一种从紫色小白菜叶片中提取花青素的方法

摘要

本发明公开了一种从紫色小白菜叶片中提取花青素的方法，该方法以紫色小白菜叶片为原料，经冷冻干燥并粉碎，以35%体积分数的乙酸为提取剂，25℃浸提两次，能够较充分的提出花青素。本发明提供的方法简便易行，试验条件无毒、温和、能耗低；提取时间短；提取液花青素浓度高；提取剂筛选过程中充分考虑了紫色小白菜叶绿素高的特点，有效避开了叶绿素析出对花青素的干扰，光谱扫描中没有发现叶绿素的特征峰。用于提取的溶剂安全无毒，有利于环境保护和色素在食品领域的推广。

说明书

技术领域

本发明属于蔬菜营养成分的提取方法，具体涉及一种从紫色小白菜叶片中提取花青素的方法。

背景技术

色素是一种重要的食品添加剂，随着科技的进步和人类健康意识的提高，人们发现合成色素存在不同程度的慢性毒性、致畸性和致癌性。研究开发安全、无毒和具有保健功能的天然色素，是当今社会发展的必然趋势。花青素是一类广泛存在于植物体中类黄酮类天然色素，一般以糖苷的形式积累于液泡内。花青素不仅使花卉、水果和蔬菜呈现美丽的颜色，还赋予其更高的功能性，如抗紫外线、抗病、抗虫等，而且还可以清除自由基，具有很强的抗氧化能力，在医学上已证明对花青素对人类血液循环失调、肝机能障碍、心血管、癌症和艾滋病等疾病具有一定的疗效，因此日益受到重视。紫色小白菜是韩国应用细胞质雄性不育系育成的杂交F1（中文名称“紫罗兰”）， 2006年在国内市场销售，深受欢迎。“紫罗兰”个体生长速度较慢，叶片正面紫色，背面绿色，叶脉紫色，叶柄翠绿。在秋季栽培条件下，由于阳光充足，叶片的亮紫色表现尤为突出。“紫罗兰” 紫色小白菜叶色独特，有必要对其紫色小白菜紫色成分花青素进行研究。

花青素是一种水溶性色素，易溶于极性溶剂，如：水，甲醇，乙醇等。植物中花青素的提取方法比较成熟的主要有浸提法、超声波法和微波法。超声波法、微波法能够提高提取率，缩短提取时间，但设备成本较高、工艺复杂、能耗较高等。浸提法设备简单、操作简便、工序简单，是应用时间最长，应用范围最广的提取方法。

发明内容

本发明的目的在于提供一种从紫色小白菜叶片中提取花青素的方法。

为了实现上述目的，本发明通过如下技术方案得以实现：

一种从紫色小白菜叶片中提取花青素的方法，其特征在于，该方法以紫色小白菜叶片为原料，经冷冻冻干粉并粉碎、乙酸溶液浸提，高速离心、过滤，得到高浓度的花青素提取液，具体包括下列步骤：

步骤一，将紫色小白菜叶片在-40℃下进行冷冻干燥，干燥后进行粉碎并过40目筛，得到紫色小白菜叶片冻干粉；

步骤二，将紫色小白菜叶片冻干粉置于离心管中，以35%体积分数的乙酸溶液作为提取溶剂，采用浸提法，在25℃环境下，提取2次，每次提取的料液比为1:10，提取时间1min左右；

步骤三，每次的提取液于14000rpm下离心10min，取上清液过0.45μm滤膜，即得到高浓度的花青素提取液；

步骤四，两次得到的花青素提取液，单独或合并后进行色素的浓缩和精制即得纯品。

本发明提供的从紫色小白菜中提取花青素的方法，其有益之处在于：

1）简单：该方法简便易行，实验条件温和。

2）省时：提取时间短。

3）高效：提取液中花青素含量较高，且不含有干扰色素——叶绿素。

4）成本低廉：提取剂选用的乙酸，成本低廉；提取温度25℃，即室温环境，几乎没有能耗；提取液中花青素含量较高，而没有传统提取剂常见的叶绿素干扰现象，这就大大简化了分离纯化的步骤，降低了分离纯化的成本。

5）安全：提取剂安全无毒，所提取色素可安全应用于食品领域。

附图说明

图1是不同提取剂提取的花青素光谱；

图2是不同溶液环境中的叶绿素光谱；

图3是不同浓度乙酸提取的花青素光谱；

图4是不同提取方法提取的花青素光谱；

图5是不同提取次数提取的花青素光谱。

以下结合实验和实施例对本发明作进一步的详细说明。

具体实施方式

本发明的从紫色小白菜叶片中提取花青素的方法，将紫色小白菜叶片在-40℃冷冻干燥，粉碎，将紫色小白菜叶片粉末置于离心管中，以35%体积分数的乙酸为提取液，料液比为（g/mL）1:10，提取温度25℃，提取时间1min左右，共提取两次，高速离心并过滤后得到较纯的花青素提取液。

