一种高产α-葡萄糖苷酶的黑曲霉菌株的筛选方法

摘要

本发明公开一种高产α-葡萄糖苷酶的黑曲霉菌株的筛选方法，其特征在于，依次包括以下步骤：(1)挑出黑曲霉菌株经紫外诱变的单菌落；(2)初筛；(3)复筛；(4)摇瓶验证实验；其中，使用邻甲氧基苯基-α-D-葡萄糖苷作为初筛、复筛中诱变筛选时酶分解反应的底物。本发明具有快速准确且高通量筛选α-葡萄糖苷酶黑曲霉菌株的优点。

说明书

技术领域

本发明属于微生物诱变筛选技术领域，具体涉及一种高产α-葡萄糖苷酶的黑曲霉菌株的高通量筛选方法。

背景技术

α-葡萄糖苷酶(α-glucosidase E C 3.2.1.20)是水解酶类，属于键专一性酶，它可专一性地切开糖类底物分子中非还原端的α-1，4糖苷键，个别种类的α-葡萄糖苷酶可以作用于蔗糖的α-1，2糖苷键，释放出葡萄糖。因此，一般来说，α-葡萄糖苷酶对底物要求不甚严格，具有广泛的底物专一性。在低聚异麦芽糖的生产中，利用α-葡萄糖苷酶的水解作用和α-葡萄糖苷转移酶的转苷作用是生产低聚异麦芽糖的关键。将α-葡萄糖苷酶和葡萄糖氧化酶共固定化后制成生物传感器可快速高效检测麦芽糖，从而应用于食品成分分析，医学诊断和环境分析等方面。因此α-葡萄糖苷酶倍受国内外食品工业界的重视。

α-葡萄糖苷酶大多属于微生物酶，生物细胞产生各种酶的总量很多，但每一种酶的含量很低。目前，国外生产的α-葡萄糖苷酶大部分为纯酶，国内研究主要以粗酶液为主，而且国内所用菌株产酶能力也较弱，因此选育高产菌株非常必要。

诱变筛选过程中由于正突变的几率很低，要在筛选过程中避免错筛和漏筛，就需要建立快速高效准确的筛选方法。而原有方法存在灵敏度差，底物价格昂贵，反应时间较长等因素，制约了其在大规模筛选高产α-葡萄糖苷酶黑曲霉菌株方面的应用。而本发明在α-D-葡萄糖还原端设计结合上邻甲氧基苯基基团合成邻甲氧基苯基-α-D-葡萄糖苷，并以该化合物作为诱变筛选时酶分解的底物，达到了准确快速高通量筛选的目的。

发明内容

本发明提供了一种高产α-葡萄糖苷酶的黑曲霉菌株的筛选方法，其特征在于，依次包括以下步骤：(1)挑出400-600株经紫外诱变的黑曲霉单菌落；(2)初筛；(3)复筛；(4)摇瓶验证实验；其中，使用邻甲氧基苯基-α-D-葡萄糖苷作为初筛、复筛中诱变筛选时酶分解反应的底物，所述的邻甲氧基苯基-α-D-葡萄糖苷如结构式(I)所示：

其中，所述底物邻甲氧基苯基-α-D-葡萄糖苷的合成路线为：二环己基碳二亚胺在吡啶催化下与羧酸作用产生具有酰化活性的中间体，α-D-葡萄糖经该中间体乙酰化，与邻甲氧基苯酚缩合，然后以甲醇钠水解制得底物。

本发明中，所述步骤(2)依次包括以下步骤：

a)对步骤(1)挑出的单菌落采用96孔板30-32℃培养55-72h，装液量为200-270μL，同时以未经诱变的菌株做对照；

b)向96孔板中移入10-20μL发酵液；加入0.1-0.25％的底物邻甲氧基苯基-α-D-葡萄糖苷40-60μL，30-32℃温浴10-15min后，加入80-100μL 2.5-3.0moL/L的NaOH溶液终止反应；向对照组中移入10-20μL发酵液，并加入80-100μL同浓度NaOH溶液，温浴10-15min后再加入所述底物；

c)取100-120μL重氮盐溶液加入酶反应体系中，混匀，室温显色2-5min后，于450nm处酶标仪测定，同时以蒸馏水为空白对照，测定发酵后各发酵液600nm处的吸光值。

