一种测定碱性蛋白酶活力的酶谱方法

摘要

一种测定碱性蛋白酶活力的酶谱方法，包括凝胶配制步骤和电泳步骤，电泳用聚丙烯酰胺凝胶由两种不同组分配比的聚丙烯酰胺凝胶组成。本发明提供的方法，解决了用普通SDS-PAGE进行酶谱实验后无法正常检测到碱性蛋白酶活性的问题。本方法能够有效专一灵敏的检测碱性蛋白酶活力。

说明书

 

技术领域

本发明属于生物蛋白酶检测技术领域，具体涉及一种测定碱性蛋白酶活力的酶谱方法。

背景技术

酶谱法（zymography）是一种在SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）技术的基础上通过特异性底物和丙烯酰胺共聚合来测定酶活性的电泳检测技术。明胶酶谱法是测定蛋白酶活性的一种常用手段，因该技术能测定多种降解明胶的蛋白酶活性，且具有方法简单、检测结果直观和定量等优点，近年来被广泛应用于生物蛋白酶检测技术领域。

然而，大量的检测数据显示该方法仍存在一些缺点。如：1、缺乏一种能够适用于多数蛋白酶的通用方法。2、缺乏特异性更高且能和丙烯酰胺偶联的底物。3、难以测定一些SDS敏感蛋白酶的活性。4、难以测定一些含碱性蛋白酶的组分的活性。

相关文献:

相关的美国专利包括：7，153，660 B2， US2003/0171271 A1。相关日本专利包括：JP20010023781， JP20010131， JP20040299951， JP20041014。相关文献包括： Choi NS et al.， 2006， J. Microbiol. Biotechnol. 16:457-464; Boonyaras Kim SH and Choi NS， 2000， Biosci.， Biotechnol.， Biochem. 64:1722-1725; Cristiane M.C. de Salles et al.， 2006， Anal. Biochem. 357:153-155; Christa Heussen and Eugene B. Dowdle， 1980， Anal. Biochem. 102:196-202; Eiichi Saitoh et al.， 2007， Anal. Chem. Insights 2:51-59; Choi NS and Kim SH， 2000， Anal. Biochem. 281(2):236-8; Choi NS et al.， 2005， J. Microbiol. Biotechnol. 15:35-39; Jeff Wilkesman and Liliana Kurz， 2009， Recent Pat. Biotechnol. 3:175-184; Choi NS et al.， 2009， Anal. Biochem. 386:121-122; Choi NS et al.， 2001， J. Biochem. Mol. Biol. 34:531-536;Choi NS et al.， 2003， J. Biochem. Mol. Biol. 37:298-303; PA Snoek-van Beurden and JW Von den Hoff， 2005， BIOTECHNIQUES  38:73-83; Choi NS et al.， 2005， J. Microbiol. Biotechnol. 15:537-543; R. Porcel et al.， 2001， J. Colloid Interface Sci. 239:568-576; A Granelli-Piperno and E Reich， 1978， J. Exp. Med.; TM Leber and FR Balkwill， 1997， 249:24-28; 骞爱荣等， 2003， 解放军医学杂志， 28：282-283; 姜微波等， 2002， 植物学通报， 19:607-610。

发明内容

技术问题：本发明的目的在于解决酶谱测定时碱性蛋白酶活性难以检测的问题，对现有基于SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）基础上的酶谱方法进行了改进，提供了一种检测碱性蛋白酶活性的方法。该方法的效果要明显好于用增加电泳时间来检测碱性蛋白酶的酶谱改进方法。

技术方案：本发明的技术方案为一种测定碱性蛋白酶活力的酶谱方法，包括凝胶配制步骤和电泳步骤，电泳用聚丙烯酰胺凝胶由两种不同组分配比的聚丙烯酰胺凝胶组成：

a. 聚丙烯酰胺凝胶I由7质量份丙烯酰胺混合溶液I和1质量份浓缩胶缓冲液组成，其中：

（1）丙烯酰胺混合溶液I由丙烯酰胺、过硫酸铵、N,N,N′,N′-四甲基二乙胺（TEMED）和超纯水组成，该溶液中丙烯酰胺质量体积比为6.67%、过硫酸铵质量体积比0.133%、N,N,N′,N′-四甲基二乙胺（TEMED）质量体积比0.133%。

