HIV-1感染的人辅因子的全基因组目视鉴定

摘要

本发明涉及在HIV感染的早期阶段中所牵涉的人宿主因子的鉴定。此外，本发明涉及所鉴定的基因用于阐明HIV感染的机制、作为药物靶标和用于鉴定在治疗HIV中有用的化合物的用途。

说明书

本发明涉及在HIV感染的早期阶段中所牵涉的人宿主因子的鉴定。此外，本发明涉及所鉴定的基因用于阐明HIV感染的机制、作为药物靶标和用于鉴定在治疗HIV中有用的化合物的用途。

发明背景

大多数慢性疾病和感染在细胞的整体水平上显现。通过活细胞成像来检查疾病进展允许达到高的分辨率程度，其中使得分子疾病机制和其对遗传变化的响应可视化。尽管该类型的方法在独个实验中是非常成功的，但对于系统性的全基因组分析来说在很大程度上仍是难以适用的。

在进化过程中，HIV学会了将其生活周期的大部分分包给人宿主因子。在最近十年中，已通过多种方法鉴定了几种此类宿主因子(关于综述，请参见¹)。没有几种在鉴定宿主因子中的方法是系统性的，并且迄今没有一种方法是彻底的。但是，宿主因子的可得并不只对于充分理解HIV生活周期是重要的。探寻病毒宿主因子的有效方法将进一步允许将HIV亚型的因子特异性相互地或与SIV(猿猴免疫缺陷病毒)进行比较，从而指出感染表现中的关键机制，和潜在的治疗靶标。

本发明的目标是，鉴定在HIV感染的早期阶段中所牵涉的人宿主因子，其用于阐明HIV感染的机制、作为药物靶标和用于鉴定在治疗HIV中有用的化合物。

发明描述

本发明的目标通过下述技术方案而得到实现：具有由SEQ ID No.46所表示的序列的核酸，或其部分序列，或与所述核酸或所述部分序列互补的序列，其中所述部分序列包含至少20个连续核苷酸，它们用于

a)阐明HIV感染的机制；

b)作为药物靶标；或者

c)鉴定在治疗HIV中有用的化合物。

本发明的目标还通过下述技术方案而得到实现：具有由SEQ ID No.1或SEQ ID No.2所表示的序列的核酸，或其部分序列，或与所述核酸或所述部分序列互补的序列，其中所述部分序列包含至少20个连续核苷酸，它们用于

a)阐明HIV感染的机制；

b)作为药物靶标；或者

c)鉴定在治疗HIV中有用的化合物。

本发明的目标还通过下述技术方案而得到实现：具有由SEQ ID No.5所表示的序列的核酸，或其部分序列，或与所述核酸或所述部分序列互补的序列，其中所述部分序列包含至少20个连续核苷酸，它们用于

a)阐明HIV感染的机制；

b)作为药物靶标；或者

c)鉴定在治疗HIV中有用的化合物。

本发明的目标还通过下述技术方案而得到实现：具有由SEQ ID No.3-4和6-45中任一个所表示的序列的核酸，或其部分序列，或与所述核酸或所述部分序列互补的序列，其中所述部分序列包含至少20个连续核苷酸，它们用于

a)阐明HIV感染的机制；

b)作为药物靶标；或者

c)鉴定在治疗HIV中有用的化合物。

如在本文中所使用的，术语“核酸”意指脱氧核糖核酸(DNA)和核糖核酸(RNA)。

如在本文中所使用的，术语“与所述核酸或所述部分序列互补的序列”还指相应的(互补的)RNA序列或部分序列。

所述部分序列的20个连续核苷酸的最小长度确保了它们的特异性。在一个优选的实施方案中，所述部分序列包含至少21个连续核苷酸，和在一个更加优选的实施方案中，所述部分序列包含至少22个连续核苷酸。

