落形态特征：将接种针经火焰灭菌并待冷却后，从斜面上挑取少量黄曲霉拮抗菌GZ101菌体，接种于平板的中间位置，倒置于25℃培养7～14天，观察菌落特征。结果表明，在察氏固体培养基上，生长较差，菌丝稀疏，培养7天后有稀疏的绿色产孢子丛束区，菌落反面无色；在麦芽汁固体培养基上生长快，培养7天后菌丝铺满整个平皿，最初为白色致密的基质菌丝，而后出现棉絮状气生菌丝，并形成密实产孢丛束区，常排成同心轮纹，黄绿色的产孢区，有辐射状沟纹，菌落反面无色；在PDA固体培养基上生长速度快，培养7天后菌丝铺满整个平皿，最初为白色致密的基质菌丝，而后出现棉絮状气生菌丝，并形成密实产孢丛束区，常排成同心轮纹，深黄绿色至深蓝绿色的产孢区，菌落反面无色。

显微镜下形态特征观察：用解剖针从培养皿的菌落上，挑取少量黄曲霉拮抗菌GZ101菌体，置载玻片的水滴中，加盖盖玻片。于显微镜下观察其形态特征。发现其菌丝透明，壁光滑，有隔，直径1.5～8μm，厚垣孢子间生于菌丝中或顶生于短侧枝上，多数为球形，少数为椭圆形，透明，壁光滑；分生孢子梗为菌丝的短侧枝，其上对生或互生分枝，分枝上继续分枝，形成二级、三级分枝，小梗瓶形成锥形，基部稍窄，中部较宽，从中部以上变窄成长颈，(8～12)×(2.5～3)μm，分生孢子多数为球形，直径2.5～4.5μm，少数孢子为短倒卵形，(4～5)×(3.5～4)μm。

根据以上培养特征及显微形态特征结果，查《真菌鉴定手册》及《真菌的形态和分类》可知，该菌与绿色木霉菌(Trichoderma viride)最相似。

B、分子生物学方法进行鉴定

黄曲霉拮抗菌GZ101的DNA的提取：将GZ101菌株接种于PDA固体培养基中，28℃恒温培养3～5天后，将菌丝转移至灭过菌的研钵中，用液氮将菌体迅速研磨成粉末后，用基因组提取试剂盒提取基因组DNA。

PCR扩增：以提取的DNA为模板，用真菌通用引物ITS1(5’-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3’)、ITS2(5’-GCTGCGTTCATCGATGC-3’)扩增18S rDNA基因。PCR反应体系为：

试剂                            体积

2 x PCR Master Mix              5μL

引物ITS1(浓度为10μM)           1μL

引物ITS1(浓度为10μM)           1μL

基因组DNA(浓度为10ng/uL)        5μL

灭菌水                          定容至50μL

反应条件：

94℃5min；

94℃1min，56℃1min，72℃2min(30个循环)；

72℃7min；

4℃保存。

将扩增条带回收后送往上海英俊公司测序，测序序列如下所示。将测得的18S rDNA基因序列在GenBank等国际核酸序列数据库内进行同源序列搜索(blast search)，找出该菌株与数据库中同源性最高的模式菌株或保藏于ATCC或DSM等国际菌种保藏中心的菌株。结合形态特征，确定黄曲霉拮抗菌GZ101为绿色木霉菌(Trichoderma viride)。将该菌株命名为绿色木霉GZ101，于2010年11月4日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏号为CCTCC M 2010291。

