抑制素重组融合蛋白在制备促进母猪发情和配种药物方面的应用

摘要

本发明公开了一种抑制素重组融合蛋白在制备促进母猪发情和配种药物方面的应用。所述抑制素对成年母猪的免疫中，首次免疫使用0.5mg～1mg抑制素重组蛋白；在首次免疫后15～21天后可以进行第二次免疫，使用0.25mg～0.5mg抑制素重组蛋白。免疫抑制素能使母猪的发情率升高，产仔数增加。本发明对克服母猪夏季热应激导致的乏情、促进种猪繁殖活动，特别是促进种母猪和后备母猪发情和提高产仔数具有显著的效果，从而减少种母猪的非生产时间，能提高种母猪的繁殖性能，提高母猪饲养的经济效益。

说明书

技术领域

本发明属于调控猪繁殖活动的免疫调控新技术领域，具体涉及一种抑制素重组融合蛋白在制备用于克服夏季热应激的不良影响、促进母猪的发情表现和配种等方面药物方面的应用。

背景技术

目前的畜牧业在集约化和产业化发展过程中，由于遗传育种技术、饲料配合技术、疫病防治技术、环境卫生技术和现代企业经营管理技术的应用，使畜牧业的生产效率得到了极大的提高。但各生产环节中，动物的繁殖性能在过去几十年却没有提高。主要体现在生产过程中由于各种原因特别是夏季热应激而经常造成动物发情表现低下或乏情，配种受胎率低下或返情率上升等现象。

为了提高动物的繁殖性能，很多畜牧行业的研究者尝试和探讨了很多方法。其中，对于母猪，现有技术大多数是采用注射外源的促性腺激素（如FSH）来促进动物卵泡发育和促进母猪发情配种。这一做法往往会激发来自优势卵泡和次级卵泡的机体本身的负反馈调节物质（如抑制素和卵泡抑素）的大量产生，而抑制素可以通过负反馈机制抑制垂体FSH的分泌，也直接抑制发育的卵泡，降低卵泡和卵子的质量。卵泡抑素通过结合活化素(ACT)中和抑制其生物学功能，也会降低发育中卵泡卵子的质量。因此使用其他促性腺激素类药物对乏情母猪催情时，往往会有相当一部分猪虽然发情配种却难以受胎最终表现返情率高的问题。

本申请人在申请号为200810218477.1的专利申请中提供了一种抑制素重组融合蛋白以及调控抗原的制备方法，并提出获得的抑制素重组融合蛋白以及调控抗原可以应用于提高奶牛在胚胎移植中可用胚胎数目方面的应用。但并没有涉及其在对乏情母猪催情以及促进配种方面的应用。

发明内容

本发明的一个目的在于克服现有技术对乏情母猪催情以及促进配种方面存在的不足，针对各种原因特别是夏季热应激造成乏情高龄母猪和乏情后备母猪发情表现低下或乏情、配种受胎率低下或返情率上升等问题，提供一种抑制素重组融合蛋白的新应用。

本发明还有一个目的是提供所述抑制素重组融合蛋白在制备促进母猪发情、成功配种和正常受胎的疫苗或药物方面的应用。

本发明上述目的通过以下技术方案予以实现：

本发明所述抑制素重组融合蛋白的制备方法在本申请人申请号为200810218477.1的专利申请中有详细叙述，同时，根据本申请人发明技术，采用本领域技术人员常用的真核方法制备得到的抑制素重组融合蛋白也可以应用于本发明。按照以下步骤分别准备油相、水相，将油相和水相按比例混合得到所述免疫原：

（1）将浓度为2～6 mg/mL 的抑制素重组融合蛋白（详可参见专利申请号为 200810218477.1中的描述）溶于含2～4％ Tween 80的水溶液中制成水相；

所述抑制素重组融合蛋白的制备方法包括以下步骤：

（a）根据现有的抑制素基因序列，设计特异性上游引物I1和下游引物I2；

所述上游引物I1和下游引物I2核苷酸序列为：

I1：5’-ATGTGGCCTCAGCTGCTCCTCTTGC-3’；

I2：5’-TTAGATGCAGGCACAGTGCTGGGTG-3’；

（b）采取异硫氰酸胍-氯仿-异丙醇方法从蓝塘猪卵巢组织中提取总基因组RNA，通过反转录得到cDNA；

（c）用引物I1、I2、dNTP和反转录合成cDNA作为模板，在DNA聚合酶的催化下通过PCR反应扩增猪抑制素的编码cDNA片段；

（d）根据抑制素成熟肽的cDNA碱基序列和大肠杆菌表达质粒pRSET A的多克隆位点碱基序列，设计合成上游引物Mf和下游引物Mr；

所述上游引物Mf和下游引物Mr核苷酸序列为：

Mf：5’-AATAGATCTTCTCCACCGCCCCTCTGCCC-3’；

Mr：5’-ATCGAATTCAGATGCAGGCACAGTGCTGGG-3’；

（e）利用所述引物Mf、Mr以及上述反转录扩增得到的抑制素的编码cDNA序列为模板，通过PCR反应扩增出抑制素成熟肽的cDNA克隆片段；

（f）所述抑制素成熟肽的cDNA克隆片段经过Bgl II和EcoR I双酶切后，克隆到表达质粒pRSET A的Bgl II和EcoR I两酶切位点之间，构建成重组表达质粒pInhibin SCAU；