本发明中，步骤a)中所述96孔板培养的培养基包括：麦芽浸粉2.5-3.5g/L，玉米浆3.2-4.5g/L，K₂HPO₄0.15-0.25g/L，KH₂PO₄0.3-0.45g/L，MgSO₄·7H₂O 0.010-0.025g/L，NH₄NO₃0.3-0.6g/L，培养基pH 5.0-6.0；所述步骤b)中发酵液的成分中含有α-葡萄糖苷酶。

本发明中，步骤c)中所述重氮盐溶液制备过程为：取0.2-0.35g/L NaNO₂80-110mL，然后加入3moL/L的HCL 4.5-6.5mL，30-32℃温浴4-6min，加入50g/L的苯胺8-12mL，30-32℃反应5-8min。

本发明中，所述步骤(3)是对初筛得到的高产菌株进行试管复筛，所述复筛是以未经诱变的菌株做对照。

本发明中，所述步骤(4)是对复筛得到的高产菌株进行摇瓶发酵验证实验，所述摇瓶发酵验证实验是以未经诱变的菌株做对照。

本发明的目的是建立一种高产α-葡萄糖苷酶的黑曲霉菌株的高通量筛选方法，从而能够快速高效准确地筛选高产菌株。本发明的目的是通过如下技术方案实现的：在α-D-葡萄糖还原端设计结合上邻甲氧基苯基基团合成邻甲氧基苯基-α-D-葡萄糖苷，并以该化合物作为诱变筛选的底物，该底物显色具有很高的灵敏性，10％酶活的提高可以用肉眼观察显色的方法分辨出来，且通过96孔板和试管培养的方法进行初筛和复筛，同时建立酶活筛选体系，进一步通过酶标测定的方法确定高产菌株。测定方法为：向96孔板中移入10μL发酵液，加入0.2％的底物邻甲氧基苯基-α-D-葡萄糖苷50μL，30℃温浴10min。加入80μL 2.5moL/L的NaOH溶液终止反应(对照组先加入终止液，再加入底物)。同时制备重氮盐溶液：取0.2g/L NaNO₂100mL，然后加入3moL/L的HCL 5mL，使溶液呈酸性，30℃温浴5min，加入50g/L的苯胺10mL，30℃反应6min。取110μL重氮盐溶液加入酶反应体系中，室温显色2min。450nm处酶标仪测定，同时以蒸馏水为空白对照，测定发酵后各发酵液600nm处的吸光值。通过对初筛得到的高产菌株进行下一步筛选，得到的高产菌株再进行下一步摇瓶发酵验证实验。

本发明具有如下优点：1)本发明方法简单，反应体系所用试剂较易合成，而且底物也容易被α-葡萄糖苷酶水解，因此可用来检测极微量的酶液，而原有方法只能对于酶活力提高1倍以上的菌株做出较准确的测定，而使用邻甲氧基苯基-α-D-葡萄糖苷作为底物，反应具有很高的灵敏性，培养基及其它因素对测定造成的误差较小，因此对于酶活力提高10％左右的菌株，可以通过酶标测定的方法鉴别出来，因此该方法对于通过一轮诱变只能提高50％以下的菌株来说，能够做到不漏筛。2)本发明初筛和复筛时反应时间大大缩短，由原来的60min缩短为10min，显色稳定时间能够达到18-20h左右，而原有方法则只能维持40-50min左右，这对于进行大规模筛选非常有利，避免了显色后化合物的不稳定对读数测定产生的影响。3)本发明通过发酵后酶液本身的底色及酶显色双重分析可以很大程度上保证筛选的准确性。即，本发明以蒸馏水作为空白，测定600nm处发酵液本身的吸光值，一般在OD600值低时，酶450nm处显色反应的测定值受到发酵液底色的影响较小，此时OD450值高的菌株才可作为初筛或复筛的优势菌株。综合上述，本发明方法在微生物酶工程研究中具有较大的推广价值。

具体实施方式

下面结合具体的实施例对本发明做进一步说明，本发明的保护内容不局限于以下实施例。在不背离发明构思的精神和范围下，本领域技术人员能够想到的变化和优点都被包括在本发明中，并且以所附的权利要求书为保护范围。