提取液定量稀释后在可见光区进行光谱扫描，以确定花青素的特征吸收峰位及峰值，并检验有无叶绿素的干扰。

两次得到的花青素提取液，单独或合并后进行色素的浓缩和精制即得纯品。

本发明的从紫色小白菜叶片中提取花青素的方法，使用乙酸/水的混合溶剂，在一定温度下进行提取，可以高效率、高纯度地获得花青素提取液。避免了传统提取方法的大量叶绿素析出现象，是相对较纯的提取液，减少了精制工序。

本发明的方法是根据相似相溶的原理进行的。其过程的实质是花青素从细胞内部向溶剂转移的传质过程：溶剂分子从溶剂主体传递到粉状颗粒的表面，细胞中的成分由于扩散作用迅速进入溶剂中。最终花青素从粉状颗粒溶解于溶剂主体中。其中，花青素在所选溶剂中溶解度的大小以及向溶剂扩散的难易程度是影响提取率的两个主要因素。而花青素在所选溶剂中的扩散速度又取决于固体颗粒大小、料液比、提取温度等因素。

花青素通常储存于植物细胞的液泡内，而液泡膜和细胞膜产生的扩散阻力使得其浸提速率比较小。对原料进行诸如干燥或粉碎之类的预处理，有助于植物细胞膜的破裂，溶剂也容易进入植物细胞内部直接溶解花青素，从而可以提高提取效率。

在发明人给出的实验中，以下参考文献被引用：

【1】杨东平，氮肥对小白菜生长及硝酸盐积累的影响[J]，安徽农业科学，2010，38（33）：18825-18827。

【2】张德双，张凤兰，余阳俊，赵岫云，于拴仓，徐家炳，紫色大白菜育种思路初探[J]，长江蔬菜，2008，11b：14-17；

【3】高彦祥，许正虹，食用天然色素安全性研究进展[J]，食品科学，2005，26（S1）：158-162。

【4】Alison Downham, Paul Collins. Colouring our foods in the last and next millennium[J]. International Journal of Food Science and Technology，2000，35: 5-22。

【5】陈鼎，夏春镗，花青素类天然色素的光降解比较[J]，同济大学学报（医学版），2006，27（5）：13-16，20。

【6】岳辉吉，朱杰. 天然色素的超声提取研究[J]，现代生物医学进展，2006，6（5）：11-13。

【7】陈耀兵，圣地紫罗兰油菜栽培基质的选择试验[J]，湖北民族学院学报（自然科学版），2006，24（4）：324-327。

【8】王华兴，陈锦屏，赵丽华. 山楂果实色素含量测定方法的研究[J]，中国果菜，1996，（1）：23-25。

【9】Creasy, L. L. The Role of Low Tempetature in anthocyanin synthesis in mcIntosh apples. Proc. Amer. Soc. Hort. Sci. 1968(93): 716-724。

【10】卢钰，董现义，杜景平，李永强，王明林，花色苷研究进展[J]，山东农业大学学报（自然科学版），2004，35（2）：315-320。

【11】白逾，丁来欣，“勿忘我”花色素的提取及稳定性研究[J]，食品科技，2009，34（3）：180-184。

【12】雷然，庄华梅，付惠，苜蓿花色素的提取及性质研究[J]，云南化工，2007，34（3）：35-37，43。

【13】胡晓丹，孙爱东，王彩霞，张德权，超声波辅助提取紫苏叶中花色素苷的工艺研究[J]，食品工业科技，2008，29（6）：183-185，188。

【14】刘超，紫甘薯花青素的提取及其稳定性和抗氧化性的研究[D]，长沙：湖南农业大学，2008。

1 材料与方法

1.1 材料

北京好地种子有限公司销售的“紫罗兰”小白菜种子，其个体生长速度较慢，叶片正面紫色，背面绿色，叶脉紫色，叶柄翠绿。温室中栽培，商品采收期采收叶片，-40℃下冷冻干燥，磨碎后过40目筛，于密闭、干燥、避光环境中保存备用。

1.2 试验方法

1.2.1 花青素的提取

提取工艺的优化采用单因素试验。单因素及其水平为：

提取温度（℃）：25、35、45、55、65、75；

料液比（g/mL）：1:5、1:10、1:20、1:30、1:40、1:50；

提取时间（min）：1 min、5 min、15 min、30 min、45 min、60min；

提取次数：1、2、3、4次。

经过不同的提取工艺提取后，离心（14000rpm，10min），取上清液过0.45μm滤膜并定量稀释后上样测定。

1.2.2 光谱扫描确定花青素的特征峰位及峰值

测定液用岛津UV-2550紫外-可见分光光度计进行光谱扫描。

花青素实际吸光度由以下公式（1）、（2）视情况择一进行换算，提取液浓度由公式（3）进行计算：

A=（A_a-A_cn）-0.1（A_cp-A_cn）                    （1）

A=A_a-mA_cp                                                                        （2）