测序序列：

GCCCACCTCTCTGGGCCAGTCCGGACGCCTCACTGAGCCATTCAATCGGTAGTAGCGACGGGCGGTGTGTACAAAGGGCA

GGGACGTAATCAACGCAAGCTGATGACTTGCGCTTACTAGGGATTCCTCGTTGAAGAGCAATAATTGCAATGCTCTATCC

CCAGCACGACGGAGTTTAACAAGATTACCCAGGCCTTCCGGCCAAGGGAGTACTCGCTGGCTCCGTCAGTGTAGCGCGCG

TGCGGCCCAGAACATCTAAGGGCATCACAGACCTGTTATTGCCTCAAACTTCCATCGGCTTGAGCCGATAGTCCCTCTAA

GAAGCCGGCGTACTGCCAAAGCAATACGGGCTATTTAGCAGGTTAAGGTCTCGTTCGTTATCGCAATTAAGCAGACAAAT

CACTCCACCAACTAAGAGCGGCCATGCACCACCACCCACAAAATCAAGAAAGAGCTCTCAATCTGTCAATCCTCATTGTG

TCTGGACCTGGTGAGTTTCCCCGTGTTGAGTCAAATTAAGCCGCAGGCTCCACCCCTGGTGGTGCCCTTCCGTCAATTTC

TTTAAGTTTCAGCCTTGCGACCATACTCCCCCTGGAGCCCAAGCACTTTGATTTCTCGTAAGGTGCCGAACGCGTCAAAA

ATGTAACATCGTCCGATCCCTAGTCGGCATAGTTTATGGTTAAGACTACGACGGTATCTGATCGTCTTCGATCCCCTAAC

TTTCGTTCCTGATTAATGAAAACATCCTTGGCAAATGCTTTCGCAGTAGTTAGTCTTCAATAAATCCAAGAATTTCACCT

CTGACAATTGAATACTGATGCCCCCGACTGTCCCTATTAATCATTACGGCGGTCCTAGAAACCAACAAAATAGAACCACA

CGTCCTATTCTATTATTCCATGCTAATGTATTCGAGCATAGGCCTGCCTTGAGCACTCTAATTTTTTCAAAGTAAAAGTC

CTGTTTCCCCGCCACACCCAGTGAAGGGCATGGGGTTCCGCAGAGGGAAAGGCCCGGCCGGACCAGTGCACGCGGTGAGG

CGGACCGGCCAGCCAGGCCCAAGGTTCAACTACGAGCTTTTTAACCACAACAACTTTAATATACGCTATTGGAGCTGGAA

TTACCGCGGCTGCTGGCACCAGACTTGCCCTCCAATTGTTCCTCGTTAAGGGATTTAAATTGTACTCATTCCGCTTACAA

GACCCAAAAGAGCCCTGTATCAGTATTTATTGTCACTACCTCCCCGTGTCGGGATTGGGTAATTTGCGCGCCTGCTGCCT

TCCTTGGATGTAGTAGCCGTTTCTCAGGCTCCTTCTCCGGGGTCGAGCCCTAACCCTCCGTTACCCGTTGCCACCATGTT

TGGCCAATACCCAAACATCGAAAGTTGATAGGGAAGAAATTTGAATGAGCCATCGCCGGCACAAGGCCTGTCGATTCGAC

TAGTTATCATGATTCACCAGAGAGCCCCGAGGGGCATTGGTTTTTAATCTAATAAATACATCCCTTCCGAAGTCGGGATT

TTCAGCATGTATTAGCTCTAGAATTACCACGGTTATCCAAGTAGTAAAGTATTATCAAATAAACGATAACTTATATAATG

AGCCATT

实施例2

获取绿色木霉碱性蛋白酶

(1)合成PCR引物

AM：5′-CAATCTGGTGCTCCTTGGGGT-3′

BM：5′-CGTATGTAGATCCACCAATTGTTCC-3′

Q1：5′-GTCATCGTCAATCTGGGTCACAAGC-3′

Q2：5′-GTATGTAGATCCACCAATTGTTCCG-3′

M1：5′-ATGGCCATCATCCGTCGTCTT-3′

M2：5′-TTAAGCACTGTGTCCGTTGAAG-3′

以上引物均由Sigma公司合成。

(2)获得绿色木霉碱性蛋白酶的cDNA

I、根据说明书操作，用TRIZOL试剂(购自Invitrogen)抽提绿色木霉GZ101的总RNA，用RT-PCR试剂盒(购自TaKaRa公司，按说明书进行操作)进行cDNA第一链的扩增，引物为OLIGO 18T，得到cDNA第一链。再以cDNA第一链为模板，进行PCR扩增，扩增的PCR体系为：

