一种防治油茶软腐病的内生拮抗菌株及其应用

摘要

本发明公开了一种防治油茶软腐病的内生拮抗菌株及其应用，该菌株为解淀粉芽孢杆菌L46，Bacillus amyloliquefaciens sp.L46，保藏号CCTCC M2010324。所述解淀粉芽孢杆菌L46经平板对峙试验筛选所得，能够有效抑制油茶软腐病菌的生长，防效高，环境安全性好，具有良好的开发应用前景。

说明书

技术领域

本发明属于植物保护领域，具体涉及一种防治油茶软腐病的内生拮抗菌株及其应用，尤其涉及一种高效防治油茶软腐病的解淀粉芽孢杆菌L46及应用。

背景技术

油茶(Camellia oleifera)是我国特有的食用油料树种，亦是世界四大木本油料树种之一，已有2000多年的利用和栽培历史。它适应性广，抗逆性强，适种于广大的红壤丘陵低地区。主要生长在南方，以湖南、江西、广西为主，其中湖南省是国内最大的油茶产地和最大的茶油消费区。

目前，油茶的病害种类繁多，其危害程度也愈发严重。每年因病害而造成的经济损失难以估计，其中油茶软腐病是一种常见的油茶病害。油茶软腐病是病原为油茶伞座孢菌(Agari-codochium camelliae Liu，Wei et Fan)，属半知菌丝孢纲丛梗孢目伞座孢属。在成年油茶林内，此病甚少对整片茶林造成威胁，但感病单株大量落叶落果，造成很大损失。油茶软腐病现已成为补充检疫对象。

在我国南方各省，油茶软腐病均有不同程度危害。该病主要危害油茶叶片和果实，受害部位腐烂，并造成大量落叶和落果，甚至叶、果落光。在苗圃中，油茶职业受害相当严重，甚至整株枯死。油茶软腐病现已成为补充检疫对象。目前，对油茶软腐病的防治主要以化学防治为主，但是长期、反复和大量使用化学农药存在着潜在的危害，它引起土壤、水体和大气的污染，农副产品中农药残留增加，造成食品安全性问题日益严重，以及化学农药在杀病原菌的同时也破坏了生态平衡。同时病原真菌和细菌抗药性不断加深和扩大，从而会造成化学农药应用的恶性循环。利用生物防治即微生物代谢产物(农用抗生素)或微生物活菌制剂防治植物病害不仅避免了化学农药带来了一系列问题，已经发展成为植病防治中十分重要的有效措施之一。生物防治以其安全、高效及无污染等特点已经成为植物病害防治的重要途径，其中拮抗细菌在植物病害生物防治中起到非常重要的作用，其主要优势在于：1)种类和数量众多，在植物叶际、叶内大量存在；2)对病原菌的作用方式多种多样，包括竞争、拮抗、寄生、诱导植物抗性的产生等；3)繁殖速度快；4)许多细菌在植物的叶内或叶际定殖力强；5)细菌大多能够人工培养，易于操作，便于生产应用；6)有些细菌不仅能够防治病害而且可以增加作物产量。

从油茶植株内分离筛选获得对油茶软腐病菌具有拮抗作用的生防菌株，对油茶软腐病的防治具有重要的意义，但目前相关技术仍旧很薄弱甚至空白，至今20多年能有效防治油茶软腐病病的拮抗细菌未见报道，也没有防治油茶软腐病的生物农药的报道。

发明内容

本发明的目的是针对现有技术的空白，提供一种高效防治油茶软腐病的内生拮抗菌株解淀粉芽孢杆菌L46，解淀粉芽孢杆菌L46是一种从油茶植株内分离筛选获得对油茶软腐病菌具有拮抗作用的生防细菌菌株，对油茶软腐病的防治具有重要意义。

本发明另一个目的是提供所述高效防治油茶软腐病的解淀粉芽孢杆菌L46在防治软腐病灾害方面的多种应用。

本发明的高效防治油茶软腐病的解淀粉芽孢杆菌L46，Bacillus amyloliquefaciens sp.L46，已于2010年11月30日，在中国典型培养物保藏中心进行了保藏，保藏号CCTCC M 2010324。其在牛肉膏蛋白胨培养基上菌落呈乳白色，圆形或近圆形，边缘不规则，中央隆起，干燥折皱，不透明，不产生色素，菌落直径一般2～3mm，菌体杆状，芽孢中生，革兰氏染色阳性。

本发明所述高效防治油茶软腐病的解淀粉芽孢杆菌L46通过平板对峙试验筛选获得。

本发明还提供了所述高效防治油茶软腐病的解淀粉芽孢杆菌L46的应用，其一是对油茶软腐病病菌菌丝的抑制作用。

其二是对油茶软腐病病菌菌丝的致畸作用。

其三是对油茶软腐病病菌菌丝分生孢子萌发的抑制作用。

本发明的有益效果是：

(1)解淀粉芽孢杆菌L46为植物内生细菌，对油茶软腐病菌抑制作用强，对多种病原真菌具有拮抗作用，具有拮抗细菌在植物病害生物防治中所起到的非常重要的作用，例如种类和数量众多，在植物叶际、叶内大量存在；对病原菌的作用方式多种多样；繁殖速度快等优点，尤其是对油茶软腐病的防治具有重要意义。