提取液浓度（mg/mL）=A×MW×DF/（ε×L）     （3）

式中：A：花青素实际吸光度；A_a：花青素特征吸收峰值；A_cn：叶绿素特征吸收谷值；A_cp：叶绿素特征吸收峰值；m：干扰系数，即叶绿素在花青素特征吸收峰处的峰值与其本身的特征吸收峰值之比；MW：矢车菊素-3-葡萄糖苷的分子量，449.2；DF：稀释倍数；ε：矢车菊素-3-葡萄糖苷的摩尔消光系数，26900；L：比色皿光程，1cm。

公式（1）在测定液中叶绿素含量较少时采用，公式（2）在测定液中叶绿素含量较多时采用^[8-9]。每个处理3次重复，用邓肯新复极差法进行差异显著性分析。

2 结果与分析

2.1 提取剂的筛选

以10%浓度（体积分数，下同）的乙酸水、1%浓度的HCl-甲醇、1%浓度的HCl-乙醇和1%浓度的HCl-丙酮为提取剂，25℃下浸提30min。提取的花青素光谱扫描结果如图1所示，叶绿素在不同溶剂环境中的光谱如图2所示，花青素实际吸光度如表1所示。

表1：不同提取剂的花青素提取效果比较

由图1可以看出，4种提取剂只有10%浓度的乙酸水的提取液中没有叶绿素的析出。通过提纯紫色小白菜中的叶绿素，得出了叶绿素在1%浓度的HCl-甲醇、1%浓度的HCl-乙醇、1%浓度的HCl-丙酮中的干扰系数，利用公式（2）计算得出花青素的实际吸光度。在表1中，不考虑测定环境的差异，以1%浓度的HCl-甲醇的特征峰值为最高，以1%浓度的HCl-丙酮的特征峰值为最低，几乎为0。考虑到甲醇的毒性对该色素在食用天然色素方面的应用有很大限制，并且其叶绿素提取量太高，增加了进一步色素提纯和精制的工作量，所以选择10%浓度的乙酸水作为提取剂。

2.2 乙酸提取浓度的筛选

在25℃下，设置11个乙酸浓度的梯度（%）：5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55；25℃下分别提取30min，离心并过滤后取上清液，定量稀释同时调整乙酸浓度统一为10%，平衡2h后上样测定。提取的花青素光谱扫描结果如图3所示，花青素实际吸光度如表2所示。

表2：不同浓度乙酸的花青素提取效果比较

从图3中发现，花青素吸光度随乙酸浓度的增高而增高，但乙酸浓度增至40%时，开始出现叶绿素的析出，并且随乙酸浓度的增高而增高。考虑到叶绿素的含量并不高，采用公式（1）进行换算得到花青素的实际吸光度（表2），其中以35%浓度的乙酸水的提取率为最高，因此选定35%浓度的乙酸为提取最佳浓度。

2.3 提取方法的筛选

以35%浓度的乙酸水为提取剂，在40℃下对样品分别用浸提法和超声波法（200W）提取30min。在超声波辅助的条件下，花青素的特征峰位并未发生变化，花青素的提取率仅有微量的提高（1.5%，数据略），并且在691nm处检测到一较高强度未知成分（图4），使提取液成分进一步复杂化。考虑到能耗问题，选择浸提法提取。

2.4 浸提法提取影响因素的单因素优化

2.4.1 提取温度的筛选

表3：不同提取温度的花青素提取效果比较

不同提取温度下花青素的特征峰位并未发生变化（图略），温度梯度间的提取效果没有显著性差别（表3）。考虑到能耗问题，以25℃即室温环境为最佳提取温度。

2.4.2 料液比的筛选

表4：不同料液比的花青素提取效果比较

注：干粉会吸附部分提取剂，进行含量计算时要减去这部分体积。试验表明干粉的吸附容量大约是1.2mL/g。下同。

在表4中，从提取液浓度和提取量2个方面来考虑。提取液浓度最高的料液比是1:5，提取量最高的料液比是1:50，提取量的增长伴随着提取液浓度的降低，这对进一步的色素浓缩和精制有很大影响。综合考虑提取液浓度和提取量，选择料液比为1:10。