试剂                           体积

2 x PCR Master Mix             5μL

引物AM(浓度为10μM)            1μL

引物BM(浓度为10μM)            1μL

cDNA(浓度为10ng/uL)            5μL

灭菌水                         定容至50μL

反应条件：

94℃5min；

94℃1min，60℃30s，72℃2min(35个循环)；

72℃10min；

4℃保存。

根据各个试剂盒说明书进行操作，用凝胶回收试剂盒(购自TIANGEN公司)对PCR产物(长为219bp)回收，再将回收后的PCR产物，与pMD18-T载体(购自大连宝生生物公司)连接，转化大肠杆菌DH5α(购自Novagen公司)感受态细胞，筛选获得阳性克隆，并进行测序验证，测序结果如下：

CACCGGATTTGTCATCGTCAATCTGGGTCACAAGCTACATTTATGATAGCTCAGCTGGCGCTGGAACTTTTGCCTACGTA

GTTGACTCCGGTATCAACACCTCCCATCAGCAATTCGGCGGGCGTGCCAGCCTTGGCTATAATGCTGCAGGGGGGCAGCA

TGTTGATACTCTTGGTCATGGTACTCATGTTTCCGGAACAATTGGTGGATCTACATACG

II、RACE

3’-RACE：以RT-PCR得到的cDNA第一链为模板，根据上述得到的长为219bp的序列设计特异引物Q1进行PCR扩增(具体操作步骤详见SMARTerRACEcDNA Ampliication Kit)。

5’-RACE：根据长为219bp的序列设计特异引物Q2进行PCR扩增(具体操作步骤详见SMARTer RACE cDNA Ampliication Kit)。

将分别得到的3’-RACE和5’-RACE片段与pMD18-T载体进行连接，转化大肠杆菌DH5α(购自Novagen公司)感受态细胞，筛选获得阳性克隆，送至上海英俊公司测序。拼接测序得到的各片段，分别在起始密码子ATG上游和终止密码子TAA下游设计特异性引物M1和M2，利用RT-PCR得到的cDNA第一链为模板扩增得到绿色木霉碱性蛋白酶(命名为TvALP1)全长cDNA序列，扩增的PCR体系为：

试剂                           体积

2 x PCR Master Mix             5μL

引物M1(浓度为10μM)            1μL

引物M2(浓度为10μM)            1μL

cDNA(浓度为10ng/uL)            5μL

灭菌水                         定容至50μL

反应条件：

94℃5min；

94℃1min，60℃30s，72℃2min(35个循环)；

72℃10min；

4℃保存。

PCR产物电泳，如图1所示。将TvALP1全长cDNA序列与pMD18-T载体进行连接，转化大肠杆菌DH5α(购自Novagen公司)感受态细胞，筛选获得阳性克隆，抽取质粒pMDT-TvALP1送至上海英俊公司测序，测序序列如下所示：

