量化和/或分析键特异性多泛素链的方法

摘要

本发明提供了一种量化和/或分析键特异性多泛素链的方法，该方法为：将报告蛋白分为N末端片段和C末端片段，将两个片段分别与泛素结合结构域(UBD)融合表达，然后将上述融合两个报告蛋白片段的UBD同时与目的样品作用；当UBD结合于特异多泛素链，报告蛋白的两段会互补形成完整功能的蛋白，然后通过对互补形成的完整报告蛋白检测来量化和/或分析键特异性多泛素链。并通过实验得到了能够在体外或细胞内结合分析K48或K63特异性多泛素链的EPN1的UIM与报告蛋白制备的融合蛋白。

说明书

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体地说，涉及一种量化和/或分析键特异性多泛素链的方法。

背景技术

泛素化(Ubiquitination)是将泛素连接在目的蛋白上。蛋白的泛素化调节了许多重要的生物功能，例如：目的蛋白降解，信号转导，病毒出芽(virus budding)，蛋白运输，受体与通道胞吞作用(receptor and channel endocytosis)。这些功能大都掌控者细胞的生死。因此，异常的泛素化与许多肿瘤和其它疾病的发生紧密联系起来。

作为底物的蛋白可以被单一泛素或泛素链修饰，通过七种赖氨酸残基(K6，K11，K27，K29，K33，K48，K63)之一或氨基端与泛素连接。很多中蛋白质都具有泛素结合结构域(ubiquitin-binding domain，UBD)，如泛素相互作用单元(ubiquitin-interacting motif，UIM)和泛素联合结构域(ubiquitin-associated(UBA)domain)，能识别泛素或泛素链，这种识别具有键特异性(linkage-specific)。这些蛋白会与信号通路下游效应物结合，意味着泛素化与特定的生物功能密切相关。由8种键形成的单一泛素化或多泛素化决定了泛素信号功能极大的多样性。然而，目前对特定键形成的泛素化的功能却知之甚少，主要是由于缺少适合的研究手段和技术。

目前，获知泛素连接的种类主要有以下几种方法：使用赖氨酸残基点突变的泛素，使用链特异性的单克隆抗体或应用质谱并结合免疫沉淀、免疫印记和/或荧光显微镜。这些方法的缺点在于：应用赖氨酸残基突变的泛素不能完全反映野生型泛素的多泛素化，并且过表达点突变的泛素可以对细胞功能产生严重的反向作用；尽管质谱与特异性的单克隆抗体可以用来分析野生型泛素的多泛素化，质谱却需要昂贵的仪器设备和专业技术，大多数实验室无法应用，而单克隆抗体不能用来量化多泛素化，也不能用来观察活细胞。

发明内容

基于上述不足，我们提出量化和分析键特异性多泛素链(由野生型泛素组成)的方法和技术，既可以用于体外检测，又能应用于活细胞。这种技术基于报告蛋白单体，例如：β-内酰胺酶(β-lactamase)、人源化的Gaussia luciferase或者荧光蛋白(如Venus)，两个片段间的互补作用(complementation of fragments of monomeric reporter proteins)。报告蛋白的N-端或C-端片段与泛素结合结构域(UBD)融合表达，UBD首先结合于特异泛素链，并介导了报告蛋白片段之间的互补。这样，泛素链的长度、丰度和细胞中的定位决定了有多少报告蛋白片段能够互补。因此，这一对UBD融合报告蛋白被命名为UCR(Ubiquitin Chain Reporter)。应用了某种泛素键特异性的UBD，UCR就会特异性的识别、报告此种多泛素链。在实验中，我们已经获得概念验证的体外、活细胞和固定细胞的数据。UCR技术的发展第一次使我们能够在活细胞中研究键特异性的多泛素链。UCR也能提供一种简单、通用、稳定、可量化的高通量体外分析键特异性多泛素链的方法。发展在体外和活细胞中分析键特异性多泛素链的新技术，可以很大程度上促进破解癌症和其他生物系统泛素信号通路这一谜题，也可促进泛素连接酶为靶向的药物开发。