（2）浓缩胶缓冲液由氢氧化钾、冰乙酸和超纯水组成，该溶液中氢氧化钾质量体积比为2.7%，冰乙酸体积比为2.87% ，pH6.7。

b. 聚丙烯酰胺凝胶II由7质量份丙烯酰胺混合溶液II和1质量份分离胶缓冲液组成，其中：

（1）丙烯酰胺混合溶液II由丙烯酰胺、明胶、过硫酸铵、N,N,N′,N′-四甲基二乙胺（TEMED）和超纯水组成，该溶液中丙烯酰胺质量体积比为13.33%、过硫酸铵质量体积比0.133%、N,N,N′,N′-四甲基二乙胺（TEMED）质量体积比0.133%、明胶质量体积比0.133%。

（2）分离胶缓冲液由氢氧化钾、冰乙酸和超纯水组成，该溶液中氢氧化钾质量体积比为2.7%，冰乙酸体积比为17.2% ，pH4.3。

c. 上述两种聚丙烯酰胺凝胶分别配制完成后，按照体积比聚丙烯酰胺凝胶I：聚丙烯酰胺凝胶II=2:5，用于制备电泳用聚丙烯酰胺凝胶。

本发明的技术方案所述的测定碱性蛋白酶活力的酶谱方法，样品缓冲液中含有质量体积比为1%的十六烷基三甲基，体积比为25%的甘油，质量体积比为0.002％甲基绿，体积比为12.5% 浓缩胶缓冲液，pH6.7。

凝胶制好后，按照生物化学常规电泳方法制备所需要的其它溶液，并参照常规操作或根据情况适当调整进行蛋白酶电泳和酶谱分析。

本发明可以应用于微生物、植物和动物体中得到的碱性蛋白酶的电泳和酶谱分析。

有益效果：本发明提供了一种检测碱性蛋白酶活性的方法，解决了用普通SDS-PAGE进行酶谱实验后无法正常检测到碱性蛋白酶活性的问题。本方法能够有效专一灵敏的检测碱性蛋白酶活力。

附图说明

图1 基于SDS-PAGE的酶谱法测定碱性蛋白酶活性(泳道A、B)。图1（泳道A）简称为图1（A），图1（泳道B）简称为图1（B）。

图2基于SDS-PAGE的酶谱法测定非碱性蛋白酶和碱性蛋白酶活性。符号M以下的蛋白条带为蛋白质分子量标记，图左边和符号M下面的蛋白条带对应的数字标记出了各蛋白条带的分子量大小。图2（泳道A）简称为图2（A），该泳道蛋白为非碱性蛋白酶，图2（泳道B）简称为图2（B），该泳道蛋白为碱性蛋白酶。

图3 本方法检测碱性蛋白酶的活性。图3（泳道A）简称为图3（A），该泳道蛋白为非碱性蛋白酶，图3（泳道B）简称为图3（B），该泳道蛋白为非碱性蛋白酶，图3（泳道C）简称为图3（C），该泳道蛋白为碱性蛋白酶，图3（泳道D）简称为图3（D），该泳道蛋白为碱性蛋白酶。

具体实施方式

文中所述质量体积比单位为g/mL，体积比单位为mL/mL。

实施例1：

现采用该方法，对蛋白酶粗酶液经层析纯化后各组分进行酶谱检测，并比较了不同方法对不同蛋白酶组分分析的差异，作为该方法检测实例。

菌株：一株地衣芽孢杆菌（CGMCC No.1.807），这些菌株均为普通微生物保藏中心可以购买到的菌株。

培养条件：55℃培养24小时。发酵产酶条件：基础培养基30℃培养48小时左右。

样品制备：用基础培养基发酵地衣芽孢杆菌（CGMCC No.1.807），培养48小时后将菌液离心收集粗酶液。粗酶液经硫酸铵沉淀后，通过层析分离到耐热蛋白酶组分。粗酶液和经层析得到的蛋白组分中包含碱性蛋白酶和中性蛋白酶，用普通SDS-PAGE进行酶谱实验后无法正常检测到碱性蛋白酶活性，因为碱性蛋白酶会在胶顶端形成一个“绑定”区域，无法跑入胶中进行分离。