GCCCACCTCTCTGGGCCAGTCCGGACGCCTCACTGAGCCATTCAATCGGTAGTAGCGACGGGCGGTGTGTACAAAGGGCA

GGGACGTAATCAACGCAAGCTGATGACTTGCGCTTACTAGGGATTCCTCGTTGAAGAGCAATAATTGCAATGCTCTATCC

CCAGCACGACGGAGTTTAACAAGATTACCCAGGCCTTCCGGCCAAGGGAGTACTCGCTGGCTCCGTCAGTGTAGCGCGCG

TGCGGCCCAGAACATCTAAGGGCATCACAGACCTGTTATTGCCTCAAACTTCCATCGGCTTGAGCCGATAGTCCCTCTAA

GAAGCCGGCGTACTGCCAAAGCAATACGGGCTATTTAGCAGGTTAAGGTCTCGTTCGTTATCGCAATTAAGCAGACAAAT

CACTCCACCAACTAAGAGCGGCCATGCACCACCACCCACAAAATCAAGAAAGAGCTCTCAATCTGTCAATCCTCATTGTG

TCTGGACCTGGTGAGTTTCCCCGTGTTGAGTCAAATTAAGCCGCAGGCTCCACCCCTGGTGGTGCCCTTCCGTCAATTTC

TTTAAGTTTCAGCCTTGCGACCATACTCCCCCTGGAGCCCAAGCACTTTGATTTCTCGTAAGGTGCCGAACGCGTCAAAA

ATGTAACATCGTCCGATCCCTAGTCGGCATAGTTTATGGTTAAGACTACGACGGTATCTGATCGTCTTCGATCCCCTAAC

TTTCGTTCCTGATTAATGAAAACATCCTTGGCAAATGCTTTCGCAGTAGTTAGTCTTCAATAAATCCAAGAATTTCACCT

CTGACAATTGAATACTGATGCCCCCGACTGTCCCTATTAATCATTACGGCGGTCCTAGAAACCAACAAAATAGAACCACA

CGTCCTATTCTATTATTCCATGCTAATGTATTCGAGCATAGGCCTGCCTTGAGCACTCTAATTTTTTCAAAGTAAAAGTC

CTGTTTCCCCGCCACACCCAGTGAAGGGCATGGGGTTCCGCAGAGGGAAAGGCCCGGCCGGACCAGTGCACGCGGTGAGG

CGGACCGGCCAGCCAGGCCCAAGGTTCAACTACGAGCTTTTTAACCACAACAACTTTAATATACGCTATTGGAGCTGGAA

TTACCGCGGCTGCTGGCACCAGACTTGCCCTCCAATTGTTCCTCGTTAAGGGATTTAAATTGTACTCATTCCGCTTACAA

GACCCAAAAGAGCCCTGTATCAGTATTTATTGTCACTACCTCCCCGTGTCGGGATTGGGTAATTTGCGCGCCTGCTGCCT

TCCTTGGATGTAGTAGCCGTTTCTCAGGCTCCTTCTCCGGGGTCGAGCCCTAACCCTCCGTTACCCGTTGCCACCATGTT

TGGCCAATACCCAAACATCGAAAGTTGATAGGGAAGAAATTTGAATGAGCCATCGCCGGCACAAGGCCTGTCGATTCGAC

TAGTTATCATGATTCACCAGAGAGCCCCGAGGGGCATTGGTTTTTAATCTAATAAATACATCCCTTCCGAAGTCGGGATT

TTCAGCATGTATTAGCTCTAGAATTACCACGGTTATCCAAGTAGTAAAGTATTATCAAATAAACGATAACTTATATAATG

AGCCATT

(3)真核表达重组载体的构建

I、设计含有EcoR I位点的上游引物(F)和含有Not I位点(R)的下游引物：

F：5’-GAAGAATTC ATGGCCATCATCCGTCGTCTT-3’

R：5’-CTTGCGGCCGC TTAAGCACTGTGTCCGTTGAAG-3’

模板为pMDT-TvALP1，进行PCR扩增，扩增的PCR体系为：

试剂                           体积

2 x PCR Master Mix             5μL

引物F(浓度为10μM)             1μL

引物R(浓度为10μM)             1μL

pMDT-TvALP1                    5μL

灭菌水                         定容至50μL

反应条件：

94℃5min；

94℃1min，60℃30s，72℃2min(35个循环)；

72℃10min；

4℃保存。

用EcoR I和Not I分别双酶切目的片段和pPICZαA载体(购自Invitrogen公司)，切胶回收。按目的片段和载体以摩尔比3∶1的比例在16℃ T4 DNA连接酶的作用下连接过夜，连接产物转化大肠杆菌E.coli DH5α感受态细胞，涂布于含有25mg/mL Zeocin的LB选择性平板上，37℃培养，挑取单菌落进行PCR检测。将拟阳性克隆单菌落接种于含25mg/mL Zeocin的LB培养基(LB培养基的组成为：10g NaCl，5g酵母提取物，10g胰蛋白胨，pH7.0，定容至1000mL)中振荡培养过夜，碱裂解法提取质粒，酶切鉴定重组质粒。选取拟阳性克隆送上海英俊生物技术有限公司测序，将鉴定正确的重组质粒命名pPICZαA-TvALP1。

