芽孢杆菌GZB及其在降解环境内分泌干扰物双酚A中的应用

摘要

本发明提供了一种具有双酚A降解矿化能力的芽孢杆菌，该菌种从广东贵屿镇电子垃圾高风险区的污泥进行分离、纯化获得，为芽孢杆菌属的一个变种，命名为芽孢杆菌(Bacillus sp.)GZB，并于2010年12月13日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO：M 2010345。该菌种具有能够降解矿化双酚A的能力，矿化率可达35～51％，降解率可达90～100％，可将其应用于生物降解矿化具有环境荷尔蒙效应的内分泌干扰素双酚A。

说明书

技术领域

本发明属于微生物技术领域，特别涉及一种芽孢杆菌GZB在环保领域中的应用，特别是在生物降解矿化具有环境荷尔蒙效应的内分泌干扰素双酚A中的应用。

背景技术

双酚A(Bisphenol A，BPA)是目前已知的一种具有环境荷尔蒙效应的酚甲烷类化合物。自90年代以来已广泛应用于生产环氧树脂、聚碳酸酯等高分子材料及增塑剂、阻燃剂、抗氧剂、热稳定剂等化工产品。作为一种全世界生产量最大的化学物质之一，其年产量在2003年已超过200万吨。而作为一种内分泌干扰物，BPA对水生动物，哺乳动物以及两生类动物都具有一定的生物毒性。2008年10月18日加拿大联邦政府正式宣布，决定将BPA列入有毒物质列表中。

含有双酚A的污染物大部分是排放到自然界的水体中，首先被吸收进入水生生物体内，然后通过食物链的生物积累效应传入食物链上方的生物群体对各类生物造成广泛的影响。因此，对环境中BPA的高效降解是控制此污染物造成的环境危害的有效途径之一。而生物降解由于其低成本，反应条件温和，无二次污染的优点被广泛应用于各种有害有机物的降解。据报道，目前对BPA生物降解的研究有利用鞘氨醇单胞菌(Sphingomonas bisphenolicum)，假单胞菌(Pseudomonas sp.)，氧化木糖无色杆菌(Achromobacter xylosoxidans)等细菌以及毛韧革菌(Stereum hirsutum)，异担子菌(Heterobasidium insulare)，雅致小克银汉霉菌(Cunninghamella elegans)等真菌和植物细胞锦鸡儿(Caraganachamlagu)等生物有机体作为降解制剂。但是BPA降解生成的中间代谢物也同样具有较大的生物毒性，因此对BPA的彻底矿化才可能完全降低其对生态环境的毒害效应，而能够同时微生物降解矿化BPA的芽孢杆菌尚未见报道。

发明内容

本发明的首要目的在于克服现有技术的缺点与不足，提供一种芽孢杆菌GZB。

本发明的另一目的在于提供所述芽孢杆菌GZB在环保领域中的应用，特别是在生物降解矿化具有环境荷尔蒙效应的内分泌干扰素双酚A中的应用。

本发明的目的通过下述技术方案实现：一种芽孢杆菌(Bacillus sp.)GZB，于2010年12月13日保藏于中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，保藏编号为CCTCC M 2010345。

所述芽孢杆菌(Bacillus sp.)GZB具有如下的形态和生理生化特性：

A、采用常规的细菌生理生化鉴定方法和透射电镜观察，为革兰氏阳性杆状细菌，菌体(0.68～0.66)μm×(1.0～2.0)μm，周生鞭毛；

B、主要的生理生化特征：兼性厌氧，具有运动性，接触酶、氧化酶阳性，水解明胶和淀粉，吲哚试验阴性。

所述芽孢杆菌(Bacillus sp.)GZB的16S rDNA序列如SEQ ID：No.3所示。

所述芽孢杆菌GZB在环保领域中的应用，特别优选所述芽孢杆菌GZB应用于微生物降解矿化内分泌干扰素双酚A；

所述芽孢杆菌GZB应用于微生物降解双酚A优选包含以下步骤：将含有双酚A的无机盐培养基pH值调为6.5～8.5，然后将OD₆₀₀值为0.4～0.5(对数增长期)的芽孢杆菌GZB按体积百分比10～40％的接种量添加，于25～42℃进行反应；