蛋白酶活性检测：

1、聚丙烯酰胺凝胶的配制:

a. 聚丙烯酰胺凝胶I由3质量份丙烯酰胺混合溶液I和1质量份浓缩胶缓冲液组成，其中：

（1）丙烯酰胺混合溶液I由丙烯酰胺、过硫酸铵、N,N,N′,N′-四甲基二乙胺（TEMED）和超纯水组成，该溶液中丙烯酰胺质量体积比为6.67%、过硫酸铵质量体积比0.133%、N,N,N′,N′-四甲基二乙胺（TEMED）质量体积比0.133%。

（2）浓缩胶缓冲液为 0.5 mol/L Tris-HCL溶液，pH 6.8。

b. 聚丙烯酰胺凝胶II由3质量份丙烯酰胺混合溶液II和1质量份浓缩胶缓冲液组成，其中：

（1）丙烯酰胺混合溶液II由丙烯酰胺、明胶、过硫酸铵、N,N,N′,N′-四甲基二乙胺（TEMED）和超纯水组成，该溶液中丙烯酰胺质量体积比为13.33%、过硫酸铵质量体积比0.133%、N,N,N′,N′-四甲基二乙胺（TEMED）质量体积比0.133%、明胶质量体积比0.133%。

（2）分离胶缓冲液为 0.5 mol/L Tris-HCL溶液，pH 8.8。

c. 上述两种聚丙烯酰胺凝胶分别配制完成后，按照体积比聚丙烯酰胺凝胶I：聚丙烯酰胺凝胶II=2:5，用于制备电泳用聚丙烯酰胺凝胶。

2、凝胶制好后，取样品与样品缓冲液(样品缓冲液由蔗糖、溴酚蓝、Tris-HCl组成，该溶液中蔗糖质量体积比为2％，溴酚蓝质量体积比为0.2％； Tris碱质量体积比为0.6%，pH 6.8)一比一混合均匀后点样。上样后，将冰浴的电泳槽放入4℃冰箱，以60V电压使样品压成一条直线并进入分离胶，然后将电压增至100V，继续电泳至溴酚蓝前沿泳出分离胶时，停止电泳。取下凝胶，将胶置于洗脱液(该溶液由聚乙二醇辛基苯基醚（Triton X-100）、CaCl_2、Tris-HCl组成，其中Triton X-100质量体积比为2.5%， Tris碱质量体积比为0.6%，CaCl₂质量体积比为0.05%，pH7. 5) 中振荡洗脱2次，每次30分钟，然后用漂洗液(除不含TritonX-100外其余同洗脱液) 漂洗2次，每次10分钟，接着将胶置于孵育液(该溶液由CaCl₂、NaCl、Tris-HCl组成，其中CaCl₂质量体积比为0.05%，Tris碱质量体积比为0.6% NaCl质量体积比为0.87% ，pH7.5) 中55℃ 恒温孵育2h。孵育结束后经染色液(该溶液由考马斯亮蓝、甲醇、冰乙酸组成，其中考马斯亮蓝质量体积比为0.1%、甲醇质量体积比为45%、乙酸质量体积比为10%)染色20min，及脱色液A、B(甲醇体积浓度分别为30%、20% ，乙酸体积浓度分别为10%、10%)分别脱色0.5h、1h后，显示出蛋白酶为位于深色背景上的清晰透亮条带，条带亮度的强弱和面积大小经过浓度分析后可以定量地表征蛋白酶的活性高低。于凝胶成像系统进行图像采集见图1（A），图1（B），图2（A），图2（B）。图1(A)为上样缓冲液中添加SDS的碱性蛋白酶组分，图1(B)为上样缓冲液中不添加SDS的碱性蛋白酶组分。由图1(A)和(B)中蛋白条带可见碱性蛋白酶在基于SDS-PAGE的酶谱检测中会在分离胶顶端堆积，形成一块“绑定”区域无法有效分离，这是由于其等电点高于分离胶的等电点，而活性染色不能用加热的方法使蛋白完全变性，导致蛋白样品上的负电荷不足。图2(A)为非碱性蛋白酶，图2(B)为碱性蛋白酶。