(4)绿色木霉碱性蛋白酶TvALP1的表达和纯化

将重组质粒pPICZαA-TvALP1酶切线性化后转入毕赤酵母表达菌株GS115(购自Invitrogen公司)中。通过PCR鉴定转化成功之后，将转化的单克隆重组酵母菌GS115/pPICZαA-TvALP1接种于10mL BMGY培养基(1％wt酵母提取物、2％wt蛋白胨、1.34％wtYNB、(4×10^-5)％生物素、1％wt甘油、100mM磷酸钾缓冲液，pH6.0)，30℃、240～280rpm摇床培养16～18h，至菌体OD600值大于2时，室温离心5min收获菌体。菌体沉淀用20mL BMMY(1％wt酵母提取物、2％wt蛋白胨、1.34％wt YNB、(4×10^-5)％wt生物素、0.5％wt甲醇、100mM磷酸钾缓冲液，pH6.0)培养基悬浮，30℃240～280rpm诱导培养96h，每24h向培养基中补加甲醇至终浓度为0.5％v/v，以保证持续诱导表达，并分别在0、24、48、72、96h取少量菌液，并确定表达的最佳时间为72小时。诱导结束后，胞外表达重组酵母菌GS115/pPICZαA-TvALP1的培养液5000rpm室温离心10min收集上清，-20℃保存备用；胞内表达重组酵母菌GS115/pPICZαA-TvALP1的培养液5000rpm室温离心10min收集沉淀，-20℃保存备用。

向胞外表达重组酵母菌培养液所收集的上清中缓慢加入硫酸铵至70％饱和度，冰上放置30min，4℃，6000rmp离心10min后沉淀用4mL 50mM磷酸钠缓冲液(pH 7.4)重新溶解，在50mM磷酸钠缓冲液(pH 7.4)(含5mM DTT)4℃透析过夜。透析后的胞外表达重组酵母中所提取的蛋白溶液分别加入1mL50％Ni-NTA，混匀后4℃200rpm振荡2h。将蛋白混合液加入Novagen公司的Superflow柱，用NTA-0 Buffer(20mM Tris-HCl pH7.9，0.5M NaCl，10％Glycerol，0mM Imidazole)洗至蛋白峰降至水平；用NTA-20 Buffer(20mM Tris-HCl pH7.9，0.5M NaCl，10％Glycerol，20mM Imidazole)洗去非特异结合蛋白；用洗脱液NTA-200Buffer(20mM Tris-HCl pH7.9，0.5M NaCl，10％Glycerol，200mMImidazole)洗脱目标蛋白，将洗脱得到的目的蛋白用于SDS-PAGE(浓缩胶为3％，分离胶为12％)检测(如图2所示)，确定得到大小为40道尔顿的目标蛋白酶。

实施例3

TvALP1蛋白的体外抑黄曲霉活性检测

将纯化后的TvALP1蛋白酶通过考马斯亮蓝测定浓度后，以黄曲霉GIM3.17(购自中科院微生物所)为指示菌进行体外抑制黄曲霉生长活性的检测。具体步骤为：在96孔板上加入100μl的PDA液体培养基(马铃薯200g，葡萄糖20g，pH6.8，蒸馏水定容至1000ml)和20μl含1×10⁵个黄曲霉GIM3.17孢子的悬液，然后在孔中分别加入用二倍稀释法制成的不同浓度的蛋白酶液各100μl，使蛋白酶的最终浓度为300μg/ml至1μg/ml(10个浓度)；用100μl的PBS(0.2mol/L，pH7.0)处理作为阴性对照；用100μl的5μg/ml的两性霉素B处理作为阳性对照，共12个处理，每处理3个重复。在28℃培养48h后观察孔内黄曲霉生长情况。结果表明，蛋白酶浓度等于或低于10μg/ml时，均可观察到黄曲霉的生长，随着蛋白酶浓度的降低黄曲霉生长逐渐旺盛。

上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。