如在本文中所使用的，术语“药物”意指适合用于治疗HIV的药物学试剂。

抑制(a)与靶蛋白的结合、(b)靶蛋白的活性或者(c)靶蛋白的表达的化合物的最初鉴定可以通过实验来达到，或者可以基于关于靶标的可用信息。抑制(a)和(b)的化合物在蛋白质水平上起作用。抑制(c)的化合物针对编码蛋白质或具有调控功能的核酸(例如DNA，RNA，mRNA)。可以使用诸如竞争性和非竞争性结合测定法的技术来测定化合物结合蛋白质的能力。此类测定法可以例如使用经标记的化合物(直接测量)或与各自化合物相结合的可检测试剂(间接测量)来进行。经鉴定的靶蛋白的编码性核酸序列(例如由SEQ ID No.1至46，优选地SEQ ID No.46、1-2或5所表示的基因/核酸)为能够与所述核酸杂交的化合物提供了靶标。此类化合物的例子包括siRNAs、核酶和反义核酸。

优选地，将具有由SEQ ID No.1至46，优选地SEQ ID No.46、1-2或5中任一个所表示的序列的核酸，或其部分序列，或与所述核酸或所述部分序列互补的序列(其中所述部分序列包含至少20个连续核苷酸)，用作药物靶标或者用于根据WO 2008/034622²⁸中所概述的方法来鉴定在治疗HIV中有用的化合物。

优选地，鉴定关于靶蛋白候选物(由SEQ ID No.1至46，优选地SEQ ID No.46、1-2或5中任一个所编码的蛋白质)的小分子调节剂(其也代表了在治疗HIV中有用的化合物)的方法包括下列步骤：

-提供这样类型的第一细胞，所述类型在当将所述第一细胞暴露于小分子调节剂时能够产生信号，其中所述信号为这样的信号，其可以在空间上进行分辨，和任选地可以进行定量，优选地通过显微术，

-将所述第一细胞暴露于小分子调节剂，并对由所述第一细胞作为对于所述小分子调节剂作出的应答而产生的第一信号在空间上进行分辨，和任选地进行定量，

-提供与所述第一细胞相同类型的第二细胞，

-进行下列步骤：

-将编码标志蛋白的第一核酸引入到载体中，

-将编码所述靶蛋白候选物(其表达待检测和/或定量)的第二核酸引入到所述载体中，以便所述第一核酸和第二核酸有效地连接，从而所述标志蛋白的表达成为所述靶蛋白候选物的表达的指示，

-将所述载体引入到所述第二细胞中，

-检测和/或定量所述标志蛋白的表达，

-将所述标志蛋白的所述表达与所述靶蛋白候选物的表达相关联，并由此检测和/或定量所述靶蛋白候选物的表达，

-在所述第二细胞上进行上述步骤期间，在将所述载体引入到所述第二细胞中后，将所述第二细胞暴露于所述小分子调节剂，并对由所述第二细胞作为对于所述小分子调节剂作出的应答而产生的第二信号在空间上进行分辨，和任选地进行定量，

-将所述第一信号与所述第二信号进行比较，并且，如果在所述第一信号和所述第二信号之间存在差异的话，将所述差异归因于所述靶蛋白候选物在所述第二细胞中的表达，从而将所述靶蛋白候选物鉴定为所述小分子调节剂的靶蛋白。

优选地，所述第一细胞和与所述第一细胞相同类型的所述第二细胞为LTR-GFP HeLa细胞(LTR＝长末端重复序列)。

优选地，将具有由SEQ ID No.1至46，优选地SEQ ID No.46、1-2或5中任一个所表示的序列的核酸，或其部分序列，或与所述核酸或所述部分序列互补的序列(其中所述部分序列包含至少20个连续核苷酸)用于通过利用网络或系统生物学领域中的标准方法来阐明HIV感染的机制，所述标准方法包括但不限于蛋白质组相互作用图谱、pull-down实验(即，AP/MS)、微阵列分析和计算机建模²⁹。

SEQ ID No.1至46列于表2中。

通过全基因组RNA干扰、高密度细胞微阵列、共聚焦成像和图像分析的组合，发明人已鉴定了在HIV感染的早期阶段中所牵涉的迄今未知的人宿主因子。通过在7个目视全基因组分析上使用HIV受体分子CD4作为分类器(classifier)，已显示出，HIV-1雇用了0.21％的人基因组，或44个宿主基因，来完成其早期生活周期。通过将目视图像的高信息内容与基于阵列的全基因组筛选的快速重现性相组合，本方法允许以高可靠性来鉴定HIV-1宿主因子。