实施例1

将紫外诱变后平板上长出的单菌落挑出400株，同时以未经诱变的菌株做对照，采用96孔板培养。96孔板培养的培养基为在前期摇瓶产酶的基础上，采用96孔板培养优化的培养基，其成分包括：麦芽浸粉3g/L，玉米浆4g/L，K₂HPO₄0.2g/L，KH₂PO₄0.35g/L，MgSO₄·7H₂O0.015g/L，NH₄NO₃0.5g/L，pH 5.8g/L，装液量为250μL，30℃培养60h后，将菌盖揭开，向96孔板中移入10μL发酵液，加入0.2％的底物邻甲氧基苯基-α-D-葡萄糖苷50μL，30℃温浴10min。加入80μL 2.5moL/L的NaOH溶液终止反应(对照组先加入终止液，再加入底物)。同时制备重氮盐溶液：取0.2g/L NaNO₂100mL，然后加入3moL/L的HCL 5mL，使溶液呈酸性，30℃温浴5min，加入50g/L的苯胺10mL，30℃反应6min。取110μL重氮盐溶液加入酶反应体系中，室温显色2min。450nm处酶标仪测定，同时以蒸馏水为空白对照，测定发酵后各发酵液600nm处的吸光值。通过对初筛得到的22株高产菌株进行复筛。

实施例2

以实施例1得到的22株高产菌株进行试管复筛，同时以未经诱变的菌株做对照。本实施例与实施例1的不同点为，复筛装液量为2mL，培养3d。其它同实施例1。将复筛得到的8株菌株进行摇瓶验证实验。

实施例3

将实施例2得到的8株菌株进行摇瓶验证实验，同时以未经诱变的菌株做对照。本实施例中，摇瓶发酵装液量为40mL，发酵培养4d。

将得到的2株高产菌株进行传代培养，测定其遗传稳定性。

结果表明，发酵结束后酶液的吸光值(600nm)低并且酶反应后酶标测定值(450nm)高时，该菌株具有较高的产酶活力(表1)，因此，初筛和复筛中，OD600nm处酶液的读数对筛选结果具有一定的参考意义。

表1分批诱变筛选中部分菌株测定结果

由表1可见，例如，菌株编号为UV-1-3菌株的发酵结束后，初筛时检测酶液的吸光值(600nm)低为0.117，酶反应后酶标测定值(450nm)高为0.304，表明该菌株具有较高的产酶活力，酶活为1480.3U/mL。而菌株编号为UV-1-5，UV-2-18和UV-2-21的菌株，其发酵结束后酶液的吸光值(600nm)较高，表明该菌株并非真正的高产菌株。可见，采用本发明方法可以实现对黑曲霉高产菌株的筛选。

实施例4

采用本发明方法对诱变菌株进行初筛，对得到的高产菌株使用常规酶反应底物的常规菌株筛选方法进行测定，对实验结果进行比较(表2-3)。由表可知，本发明方法相对传统方法具有较高的灵敏性，在初筛和复筛时能够检测出酶活提高10％左右的菌株。显色稳定性也优于传统方法，避免大批量筛选时显色产物不稳定对测定数据的影响。

表2显色稳定时间比较：

本发明方法：

  0h  3h  6h  9h  12h  15h  18h  21h  24h  27h  0.279  0.278  0.280  0.279  0.276  0.277  0.278  0.260  0.252  0.243

传统方法：

  0min  10min  20min  30min  40min  50min  60min  70min  80min  90min  0.265  0.265  0.264  0.264  0.263  0.258  0.251  0.242  0.221  0.210

由表2可见，本发明方法的显色稳定时间长，在18h内几乎无变化，而在21h内OD值的变化幅度仅为6.8％，而传统方法在1.5h内OD值的变化幅度高达20.8％。可见，本发明的菌株筛选方法具有显色稳定时间较长的优点。

表3灵敏度比较：

因传统方法和本发明所采用的方法显色后产物不同，因此分别采用不同的波长测定。即，传统方法中初筛、复筛的酶显色是在400nm处进行测定，而本发明方法是于450nm处进行测定。

由表3可见，本发明筛选方法相对于传统方法来说，具有较高的灵敏性，在初筛和复筛时能够检测出酶活提高10％左右的菌株。如，本方法中，作为对照的出发菌株在初筛和复筛时于450nm测定的OD值分别为0.286和0.268，而编号为UV-3-42在初筛和复筛时于450nm测定的OD值分别为0.301和0.292，UV-3-42菌株的酶活与出发菌株相比较，提高了12％左右；而传统方法UV-3-42在初筛和复筛时于400nm测定的OD值分别为0.272和0.255，与出发菌株的OD值接近，容易造成漏筛。可见，由于本发明筛选方法灵敏度高，能够将酶活提高10％左右水平的高产菌株筛选出来。