所述的含有双酚A的物质中的双酚A浓度优选为5～20mg/L；

所述反应优选为振荡反应条件，振荡速度优选为100～200rpm；

所述反应的时间优选为72～108h。

本发明相对于现有技术具有如下的优点及效果：

(1)本发明首次从广东省贵屿地区土壤中筛选到具有可降解矿化双酚A的芽孢杆菌GZB。

(2)本发明的芽孢杆菌GZB能够降解矿化双酚A，矿化率可达35～51％，降解率可达90～100％。

附图说明

图1是本发明的芽孢杆菌GZB在透射电镜下的形态图(×40000)。

具体实施方式

下面结合实施例及附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。

实施例1

本发明所述的具有降解双酚A能力的芽孢杆菌GZB从广东省贵屿镇电子垃圾高风险区的淤泥中进行分离、纯化而得。其分离纯化方法如下：所用的驯化培养基为无机盐培养基(g/L)(K₂HPO₄ 4.35，KH₂PO₄ 1.7，NH₄NO₃ 2.1，MgSO₄ 0.2，MnSO₄ 0.05，FeSO₄·7H₂O 0.01，CaCl₂·2H₂O 0.03，pH7.0)。首先将3g污泥加入100ml含5mg/L双酚A的无机盐培养基，37℃驯化60天后，以体积百分比10％接种量移入含BPA 10mg/L的无机盐培养基接着驯化一周，以此类推逐步提高BPA的浓度进行驯化，BPA的使用浓度分别为20mg/L、30mg/L、40mg/L。驯化结束后将驯化液涂布于琼脂平板(牛肉膏3.0g/L，蛋白胨10.0g/L，NaCl 5.0g/L，琼脂粉20.0g/L，pH 7.4～7.6)上37℃培养48h，挑选单菌落于牛肉膏蛋白胨培养基(牛肉膏3.0g/L，蛋白胨10.0g/L，NaCl 5.0g/L，pH 7.4～7.6)进行富集培养，然后测定降解率，选择降解率最高的菌种进行纯化。

降解率的测定：将培养18h的培养物以体积百分比15％的接种量接入含有5mg/L BPA的无机盐培养基中，在37℃，pH 7.0的条件下在150rpm的摇床反应108h，定时取样通过高效液相色谱法测定降解率。降解率＝(初始浓度-终浓度)/初始浓度。

高效液相色谱法用以测定BPA的浓度：液相色谱条件为：80％v/v甲醇、18％v/v水、2％v/v乙酸，流速为1ml/min，BPA的检测波长为230nm。通过气相色谱法来测定矿化产物CO₂的生成量以测定BPA的矿化率。

将纯化得到的菌落进行鉴定，鉴定结果如下：

(1)菌体的形态特性：

A、采用常规的细菌生理生化鉴定方法和电子显微镜观察，为革兰氏阳性杆状细菌，菌体(0.68～0.66)μm×(1.0～2.0)μm，周生鞭毛；

B、主要的生理生化特征：兼性厌氧，具有运动性，接触酶、氧化酶阳性，水解明胶和淀粉，吲哚试验阴性。

(2)采用DNA提取方法提取细菌总DNA。采用细菌的16S rDNA通用引物上游引物F27(5’-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’)，下游引物R1522(5’-AAGGAGGTGATCCAGCCGCA-3’)扩增其16S rDNA基因。

PCR扩增体系总体积为50μL：超纯水37.5μL，10×PCR Buffer 5μL，2.5mmol/L dNTP 4μL，10μmol/L上游引物1μL，10μmol/L下游引物1μL，5U/μLTaq DNA Polymerase 0.5μL。另用超纯水代替模板DNA进行空白试验。PCR反应30个循环，94.0℃变性4min后进入循环：94℃变性60s，55℃退火60s，72℃延伸1.5min。30个循环后延伸10min。PCR产物直接测序，结果如下(SEQ ID：No.3)：