（g）将所述重组表达质粒pInhibin SCAU 转化到大肠杆菌株，在培养液中加入0.05mmol/L～0.2 mmol/L的IPTG诱导，得到重组细菌表达的抑制素重组融合蛋白；

（2）将10号轻质白油和司本80按94%：6%的体积比混合，再加入浓度（w:v）为2％的硬脂酸铝，混合均匀制成油相；

（3） 将水相和油相按4～5 ：5～6的体积比混合，并搅拌制成油包水的均质乳液，即抑制素基因工程调控抗原。

本发明提供了所述抑制素重组融合蛋白在制备促进母猪发情、成功配种和正常受胎并提高产仔数疫苗方面的应用，将所述抑制素重组融合蛋白应用于制备抑制素基因工程调控抗原或者其他药物。

本发明提供优选的抑制素基因工程调控抗原应用方案：

第一次免疫为1ml含0.5mg～1mg抑制素重组融合蛋白油乳剂疫苗，或可以在第一次免疫后15～21天继续进行第二次免疫，第二次免疫为1ml 含0.25mg～0.5 mg抑制素重组融合蛋白油乳剂疫苗。

本发明采用“主动免疫”的途径将所述抑制素重组融合蛋白应用于调控猪的繁殖内分泌，免疫程序为：第1天首次免疫该重组蛋白，如果实验猪在3周内不表现发情，则在第21天进行加强免疫。加强免疫后，如果实验猪在之后的3周内仍不发情，则在第42天进行第三次加强免疫。一般母猪在两次免疫后都可以正常发情配种。采用肌肉注射的途径进行疫苗的注射。

本发明与现有技术相比具有如下有益效果：

（1）本发明制备的抑制素基因工程调控抗原无毒性、无致病性、无药物残留，对人畜无害，在对食用猪肉或其制品的消费者无不良影响的基础上成功实现本发明所述应用效果。

（2）经过本发明的创造性地改进，将免疫抑制素疫苗方面的应用于促进母猪发情、成功配种和正常受胎，比其他方法更能促进猪发情、减少非生产时间，并且能够很好地提高猪产仔数。

（3）本发明方法简单，容易操作，一般根据需要母猪表现发情的时间提前两周注射疫苗，即能产生非常好的效果。

本发明实验结果表明，利用本发明技术制备的免疫抑制素，可以促进长期不发情的母猪重新发情并正常配种，并且很好地提高母猪产仔数和繁殖性能，这能解决猪场的发情推迟或者不发情问题，减少猪场母猪的非生产时间。本发明拓宽了抑制素的应用范围，开发免疫抑制素技术在提高种母猪繁殖性能方面的应用。通过对处于热应激状态下乏情高龄母猪和乏情后备母猪免疫抑制素重组蛋白构成的乳剂免疫原，能有效地促进母猪发情、成功配种和正常受胎并提高产仔数，对促进养猪业生产的效率和提高经济效益都具有很好的意义和应用前景。

附图说明

图1 主动免疫抑制素（■）和对照组母猪（□）在实验中血液抗抑制素抗体效价,数据为平均数±标准误差,同组数据上标不同字母者差异显著(a, b: P<0.05）;

图2 抑制素基因编码区的电泳图谱;

图3 主动免疫抑制素对乏情高龄母猪发情变化的影响,箭头代表注射抑制素和采血样时间,圆点代表免疫抑制素组，三角代表对照组;

 图4主动免疫抑制素对乏情后备母猪发情变化的影响,箭头代表注射抑制素和采血样时间,圆点代表免疫抑制素组，三角代表对照组。

具体实施方式

以下结合实施例来进一步详细说明本发明，下述实施例中所使用的试验方法如无特殊说明，均为常规方法；所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，为可从商业途径得到的试剂和材料。