3、聚丙烯酰胺凝胶的配制:

a. 聚丙烯酰胺凝胶I由7质量份丙烯酰胺混合溶液I和1质量份浓缩胶缓冲液组成，其中：

（1）丙烯酰胺混合溶液I由丙烯酰胺、过硫酸铵、N,N,N′,N′-四甲基二乙胺（TEMED）和超纯水组成，该溶液中丙烯酰胺质量体积比为6.67%、过硫酸铵质量体积比0.133%、N,N,N′,N′-四甲基二乙胺（TEMED）质量体积比0.133%。

（2）浓缩胶缓冲液由氢氧化钾、冰乙酸和超纯水组成，该溶液中氢氧化钾质量体积比为2.7%，冰乙酸体积比为2.87% ，pH6.7。

b. 聚丙烯酰胺凝胶II由7质量份丙烯酰胺混合溶液II和1质量份分离胶缓冲液组成，其中：

（1）丙烯酰胺混合溶液II由丙烯酰胺、明胶、过硫酸铵、N,N,N′,N′-四甲基二乙胺（TEMED）和超纯水组成，该溶液中丙烯酰胺质量体积比为13.33%、过硫酸铵质量体积比0.133%、N,N,N′,N′-四甲基二乙胺（TEMED）质量体积比0.133%、明胶质量体积比0.133%。

（2）分离胶缓冲液由氢氧化钾、冰乙酸和超纯水组成，该溶液中氢氧化钾质量体积比为2.7%，冰乙酸体积比为17.2% ，pH4.3。

c. 上述两种聚丙烯酰胺凝胶分别配制完成后，按照体积比聚丙烯酰胺凝胶I：聚丙烯酰胺凝胶II=2:5，用于制备电泳用聚丙烯酰胺凝胶。

4、凝胶制好后，取样品与以甲基绿为示踪剂，以CTAB为助溶剂的样品缓冲液（样品缓冲液中含有质量体积比为1%的十六烷基三甲基，体积比为25%的甘油，质量体积比为0.002％甲基绿，体积比为12.5% 浓缩胶缓冲液，pH6.7）混合均匀后点样。上样后，将冰浴的电泳槽放入4℃冰箱，以60V电压使样品压成一条直线并进入分离胶，然后将电压增至100V，继续电泳至甲基绿前沿泳出分离胶时，停止电泳。取下凝胶，将胶置于洗脱液(该溶液由聚乙二醇辛基苯基醚（Triton X-100）、CaCl_2、Tris-HCl组成，其中Triton X-100质量体积比为2.5%， Tris碱质量体积比为0.6%，CaCl₂质量体积比为0.05%，pH7. 5) 中振荡洗脱2次，每次30分钟，然后用漂洗液漂洗2次，每次10分钟，接着将胶置于孵育液(该溶液由CaCl₂、NaCl、Tris-HCl组成，其中CaCl₂质量体积比为0.05%，Tris碱质量体积比为0.6% NaCl质量体积比为0.87% ，pH7.5) 中55℃ 恒温孵育2h。孵育结束后经染色液(该溶液由考马斯亮蓝、甲醇、冰乙酸组成，其中考马斯亮蓝质量体积比为0.1%、甲醇质量体积比为45%、乙酸质量体积比为10%)染色20min，及脱色液A、B(甲醇体积浓度分别为30%、20% ，乙酸体积浓度分别为10%、10%)分别脱色0.5h、1h后，显示出蛋白酶为位于深色背景上的清晰透亮条带。于凝胶成像系统进行图像采集见图3。图3泳道A、B中的蛋白均为通过层析分离到非碱性蛋白酶组分，该组分能在基于SDS-PAGE的酶谱中正常检测，但无法在用于检测碱性蛋白酶活力的本方法中被检测到。图3泳道C、D分别为上样缓冲液添加CTAB的碱性蛋白酶组分和上样缓冲液中不添加CTAB的碱性蛋白酶组分。由图3可见，无论是否添加CTAB，碱性蛋白酶样品都在背景上留下了清晰透露的条带，而添加CTAB后酶谱效果更佳。证明了本方法能够有效专一灵敏的检测碱性蛋白酶活力。