GACCGGGCGGGCGTGCTAAATACATGCAAGTCGAGCGGACAGATGGGAGCTTGCTCCCTGATGTTAGCGGCGGACGGGTGAGTAACACGTGGGTAACCTG CCTGTAAGACTGGGATAACTCCGGGAAACCGGGGCTAATACCGGATGGTTGTTTGAACCGCATGGTTCAGACATAAAAGGTGGCTTCGGCTACCACTT A C AGATGGACCCGCGGCGCATTAGCTAGTTGGTGAGGTAACGGCTCACCAAGGCAACGATGCGTAGCCGACCTGAGAGGGTGATCGGCCACACTGGGA CT GA GACACGGCCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTAGGGAATCTTCCGCAATGGACGAAAGTCTGACGGAGCAACGCCGCGTGAGTGATGAAGGTT TTC GGA TCGTAAAGCTCTGTTGTTAGGGAAGAACAAGTGCCGTTCAAATAGGGCGGCACCTTGACGGTACCTAACCAGAAAGCCACGGCTAACTACGT GCCA GCAG CCGCGGTAATACGTAGGTGGCAAGCGTTGTCCGGAATTATTGGGCGTAAAGGGCTCGCAGGCGGTTTCTTAAGTCTGATGTGAAAGCCCC CGGCT CAACC GGGGAGGGTCATTGGAAACTGGGGAACTTGAGTGCAGAAGAGGAGAGTGGAATTCCACGTGTAGCGGTGAAATGCGTAGAGATGTGGA GGAACA CCAGTG GCGAAGGCGACTCTCTGGTCTGTAACTGACGCTGAGGAGCGAAAGCGTGGGGAGCGAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCACGC CGTAAAC GATGAGT GCTAAGTGTTAGGGGGTTTCCGCCCCTTAGTGCTGCAGCTAACGCATTAAGCACTCCGCCTGGGGAGTACGGTCGCAAGACTGA AACTCAAA GGAATTGA CGGGGGCCCGCACAAGCGGTGGAGCATGTGGTTTAATTCGAAGCAACGCGAAGAACCTTACCAGGTCTTGACATCCTCTGAC AATCCTAGA GATAGGACG TCCCCTTCGGGGGCAGAGTGACAGGTGGTGCATGGTTGTCGTCAGCTCGTGTCGTGAGATGTTGGGTTAAGTCCCGCAAC GAGCGCAACC CTTGATCTTA GTTGCCAGCATTCAGTTGGGCACTCTAAGGTGACTGCCGGTGACAAACCGGAGGAAGGTGGGGATGACGTCAAATCAT CATGCCCCTTA TGACCTGGGCT ACACACGTGCTACAATGGACAGAACAAAGGGCAGCGAAACCGCGAGGTTAAGCCAATCCCACAAATCTGTTCTCAG TTCGGATCGCAG TCTGCAACTCGA CTGCGTGAAGCTGGAATCGCTAGTAATCGCGGATCAGCATGCCGCGGTGAATACGTTCCCGGGCCTTGTACACA

由以上菌株长1464bp的16S rRNA基因序列与GenBank中已登录的基因序列进行比对后用邻接法(Neighbor-Joining)构建系统发育树，可知该菌株与芽孢杆菌Bacillus.sp BSFA3-1在一个分支，系统位置最接近。根据16S rRNA同源性分析可以判断该菌种为芽孢杆菌属(Bacillus sp.)的一个变种。

综合上述的生理生化特性、16S rRNA基因序列测定结果，本发明所筛选的细菌应归属芽孢杆菌属(Bacillus sp.)，且为该属的一个变种，命名为芽孢杆菌(Bacillus sp.)GZB，于2010年12月13日保藏于中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，保藏编号为CCTCC M 2010345。

实施例2

将芽孢杆菌GZB单菌落接种于3ml牛肉膏蛋白胨培养基中培养18h的培养物(OD₆₀₀为0.45)以体积百分比20％的接种量接入BPA浓度为5mg/L、pH值为8.0的无机盐培养基中，在37℃，150rpm的摇床反应96h，通过高效液相色谱法测定降解率以及通过气相色谱法测定BPA矿化率。降解率的测定同实施例1。通过矿化产物CO₂的生成量取样检测BPA矿化率。CO₂生成量采用气相色谱法测定释放到空气中的浓度，由亨利定律计算出液体中的含量，两项加和后即为实际生成量。检测条件：进样口温度：180℃，检测器温度：230℃，柱温：150℃。空气流速：300ml/min，H₂流速：30ml/min，N₂流速：120ml/min。检测结果为：降解率为100％，矿化率为51％。

实施例3

将芽孢杆菌GZB单菌落接种于3ml牛肉膏蛋白胨培养基中培养18h的培养物以体积百分比40％的接种量接入BPA浓度为20mg/L、pH值为7.0的无机盐培养基中，在25℃，200rpm的摇床反应108h，通过高效液相色谱法测定降解率以及通过气相色谱法测定BPA矿化率，测定方法同上。检测结果为：降解率为90％，矿化率为35％。

实施例4

将芽孢杆菌GZB单菌落接种于3ml牛肉膏蛋白胨培养基中培养18h的培养物以体积百分比30％的接种量接入BPA浓度为10mg/L、pH值为6.5的无机盐培养基中，在42℃，100rpm的摇床反应72h，通过高效液相色谱法测定降解率以及通过气相色谱法测定BPA矿化率，测定方法同上。检测结果为：降解率为100％，矿化率为45％。

实施例5

将芽孢杆菌GZB单菌落接种于3ml牛肉膏蛋白胨培养基中培养18h的培养物以体积百分比10％的接种量接入BPA浓度为5mg/L、pH值为7.5的无机盐培养基中，在35℃，150rpm的摇床反应96h，通过高效液相色谱法测定降解率以及通过气相色谱法测定BPA矿化率，测定方法同上。检测结果为：降解率为95％，矿化率为43％。

上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。