油茶软腐病内生拮抗细菌的分离筛选及菌剂的研制

摘要

油茶软腐病是油茶产区主要的危险性病害,在我国南方各省均有不同程度危害,油茶软腐病现已成为安徽省补充检疫对象。该病主要危害油茶叶片和果实,受害部位腐烂,并造成大量落叶和落果,甚至叶、果落光,造成重大的经济损失。在苗圃中,油茶枝叶受害相当严重,甚至整株枯死。
　　 目前,对油茶软腐病的防治主要以化学防治为主,尚无生物防治报道。本论文从油茶健康叶片中筛选软腐病菌内生拮抗细菌,并对其进行鉴定,最后制成干粉剂和可湿性粉剂两种剂型,并用于田间防治。主要内容结果汇报如下:
　　 (1)油茶软腐病内生拮抗细菌的筛选和鉴定。从湖南省攸县采集的油茶健康叶片中分离到内生细菌56株,通过平板对峙试验和液体发酵试验,从中筛选出一株对油茶软腐病病菌有拮抗作用的内生细菌,编号为LA6。结合其菌落形态,生理生化及16S rDNA序列分析,确定LA6是解淀粉芽孢杆菌。油茶软腐病拮抗菌株LA6保藏于中国典型培养物保藏中心,保藏号为CCTCC M2010324。该拮抗菌对油茶软腐病菌的菌丝有致畸作用,引起菌丝的破碎、断裂。
　　 (2)油茶软腐病内生拮抗细菌LA6·发酵条件的优化。采用单因素实验和正交优化实验,单因子试验表明:菌株LA6的最佳培养基为NB培养基,最佳碳源是乳糖,最佳氮源是蛋白胨和酵母膏；在温度30℃,初始pH7.0,摇瓶装液量为50mL,接种量7％,摇床转速140 r/min,发酵周期72h的条件下可获得最大抑菌活性。葡萄糖、蛋白胨、酵母浸膏、NaCl四因素的正交试验表明:菌株LA6获得最大抑菌活性的培养基配方为乳糖2.0％,蛋白胨0.8％,酵母膏1.1％,NaCl0.5％。在最优培养基和培养条件下,测定拮抗菌L46的生长曲线和抑菌时程曲线,结果表明,拮抗菌L46在培养36h后,生物量达到最大值,但此时抑菌活性并非最高,在培养72h后,拮抗菌L46才获得最高的抑菌活性。
　　 (3)油茶软腐病内生拮抗细菌LA6菌剂的研制。通过单因子试验,筛选到适合做拮抗菌L46可湿性粉剂的助剂,即载体为高岭土,STPP为分散剂,SDBS为润湿剂,硫酸锌为芽孢萌发促进剂,另选用抗坏血酸为紫外线保护剂。以润湿性和悬浮率为指标,对高岭土、硫酸锌、STPP、SDBS进行正交试验分析,最终确定拮抗内生菌L46可湿性粉剂的配方及比例,即高岭土35.72％,硫酸锌1.34％,STPP3.57％,SDBS8.93％,抗坏血酸0.44％,LA6原粉50％。对生防菌L46可湿性粉剂的各项指标进行检测,均已达到国内标准。通过对该粉剂的保存温度和保存时间研究,初步确定该粉剂可在常温下存放,保存时间至少为两个月至半年,但具体的有效期限还需进一步验证。在三个不同的实验基地对该生防菌剂进行了田间防效实验,结果显示该生防菌剂对油茶软腐病其田间防效效果显著,与化学试剂防效相当。

目录

文摘

英文文摘

1 绪论

1.1 植物病害生物防治

1.1.1 植物病害生物防治概念

1.1.2 植物病害生物防治的机理

1.1.3 微生物在植物病害生物防治中的应用

1.2 植物内生菌

1.2.1 植物内生菌的多样

1.2.2 植物内生菌在病害防治中的作用

1.2.3 内生菌利用中存在的问题

1.3 芽孢杆菌属在生物防治中的研究进展

1.3.1 国内研究进展

1.3.2 国外研究进展

1.4 油茶软腐病概况及防治现状与展望

1.4.1 油茶软腐病症状及发生规律

1.4.2 油茶软腐病病原菌的形态及传播

1.4.3 油茶软腐病的防治

1.5 本文研究的课题来源、目的意义和主要研究内容

1.5.1 课题来源

1.5.2 目的意义

1.5.3 研究内容

2 油茶软腐病拮抗内生菌的分离与鉴定

2.1 材料与方法

2.1.1 实验材料

2.1.2 实验方法

2.2 结果与分析

2.2.1 油茶软腐病内生拮抗菌的分离筛选

2.2.2 油茶软腐病内生拮抗菌拮抗机理的探索

2.3 小结

3 油茶软腐病内生拮抗细菌L46发酵条件的优化

3.1 材料与方法

3.1.1 材料

3.1.2 主要仪器设备

3.1.3 方法

3.2 结果与分析

3.2.1 发酵培养基优化

3.2.2 发酵条件优化

3.2.3 拮抗菌L46生长曲线、抑菌时程曲线

3.3 小结

4 油茶软腐病内生拮抗细菌L46菌剂的研制

4.1 材料与方法

4.1.1 试验材料

4.1.2 试验方法

4.2 结果与分析

4.2.1 载体对芽孢存活和生长的影响

4.2.2 不同载体对拮抗菌芽孢水浴活率(耐热力)的影响

4.2.3 芽孢萌发促进剂的筛选

4.2.4 表面活性剂的筛选

4.2.5 主要助剂的配比

4.2.6 生防菌L46可湿性粉剂的质量指标

4.2.7 生防菌L46可湿性粉剂的保藏温度和保藏时间的测定

4.2.8 生防菌L46可湿性粉剂的田间防效测定

4.3 小结

5 结论与讨论

5.1 油茶软腐病拮抗内生菌的分离鉴定及拮抗机理研究

5.2 油茶软腐病内生拮抗细菌发酵条件的优化

5.3 油茶软腐病内生拮抗细菌L46菌剂的研制

5.4 本文创新点

参考文献

致谢

攻读硕士学位期间主要学术成果