本发明提供了一种量化和/或分析键特异性多泛素链的方法，该方法为：将报告蛋白分为N末端片段和C末端片段，将两个片段分别与泛素结合结构域(UBD)融合表达，然后将上述融合两个报告蛋白片段的UBD同时与目的样品作用；当UBD结合于特异多泛素链，报告蛋白的两段会互补形成完整功能的蛋白，然后通过对互补形成的完整报告蛋白检测来量化和/或分析键特异性多泛素链。该方法可以检测通过七种赖氨酸残基(K6，K11，K27，K29，K33，K48，K63)之一连接的多泛素链，优选K48或K63特异性连接的多泛素链。本发明所述的方法既可以用于体外检测，又能应用于活细胞。其作用方式如附图1所示。

本发明还提供了用于上述方法的融合蛋白，融合蛋白由报告蛋白的N末端片段或C末端片段与泛素结合结构域(UBD)通过linker连接而成；上述的泛素结合结构域优选为UIM，其来源于哺乳动物，优选来源于大鼠，氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示。

上述的报告蛋白选自β-内酰胺酶(β-lactamase)、荧光素酶(Gluc)或荧光蛋白。荧光蛋白可以是Venus，其可以分为N末端片段和C末端片段，优选N末端片段和C末端片段其序列分别如SEQ ID NO：2和SEQ ID NO：3所示。报告蛋白也可以是荧光素酶(Gluc)，其同样分为N末端片段和C末端片段，优选N末端片段氨基酸序列如SEQ ID NO：4所示；C端片段氨基酸序列如SEQ ID NO：5所示。

上述报告蛋白与UBD之间通过linker连接，所述linker优选如SEQ ID NO：6所示linker连接。

本发明的优点在于：

1.多泛素链有8种不同的连接方式，这使得泛素信号有惊人的功能多样性。然而，现有的研究键特异泛素化的技术有局限性，这阻碍了人们对复杂的泛素信号的认识。本发明所述的UCR技术，第一次使同时在体外和活细胞中研究键特异泛素化成为可能。最终我们会找到全部8种泛素链的UCR(现在已有两种)，在泛素研究领域带来技术变革。UCR技术的简单、通用、稳定、可量化和高通量的特性可以使其广泛应用于癌症、病理领域泛素相关研究，还有泛素连接酶为靶向的药物筛选。

2.本发明所述的UCR方法有以下的创新性：1)UBD介导的报告蛋白互补用来分析和量化键特异性泛素化是独一无二的新方法。2)UCR会是唯一能够兼顾体内(活细胞)、体外键特异性泛素化的技术。3)UCR技术可用于研究体内、体外野生型和/或内源性泛素形成的键特异性多泛素链；而目前常规分析泛素链类型的方法几乎完全依赖于应用赖氨酸突变的泛素和质谱方法。4)体外UCR技术简便、免洗、稳定、可量化、高通量、背景低，并且不需要化学标记和昂贵的仪器设备，也不需要特殊技能，现在没有哪一种技术具有所有这些优点。体内UCR是第一种能够用来定位内源K48和K63泛素链并成像的技术。这些优越性会使UCR被许多生物学家采用，并成为重要的药物筛选技术。

附图说明

图1.UCR技术原理及方式模拟图：Reporter-N代表报告蛋白的N末端片段；Reporter-C代表报告蛋白的C末端片段；报告蛋白的两个片段N末端和C末端分别与键特异性UBD融合，报告基因可以是荧光素酶(Gluc)，内酰胺酶(Blac)或者荧光蛋白，如Venus，如图1A所示；当一对UBD融合蛋白同时结合到多泛素链上，报告蛋白的两段足够接近，会互补形成完整功能的蛋白，如图1B所示；因为单体泛素只能结合在二者之一，所以仅有泛素单体时不会形成互补，这就形成了UCR技术的低背景。