实施例1 猪免疫抑制素疫苗的制备

（1）猪抑制素编码基因cDNA的克隆：

a、根据GenBank中所发表的猪抑制素基因序列（Genbank号：NM_214189），设计出该基因的特异性上游引物I1和下游引物I2。上游引物I1（5’-ATGTGGCCTCAGCTGCTCCTCTTGC-3’）对应于猪抑制素基因编码区第1～25位核苷酸；下游引物I2（5’-TTAGATGCAGGCACAGTGCTGGGTG-3’）对应于猪抑制素基因编码区第1071～1095位核苷酸。所述猪抑制素基因全长1095bp，含完整的抑制素α亚基基因编码区序列。

b、取蓝塘猪卵巢组织，置于1ml异硫氰酸胍苯酚溶液（Trizol液，购于Invitrogen公司）中匀浆，然后用氯仿去除蛋白质，离心15分钟后取出上清液，向上清液中加入异丙醇再离心沉淀总基因组RNA，把总RNA配成1g/L的浓度溶于含DEPC的水中，通过反转录（RT）得到cDNA。

c、用引物I1、I2、dNTP和反转录合成cDNA作为模板，在DNA聚合酶的催化下通过PCR反应扩增得到一条长度为1095bp的特异性条带，即猪抑制素的编码cDNA片段，反转录扩增后的抑制素基因编码区的电泳图谱如附图2所示。

d、将扩增得到的猪抑制素编码cDNA片段与克隆质粒PMD18-T载体（购于上海生工公司）连接，然后将构建得到的重组质粒转化入大肠杆菌DH 5株（购于Invitrogen公司）进行复制、永久保存、并进行核苷酸序列测定。序列表中SEQ ID NO:1为用此方法反转录扩增得到的猪抑制素cDNA的核苷酸序列，其中大写部分分别对应I1和I2引物；该序列核苷酸为猪抑制素成熟肽的编码cDNA序列，该扩增的猪抑制素基因核苷酸序列与其它家畜的同源性在90%以上，因此完全可以用猪抑制素编码cDNA制备抑制素基因工程调控抗原。

（2）制备猪抑制素的重组融合蛋白：利用猪抑制素成熟肽的cDNA碱基序列，可以通过原核表达系统E.coli BL21 (DE3)株（购于Invitrogen公司）进行猪抑制素重组融合蛋白的表达：

a、根据测序所得到的猪抑制素cDNA的核苷酸序列，按其成熟肽的cDNA序列，设计合成上游引物Mf和下游引物Mr，其中，

Mf（5’-AATAGATCTTCTCCACCGCCCCTCTGCCC-3’）

Mf对应于SEQ ID NO:1所示序列猪抑制素基因编码区的第691～708位核苷酸序列，方框部分含Bgl II酶切位点，画线部分是维持阅读框架的碱基；

Mr（5’-ATCGAATTCAGATGCAGGCACAGTGCTGGG-3）

Mr对应于SEQ ID NO:1所示序列猪抑制素基因编码区的第1073～1093位核苷酸序列，方框部分含EcoR I 酶切位点。

b、利用引物Mf、Mr，以猪抑制素编码区cDNA片段作为模板和dNTP在Pfu DNA聚合酶催化下经PCR反应再次扩增出长度为423bp、两端带有Bgl II和EcoR I酶切位点的猪抑制素成熟肽的cDNA克隆片段，用于插入表达质粒pRSET A（购于Invitrogen公司）。

c、将该重组表达质粒pInhibin SCAU并转化Ecoli.BL21(DE3)株，在培养液中加入0.05mmol/L～0.2mmol/L的IPTG诱导4～6小时表达猪抑制素重组融合蛋白，表达情况如附图4所示，其中泳道2中靠近20kD的条带即所表达的抑制素a亚基重组融合蛋白。该猪抑制素重组融合蛋白可以被兔抗牛a-抑制素抗体特异识别。

（3）猪抑制素重组融合蛋白的纯化：

利用大肠杆菌表达的猪抑制素重组融合蛋白的氨基端具有6个连续组氨酸的标记（His-tag），这个His-Tag标记能够与镍离子发生特异亲和结合。因此，采用8M 尿素溶液裂解表达猪抑制素重组融合蛋白的细菌，将裂解液经过Ni-NTA树脂凝胶层析，可以纯化出其中的猪抑制素重组融合蛋白并将重组蛋白，而且该蛋白也可以被兔抗牛-抑制素抗体特异识别，然后将含该蛋白的溶液逐次透析洗去其中的尿素。

（4）按照以下比例分别准备油相、水相，将油相和水相按比例混合得到所述猪免疫抑制素疫苗（免疫原）；

（a）将浓度为2～6 mg/mL 的上述表达、纯化并透析后的猪抑制素重组融合蛋白（可参见专利申请号为200810218477.1的描述）溶于含2～4％ Tween 80的水溶液中制成水相；