为了直接鉴定在细胞水平上在HIV/疾病发病机理中所牵涉的基因，发明人开发出了全基因组目视RNA干扰方法。它被设计为活细胞内的途径和病原体活性的自动化分析，其中使用定量成像工具²。已经以一个孔/基因水平，在微量滴定板中，以低分辨率筛选了在病毒载体中的短干扰RNAs(siRNAs)和短发夹RNAs的全基因组文库³。已证明，将此扩展至高分辨率成像是非常具有挑战性的。细胞微阵列是用于使细胞事件成像的备选的、通用的解决方案^4，5。叠盖在siRNA、病毒颗粒或化合物(其反向转染细胞)的印刷斑点阵列上的细胞单层^4-10为费力的机器化筛选提供了备选方案^{4，7，8，10-12}。发明人已利用了这些优点来通过使用细胞微阵列来筛选HIV感染。

附图

现在，提及附图，其中：

图1显示了，通过使用细胞微阵列，从基因组到单个细胞，在LTR-GFPHeLa细胞中HIV感染的自动化全基因组筛选：用细胞叠盖七个细胞微阵列48小时，固定，并进行核染色，然后进行三色自动化点扫描共聚焦成像。图版A显示了在具有78％(21,127个斑点)的基因组特异性siRNAs和22％(6089个斑点)的对照的七个载玻片(总共27,216个斑点)上进行的单个全基因组筛选的图像。图版B显示了来自该筛选的单个阵列(3,888个斑点)。图版C显示了来自该单个阵列的18个斑点，其中框出了来自该阵列的三个斑点，其中中间的斑点包含CD4 siRNA、上面的斑点包含TRIM50B siRNA和下面的斑点包含FLJ43374 siRNA。图版D显示了斑点图像，图版E显示了核染色，图版F显示了HIV感染诱导的GFP表达，和图版G显示了来自该阵列的单个斑点，其中突出显现了在该斑点中心处的由CD4 siRNA转染的细胞和与该斑点接界的经感染的对照细胞。核用2.5μM Draq5染色(蓝色)。比例尺：上面的和中间的图版为10mm，下面的图版为100μm。

图2概括了大的高分辨率细胞微阵列的图像分析：A描绘了真实的阵列获取示意图，其显示了倾斜的整个阵列，缺失的斑点，和相对于图像边界(黑色线)而言斑点对siRNA斑点位置(灰色小点)的变化。B描绘了相比于具有多个跨越图像边界的斑点/图像的真实情况而言，具有一个斑点/图像的假定情况(上面的图版)。C显示了用于与阵列微缩图(miniature)进行适配的siRNA注释节点(总共3,888个节点)的柔性的阵列网格模型。D至F：该柔韧的网格功能强制使节点与其紧邻邻居产生关系，其中，D)两个毗邻节点之间的90°角，E)预先确定的斑点间距(d)，和F)在计算的曲率图(computed curvature map)上的最小值是受到偏爱的。G显示了用该模型来注释阵列微缩图。H描绘了通过使用来自在微缩图上的适配的坐标，从毗邻的高分辨率图像产生的高分辨率复合斑点图像。I显示了经适配的大阵列，其显示了缺失的斑点的检测和在红色siRNA斑点图像上的网格叠盖层(插图)。

图3A显示了CD4 siRNA斑点图像，其中具有在白色正方形中的所自动检测的斑点区域。B显示了CD4 siRNA斑点图像分析，其检测在该斑点区域之内和之外的细胞中心以测得它们的数目、核强度、GFP强度、关于细胞间连接的最小强度(连接值是关于该连接的最小强度)、细胞强度之间的距离及其各自的标准偏差以及总GFP(总共15个描述符)。C显示了杂乱的(scrambled)siRNA斑点图像，其中具有在白色正方形中的所检测的斑点区域。D描述了杂乱的siRNA斑点图像分析。E显示了现在被减少至15-维向量的实验(＝斑点)。一个阵列包含3,888个斑点(108×36网格)。因此，可以将每个结果维度表现为具有代表一个实验的一个像素的2-D灰度级图片。每个像素的值相应于所测量的维度。第一列：在单个阵列的3,888个斑点上测量的15个描述符。从上至下：cellNumber、linkMinGFPAvg、linkMinGFPSdtdev、linkLengthAvg、linkLengthSdtdev、inTotalGFP、inIntNucleiAvg、inIntNucleiSdtdev、inIntGFPAvg、inIntGFPSdtdev、outTotalGFP、outIntNucleiAvg、outIntNucleiSdtdev、outIntGFPAvg、outIntGFPSdtdev。第二列：经标准化的相同的测量值。那些经标准化的相对值对于空间排列变形(spatial array distortions)来说强有力得多而同时保持本地命中(local hits)。