图2.UIM^Epn1-GlucN/C体外识别相关多泛素链柱状图。

图3.UIM^Epn1制备的融合蛋白在HeLa细胞中共表达检测多泛素链的结果：A为使用抗polyubiquitin的FK2抗体的成像图；B中a-c为使用抗K48特异性抗体的成像图，e-f为使用抗K63特异性抗体的成像图；Aa和Ad中蓝色荧光为polyubquitin染色，Ab为单一UIM^Epn1-VenusN无荧光，Ac为前两者的叠加结果，Ae黄色荧光为完整UCR(UIM^Epn1-VenusN和UIM^Epn1-VenusC)，Af为前两者的叠加结果；Ba中蓝色荧光为K48染色，Bb黄色荧光为UCR，Bc为钱两者的叠加结果，Bd中蓝色荧光为K63染色，Be黄色荧光为UCR，Bf为钱两者叠加的结果。

图4.UIM^Epn1制备的融合蛋白的活细胞成像图：图中左侧的一列图为：发出黄色荧光的UCR(K48特异多泛素链)；中间的一列为：蓝色荧光(ECFP)标记的表皮生长因子受体(EGFR)；右侧一列为：前两列叠加的结果。

具体实施方式

实施例1：制备UIM^Epn1-GlucN/C及相关泛素链结合实验

制备UIM^Epn1-GlucN/C方法：大鼠UIM^Epn1基因由RT-PCR得到，去掉信号肽后的UIM^Epn1的cDNA编码序列分别与编码Gluc N端1-93氨基酸(SEQ ID NO：4)的核酸序列和编码C端94-169氨基酸(SEQ ID NO：5)的核酸序列通过linker连接进入pET28a原核表达载体(pET28a-UIM^Epn1-GlucN/C)，其中linker的氨基酸序列为GGGGSGGGGS(SEQ ID NO：6)，此序列使用在所有UBD和报告蛋白之间，起到增加柔性的作用，使报告蛋白片断之间易于接近形成互补(图1)，但此linker并不仅限于SEQ ID NO：6所示序列，本领域技术人员能够根据需要确定适合的linker。UIM^Epn1-GlucN/C表达为带有His标签的蛋白，分别经由Ni柱纯化，透析，溶解在PBS中。

反应体系中使用了GLuc细胞裂解缓冲液(Luciferase Cell Lysis Buffer，NEB Catalog#B3321S)，简称Gluc缓冲液；两种UCR(即UIM^Epn1-GlucN、UIM^Epn1-GlucC)；将上述缓冲液和UCR在4℃，反应60min，然后加入100ul荧光素酶底物(20uM)，酶标仪读数。测试结果如图2所示。

图2中的7个柱状图示分别代表7种不同的反应体系组成，其中1为：Gluc缓冲液(20ul)+UIM^Epn1-GlucN(3ug)；2为：Gluc缓冲液(20ul)+UIM^Epn1-GlucC(3ug)；3为：Gluc缓冲液(20ul)+UIM^Epn1-GlucN(1.5ug)+UIM^Epn1-GlucC(1.5ug)；4为：含100ng K48多泛素链(Enzo)的Gluc缓冲液(20ul)，不添加UCR；5为：含100ng K63多泛素链(Enzo)的Gluc缓冲液(20ul)，不添加UCR；6为：含100ng K48多泛素链(Enzo)的Gluc缓冲液(20ul)+UIM^Epn1-GlucN(1ug)+UIM^Epn1-GlucC(1ug)；7为：含100ng K63多泛素链(Enzo)的Gluc缓冲液(20ul)+UIM^Epn1-GlucN(1ug)+UIM^Epn1-GlucC(1ug)。