2.4.3 提取时间的筛选

表5：不同提取时间的花青素提取效果比较

从表5中可以看出，时间梯度处理对花青素提取率并没有显著影响，可以理解为试样中的花青素在极短的时间内已经完全析出。

2.4.4 提取次数的筛选

不同提取次数提取的花青素光谱扫描结果如图5所示，花青素提取效果如表6所示。

表6：不同提取次数的花青素提取效果比较

在表6中，从提取液浓度和得率（含量/4次提取量之和）2个方面来考虑。随着提取次数的增加，提取液中花青素的浓度逐渐降低，提取液浓度以第1次最高，为0.812mg/mL，第4次的提取液浓度仅为0.017mg/mL。得率随提取次数增加而降低，第1次为70.39%，第2次为22.22%，2次得率之和为92.61%。第3、4次的得率仅为6.13%和1.75%，且提取液浓度很低，另外在715nm处检测到一较高强度的未知成分（图5），提取液成分进一步复杂化。这些对进一步的色素浓缩和精制有很大影响。综合考虑提取液浓度和得率，认为提取2次的效果较为充分，并且提取液浓度较高易于进一步浓缩和精制。

从以上单因素实验可以看出，提取温度、提取时间对提取率几乎没有影响，所以可以认为紫色小白菜叶片冻干粉的花青素在35%体积分数的乙酸、25℃环境（即室温）下可以很快析出，几乎不受其他条件的影响，也就没有进行单因素间的交互试验。因此最佳提取方案为35%体积分数的乙酸，料液比1:10，25℃浸提，提取时间1min左右，提取次数2次。

3 讨论

3.1 关于紫色小白菜花青素的提取剂

通过试验，选定最佳提取剂为35%浓度的乙酸。这与先前花青素提取剂的研究结果有很大差异。前人多以盐酸-甲醇或盐酸-乙醇为提取剂^[10-12]，而本试验选定35%浓度的乙酸为提取剂，一方面是紫色小白菜中花青素和叶绿素含量均比较高，而甲醇或乙醇除了可以溶解花青素外对叶绿素的溶解度也很高；另一方面考虑到花青素在不同溶剂环境中有不同的特征峰和峰值，没有简单地以特征峰峰值作为比较花青素浓度的标准，至于如何对处在不同溶剂环境中的花青素进行浓度比较还未有人报道，尚需进一步试验。总之，对于花青素和叶绿素含量均较高的材料，35%浓度的乙酸较之前人的提取剂有很大的优越性。

3.2 关于紫色小白菜花青素的提取方法

一般认为浸提法提取时间长且提取率低，而超声波法可大大缩短提取时间且提取率高。而在研究却发现超声波辅助对提取率提高的贡献极低。一方面与紫色小白菜花青素分布于叶片表面有关，另一方面与本研究对叶片的高度粉碎有关。胡晓丹^[13]等以紫苏叶冻干粉（60目）为材料，发现超声波功率由150W升高到250W使花青素得率由4.25%升高到5.17%，增率很低，这也说明在材料充分粉碎的情况下，超声波的助提作用有限。

3.3 关于浸提法提取影响因素的单因素优化

提取温度和提取时间方面，前人的研究表明这2个因素对花青素提取率有很大影响。刘超^[14]以紫甘薯冻干粉为材料，发现40℃时的花青素测定液浓度150.01μg/mL显著高于20℃时的134.39μg/mL，90min的花青素测定液浓度163.36μg/mL显著高于30min的141.11μg/mL。而本试验发现这2个因素紫色小白菜花青素提取率没有影响，这除了和叶片的高粉碎度有关，也和紫色小白菜花青素分布于叶片表面而紫甘薯花青素遍布于块根有关。总之在提取前对材料进行充分的粉碎有利于减少提取过程中的能耗，并大幅缩减提取时间，是一种较为经济的做法。

以下是发明人给出的具体实施例，本发明不限于该实施例。

实施例：

紫色小白菜进入商品采收期后，采收其无病虫害的健康叶片，去除较为明显的叶脉，于-40℃下冷冻干干燥，粉碎至40目。准确称取冻干粉0.1g于离心管中，以1mL 35%体积分数的乙酸为提取剂，提取温度25℃，提取时间1min左右，共提取两次。14000rpm离心10min，上清液过滤膜得到花青素提取液。第1次的提取液稀释100倍后进行光谱扫描，花青素特征峰处吸光度为0.486，没有检测到叶绿素特征峰，换算后的花青素提取液浓度为0.812mg/ml。第2次的提取液稀释100倍后进行光谱扫描，花青素特征峰处吸光度为0.135，没有检测到叶绿素特征峰，换算后的花青素提取液浓度为0.225mg/ml。

两次得到的花青素提取液，根据要求可单独或合并后进行色素的浓缩和精制即得纯品。