图4A显示了投影在二维空间上的15-维测量CD4和SCRAMBLED云状物，其是在分布之间最具辨别力的。可以清楚地看出，可以区分为两个类别。B显示了在该相同视图上190,510个实验(7×7阵列)的投影，和C显示了基于15-变量结果的分类。A、B、C：水平的：标准轴(canonical axis)1；垂直的：标准轴2；颜色：类别；强度值：距各自类别中心的15-维的马哈拉诺比斯距离(Mahalanobis distance)(参见第9页)。D描绘了直方图，其显示了在标准平面上值的出现(Z轴：最高出现值为252)。落入CD4类别中的实验被标记为绿色，并且代表所有实验的一小部分(0.8％)。E为显示命中的图，所述命中选自CD4类别中的这样的实验，其是具有相比于所有实验的大部分而言低于1的密度比率的那些实验。因此，在CD4类别之内比CD4类别之外存在有按比例地更多的相同基因的实验。注意，该比率很快落到0.1以下，这显示44个命中中的大多数的密度在CD4类别之内为在CD4类别之外的至少10倍。F显示了siRNA实验的代表性例子。

图5概括了来自LTR-GFP HeLa细胞的结果，所述LTR-GFP HeLa细胞用所示siRNA转染24小时，然后用HIV-IIIB进行感染。在48小时后，将经固定的细胞用P24抗体进行染色。A显示了以RNASEH2A、JMY、MED28和CD4(阳性对照)的丧失而阻断了HIV感染。将GFP(绿色)和P24(红色)用作HIV感染的指示剂。核(蓝色)用DraQ5染色。“合并(merge)”指明了核(蓝色)、GFP(绿色)和HIV P24(红色)的组合图像。比例尺为20μm。B图解说明了基于GFP强度/像素/细胞的GFP表达的定量。C图解说明了基于P24强度/像素/细胞的P24表达的定量。D显示了通过各自的siRNA减少了RNASEH2A、MED28和JMY mRNA。细胞用所示siRNA转染72小时，然后制备cDNA并通过RT-PCR来测量RNASEH2A、MED28和JMY mRNA表达水平。

在图6A中，Jurkat细胞用所示siRNA转染72小时，然后用HIV-1毒株IIIB(MOI：0.1)进行感染。在96小时后，通过p24 ELISA在细胞培养物上清液中测量P24抗原。在B中，Jurkat细胞用所示siRNA转染72小时，然后用HIV-1毒株IIIB(MOI：0.05)进行感染。在96小时后，通过p24 ELISA在细胞培养物上清液中测量P24抗原。C显示了通过各自的Acell siRNA减少了RNASE H2A mRNA。Jurkat细胞用所示siRNA转染96小时，然后制备cDNA并通过RT-PCR来测量RNASE H2AmRNA表达水平。D显示了通过RT-PCR测量的RNASE H2A敲减(knockdown)的定量。

实施例

制备细胞微阵列以便以最小的阵列数目覆盖人基因组，从而使得能够进行共聚焦成像，并去除任何对于关于siRNA斑点位置和成像的机械精确性的依赖⁷。使用高通量接触式印刷机来大量制备印刷在24×60mm光学玻璃薄片上的阵列。各自标有条形码的阵列以108列×36行和以500μm的间距，包括以300μm直径斑点形式的3,888个siRNAs。将siRNAs包囊在包含转染试剂和明胶^{7-9，12，13}以及红色荧光siRNA的混合物中。红色荧光siRNA给出光学上可鉴别的、独个地可寻址的斑点，并且整个阵列可以在细胞叠盖后进行可视化(图1)。在干燥后1至21天，测量反向转染。通过使用干燥了＞5天的阵列，在表达GFP的HeLa细胞系的转染后48小时，接近60％的细胞被转染并且GFP敲减为＞70％。通过采用p65或核输出蛋白1(XPO1/CRM_1)的间接免疫标记以及固定的阵列的共聚焦成像，在转染后48小时，内源蛋白质表达沉默为＞60％。斑点与斑点之间的污染是最小的，不论与GFP siRNA斑点的距离为多少，在所有邻近斑点中沉默是低的(＜5％)。