结论：由图2的结果可以看出，当同时存在多泛素链(K48或K63泛素链)和两种UCR(UIM^Epn1-GlucN和UIM^Epn1-GlucC)时，出现了明显的荧光结果，而单独存在多泛素链或两种UCR时没有明显的荧光结果。也就是说，上述两种UCR能够结合到K48或K63多泛素链，并通过GlucN和GlucC互补产生荧光效果。因此，在体外，UIM^Epn1-GlucN、UIM^Epn1-GlucC可定量和/或定性分析检测K48和K63多泛素链。

实施例2：UIM^Epn1制备的融合蛋白在HeLa细胞中共表达检测多泛素链的结果

方法：大鼠UIM^Epn1基因由RT-PCR得到，去掉信号肽后的UIM^Epn1cDNA编码序列分别与编码Venus N端1-155氨基酸(SEQ ID NO：2)的核酸序列和编码C端156-239氨基酸(SEQID NO：3)的核酸序列通过linker连接进入pCDNA3哺乳动物细胞表达载体(pCDNA3-UIM^Epn1-VenusN/C)，其中linker的氨基酸序列为GGGGSGGGGS(SEQ ID NO：6)。用Lipofectamine 2000(invitrogen，Catalog#11668019)将两种质粒分别或共转染HeLa细胞，24小时后用4％多聚甲醛固定细胞，并用抗polyubiquitin的FK2抗体(1∶1000，Enzo Catalog#BML-PW0755-0100)或抗K48多泛素链特异性抗体(1∶1000，Millipore Catalog#05-1307)或抗K63多泛素链特异性抗体(1∶100，Millipore Catalog#05-1308)和带有蓝色荧光的二抗免疫染色，高倍显微镜下观察并拍照，结果如图3所示。

UIM^Epn1与黄色荧光蛋白VFP片段融合得到UIM^Epn1-VenusN和UIM^Epn1-VenusC，二者在HeLa细胞中共表达，可观察到在细胞核和细胞质中的黄色荧光，图3Ae，而单一片断在HeLa表达时不发荧光，图3Ab。用抗polyubiquitin FK2抗体标记的多泛素链有蓝色荧光，结果表明蓝色荧光很多与黄色荧光有共同定位，如图3Ad-f所示。

分别用抗K48和抗K63多泛素链的抗体标记细胞中的多泛素链，结果如图3B所示，在体内UIM^Epn1-VenusN和UIM^Epn1-VenusC的黄色荧光与K48多泛素链的蓝色荧光有共同定位，而与K63多泛素链没有共同定位；也就是说，在体内，UIM^Epn1-VenusN和UIM^Epn1-VenusC能够特异性结合K48多泛素链，而与K63多泛素链没有结合。

实施例3：UIM^Epn1制备的融合蛋白的活细胞成像图

按照实施例2中的方法将编码EGFR-ECFP的质粒和上述制备的两种分别表达UIM^Epn1-VenusN和UIM^Epn1-VenusC的质粒共同转染HeLa细胞，24小时后，去除培养液，加入HBSS，2h后用加入表皮生长因子(EGF)的无酚红培养液代替HBSS，开始计时。37℃观察并拍照，分析20min之内的图像，从加入EGF溶液后2-7min开始拍照保存图像，结果如图4所示。

由上述图4所示的结果可以得出：上面图中UCR点与EGFR有共同定位(即图中所指位置)；而最下面一排三个图中指示的UCR点与EGFR没有共同定位(即图中所指位置)；也就是说，在体内UIM^Epn1-VenusN和UIM^Epn1-VenusC与K48多泛素链特异性结合，且该K48多泛素链特异性的UCR(UIM^Epn1-VenusN和UIM^Epn1-VenusC)与一少部分带有CFP标签的表皮生长因子受体(EGFR-CFP)有共同定位；这与已报道的有6.9％的EGFR被K48泛素化相吻合。

由上述实施例我们得出，本发明所述的方法的确能够量化和/或分析键特异性多泛素链，特别是本发明中使用的UIM^Epn1制备的融合蛋白，可以在体外结合K48和K63多泛素链，在细胞内结合K48多泛素链；即可用于在体外或细胞内定量和/或定性分析检测K48和/或K63多泛素链。