(2)菌株培养条件简单，容易保存，易于工业化生产，具有良好的开发应用前景。

附图说明

图1为L46菌株的菌落形态图片；

图2为L46菌株的系统发育树图片；

图3为L46菌株对油茶软腐病菌的平板对峙拮抗作用图片；

图4为10×100倍显微镜下观察到的解淀粉芽孢杆菌L46对油茶软腐病菌丝的致畸作用图片；

其中1：正常菌丝的病原菌菌丝(10×100)；2：前期菌丝膨大突出(10×100)。

具体实施方式

本发明提供解淀粉芽孢杆菌L46新菌株，其展现出对油茶软腐病具有较强的拮抗活性。

本发明的菌株分离自油茶叶。

本发明的解淀粉芽孢杆菌L46显示出以下形态和生化特征：在牛肉膏蛋白胨培养基上菌落呈乳白色，圆形或近圆形(见图1)，边缘较整齐，中央隆起，干燥褶皱，不透明，不产生色素，菌落直径一般2～3mm，菌体杆状，革兰氏染色阳性，芽孢中生。菌株的生化反应过氧化氢酶、葡萄糖发酵、需氧性测定呈阳性，V-P、甲基红反应阴性，其生长能水解淀粉、明胶。

本发明的解淀粉芽孢杆菌L46，经16S rDNA序列分析，构建系统发育树，表明其与Bacillusamyloliquefaciens具有很高的亲缘性(见图2)。

下面结合实施例对本发明作进一步的详细说明，而不会限制本发明。

实施例1解淀粉芽孢杆菌L46的分离

取普通油茶健康叶，采用常规法进行分离、纯化和保存。

油茶叶用水冲洗干净后，选取适量的健康组织，分别称量后，剪成5mm×5mm的组织块，在75％乙醇中浸泡1min，然后在0.1％升汞溶液中浸泡40s～70s，再放入75％乙醇浸泡30s，取出后用无菌水冲洗4次。在无菌研钵内加入10ml的无菌水和少许灭过菌的石英砂研磨成匀浆，加盖静置30min，将匀浆10倍系列稀释后，用移液枪分别吸取0.1ml至准备好的NA平板上，涂抹均匀后放入培养箱培养，48h后记录菌量，并根据菌落形态、颜色和大小选取，在平板上进行纯化保存，共分离5个批次。

实施例2解淀粉芽孢杆菌L46的筛选

初筛：采用对峙培养法。对内生菌拮抗病原真菌筛选。将打好直径为6mm的油茶软腐病菌菌饼放于平板中央，然后用接菌环蘸取待测细菌的悬浮液等距离(距平板中央3cm)点接2～3种内生细菌，放于培养箱中25℃黑暗培养，4d后观察记录抑菌带的有无及大小，共重复3次。选出抑菌带宽度大于等于4mm的10个菌株进行复筛，依次为L1、L6、L12、L19、L29、L33、L35、L39、L46、L48、进行复筛(见表1)。

表1内生细菌对油茶软腐病菌的抑菌作用

复筛：采用发酵法。将初步筛选出的10株菌分别在NA培养基上培养2d后，用接菌环移取一环置入装有150mlNB培养液的三角瓶中(250m1)，在28℃、150rpm的摇床上振荡培养48h。培养液用0.22μm细菌过滤器过滤得到培养滤液，将滤液与约50℃PDA培养基按1∶19混匀倒入培养皿，冷却后在平板中央放入d＝6mm的软腐菌菌饼，4d后测量病菌菌落直径，以无菌水为对照，L46菌株发酵液的抑菌效果最明显，抑制率达到83.4％(见表2)。

表2发酵液对油茶软腐病菌的抑制作用

实施例3解淀粉芽孢杆菌L46对油茶软腐病菌丝的抑制作用

将直径为6mm的油茶软腐病菌菌饼放于马铃薯蔗糖培养基PDA平板中央，然后等距离3cm点接拮抗细菌L46，三次重复，25～28℃培养，4天后测定抑菌带的直径。由图3可见解淀粉芽孢杆菌L46对油茶软腐病菌抑菌作用强。

实施例4解淀粉芽孢杆菌L46对油茶软腐病菌丝的抑制和致畸作用

将玻璃纸剪成5mm×25mm的长条状，121℃高压灭菌，用镊子将其铺放于菌株L46和病原菌之间。28℃恒温培养5～7天，菌株L46和病原菌菌丝之间出现明显的抑菌带后，将玻璃纸小心取下，置于10×40倍显微镜下观察菌丝的形态变化，以不接菌株L46的病原菌为对照。观察到菌丝前期膨大突出，后期明显变细，形态不均匀，菌丝有断裂、破碎的现象(见图4)，其中1：正常菌丝的病原菌菌丝(10×100)；2：前期菌丝膨大突出(10×100)。

实施例5解淀粉芽孢杆菌L46对油茶软腐病菌丝分生孢子萌发的抑制作用

采用载玻片悬滴法。将油茶软腐菌病菌在PDA平板上(22℃)培养箱中培养7d后，用移菌环挑取孢子堆转移到盛有灭菌水的试管中，振荡摇匀后配成孢子悬浮液(5×108个/m1)，备用。取100μl孢子悬浮液，同100μL L46菌株的发酵原液和被稀释10倍、100倍的发酵液及100μL发酵滤液分别混合(将斜面上生长的菌种L46用接种环接入50ml NA液体培养基中，30℃，140r/min，振荡培养24h即为发酵原液，稀释后即为发酵液，离心后所得上清液即为发酵滤液)，滴加到凹玻片上，以滴加无菌水为对照。每处理重复3次，置于28℃培养箱中培养，48h以后镜检孢子萌发情况，计算孢子萌发率。由表3结果可知，L46的发酵原液对软腐病菌分生孢子的萌发和芽管的生长都有着明显的抑制作用，其中对孢子萌发的抑制率达到93.7％，发酵液被稀释后抑制效果逐渐降低。L46发酵滤液对孢子萌发的抑制效果也十分明显，使孢子萌发率降低了87.7％，结果表明，菌株在发酵培养过程中可能产生了对软腐病菌有抑制作用的代谢产物。

表3内生菌株培养液对软腐病菌分生孢子萌发的影响