（b）将10号轻质白油和司本80按94%和6%的体积比混合，再加入浓度（w:v）为2％的硬脂酸铝，混合均匀制成油相；

（c） 将水相和油相按4～5 ：5～6的体积比混合，并搅拌制成油包水的均质乳液，即抑制素基因工程调控抗原。

实施例2 应用实验

选择18头产过4或5胎（平均胎次为第4.7胎）的高龄母猪，因其最近一次分娩发生在夏季，断奶后因夏季高温天气而导致长时间乏情（平均空怀期27天），随机分为2组，每组9只，分别称为I组和C组。其中I组母猪免疫抑制素重组融合蛋白油乳剂疫苗，C组在同一时间注射生理盐水佐剂。

免疫程序：

对I组的母猪每隔21 d注射一次抑制素重组融合蛋白油乳剂疫苗，第一次使用1mL内含0.5mg重组猪抑制素融合蛋白的油乳剂疫苗，第二次免疫使用1mL含0.25mg重组猪抑制素融合蛋白的油乳剂疫苗。

表1所示的试验结果表明：免疫抑制素的９头母猪在40天内全部发情，累计发情率为100%；而到为期100天的试验结束时，对照组９头猪中只有３头发情，发情率为33.3%，见附图3所示。

对发情的母猪产仔数进行追踪记录并统计，免疫IHN组平均产仔数为12.25±1.03个，与对照组的9.3±0.67个相比，差异显著。表明对不乏情的母猪免疫抑制素能有效地提高母猪的发情率和产仔数。

表1：主动免疫抑制素和对照组猪的累计发情率和产仔数。

组别n发情母猪数发情率(%)平均产仔数实验组9910012.25±1.03^b对照组9333.39.30±0.67^a

注：同列数据上标不同字母者差异显著(a, b: P<0.05）

实施例3

选择8月龄而未发情的后备母猪20头，随机分为2组，每组10头，分别称为A组和B组。其中对A组后备猪免疫抑制素重组融合蛋白油乳剂疫苗，B组后备猪在同一时间注射生理盐水佐剂。

免疫程序：

对A组后备猪每隔21d注射一次抑制素重组融合蛋白油乳剂疫苗，第一次使用1mL含0.5mg重组猪抑制素融合蛋白的疫苗，第二次免疫使用1mL含0.25mg抑制素重组融合蛋白的疫苗。

实验结果显示：免疫抑制素的10头后备母猪在50天内的累计发情率为60%，而对照组仅为30%，见附图3所示。

实施例4 指标检测

（1）免疫后血液抗抑制素抗体效价：

采用常规的ELISA方法检测抗体效价的方法检测主动免疫抑制素的免疫的效果。利用抑制素重组蛋白包被96孔酶标板（每孔100 mL含6 mg蛋白）。封闭酶标板后向每孔加入稀释1600倍的血浆样品（血浆来自实验母猪血液） 100 mL，然后于 37℃孵育1h以使抗抑制素抗体与包被的抑制素蛋白结合。接着使用辣根过氧化物酶标记的兔抗猪IgG作为第二抗体（Santa Cruz Biotechnology， SantaCruz， CA， USA）结合源自血液中的抗IHN抗体，最后使用加体积比浓度为0.03%H₂O₂的TMB溶液显色，在用1mol/L硫酸终止反应后用酶标仪（Bio-Rad）测定450 nm波长的光吸收值作为抗体效价。

免疫后，母猪血液中抗抑制素抗体效价要显著高于未免疫的对照组猪，见附图1所示。

（2）母猪的发情和产仔数：

对长期（断奶后超过1个月）不发情的高龄经产母猪注射抑制素疫苗后，大部分母猪（接近80%）在免疫后两周左右发情，其余的在第二次免疫后表现发情并配种。而同期对照组猪仅30%左右表现发情并配种，见附图3所示。试验结束时的结果显示：免疫抑制素组的母猪发情率为100%，大大地高于对照组的33.3%。

经过一个妊娠期，免疫母猪分娩平均产仔12.25±1.03头，显著（P<0.05）高于对照组的9.30±0.67头。另外对已达8月龄而未发情的后备母猪免疫抑制素后，约60%的母猪表现发情并配种。而对照组在50天的试验期间则只有30%表现发情，见附图4所示。

SEQUENCE LISTING

 

<110>  华南农业大学

 

<120>  抑制素重组融合蛋白在制备促进母猪发情和配种药物方面的应用

 

<130> 

 

<160>  4    

 

<170>  PatentIn version 3.3

 

<210>  1

<211>  25

<212>  DNA

<213>  引物I1

 

<400>  1

atgtggcctc agctgctcct cttgc                                           25

 

 

<210>  2

<211>  25

<212>  DNA

<213>  引物I2

 

<400>  2

ttagatgcag gcacagtgct gggtg                                           25

 

 

<210>  3

<211>  29

<212>  DNA

<213>  引物Mf

 

<400>  3

aatagatctt ctccaccgcc cctctgccc                                       29

 

 

<210>  4

<211>  30

<212>  DNA

<213>  引物Mr

 

<400>  4

atcgaattca gatgcaggca cagtgctggg                                      30