HIV感染测定法包括HeLa LTR-GFP细胞的28小时反向转染，随后为以0.14的HIV-1 MOI进行的48小时的感染。HIV感染使得能够实现稳定整合的GFP的由TAT驱动的表达，并因此重演了病毒感染中的早期步骤¹⁴。在这些条件下，在用CD4 siRNA转染的细胞中，HIV感染显著地被抑制(图1)。

将处于包囊混合物中的84,508个siRNAs(其相应于四个独特的siRNA双链体，它们靶向21,127个独特的人基因中的每一个)与对照siRNAs的集合进行印刷。每个阵列包含3,888个斑点(其中包括648个对照)，并且在7个载玻片中掩盖整个人基因组(图1A)。使用倒置自动化点扫描共聚焦显微镜来使阵列成像。以1,820个边长为800μm的三色16比特图像获取了整个阵列，对于覆盖基因组的1/7的阵列来说，这相当于～10千兆字节的图像信息(70千兆字节/基因组)。总共获取了7个基因组(7×7阵列＝49个阵列)，其中包括了几乎二十万个独个的实验和0.5兆兆字节的成像数据。

图1中显示了关于HIV感染的单个目视全基因组分析。它从包含人基因组siRNA文库的7个阵列(图1A)跨越至单个阵列(图1B)，以及系统地从那个阵列跨越至单个斑点，在该单个斑点中HIV感染在CD4沉默后被抑制(图1C至G)。图像分辨率适合于高内涵形态学和表型分析¹⁵，然而，阵列图像数据集的大小和拓扑结构需要新的图像分析解决方案。

第一个图像分析目的为鉴别和注释阵列上的斑点。在此，在印刷阵列、siRNA注释和图像顺序之间没有关系(图2A)。此外，图像的数量是相当大的(对于一个三色阵列，5,460)。单个阵列图像包含直至四个斑点——常常与邻近图像共享——以20×分辨率(图2B)，而没有关于斑点身份的内在信息。阵列印刷中固有的机械和定位的不精确产生了整体地在XY上倾斜和移位的阵列，并且在相关的行/列间距、斑点定位和对准排列中存在有斑点与斑点之间的变化(图2A)。重要的是，未经压缩的阵列图像如此之大，以致如果将其集合成一个连续图像，则由于处理能力的限制而不能观看或操作该图像。专用软件自动地采集各个图像并创建压缩的镶嵌微缩图(mosaic miniature)，其在存储于服务器上的高分辨率图像中保留了空间信息。与原始图像相比，该图像被压缩了2,500倍(4Mb对10Gb)。使该阵列适配的过程使用了该图像微缩图，以便用它们的s i RNA身份来注释斑点。这通过使3,888个x-y变量(3,888个斑点位置)的函数最小化来达到。这采用两个约束：第一个是柔性的经注释的网格模型(flexible annotated grid model)(模型约束)，其在当该柔性网格相对于原始网格模型而言严重变形时具有高的值。这通过控制毗邻节点之间的角度(图2D)和已知的斑点间距离(图2E)来达到，并且所述值随着这些变形而逐渐增加。第二个约束是微缩图的变换(图像约束)，其中当接近斑点中心时该值降低。这通过计算该微缩图的曲率图来达到(图2F)。该算法定义一个粗略的近似值，然后使上述函数最小化以产生与该微缩图的斑点相适配的网格模型的节点(图2G)。然后，使用通过所述适配而确定的斑点位置的倒转变换(back transform)，用siRNA身份注释每个斑点，并且从来自数据库的原始16比特图像来实时重建之(图2H)。然后，将斑点的这些高分辨率图像用于图像分析(图2I)。

将七个完全的人基因组(总共49个siRNA阵列)培养28小时以允许进行宿主基因沉默。用感染复数为0.14的活HIV-1感染阵列3小时，洗涤，并在成像前温育45小时。一旦对网格进行了适配并获得了每个斑点的身份，就使用下述图像和数据分析策略在每个斑点上独立地分析HIV感染。仅测量GFP荧光不会产生关于细胞形状、密度和细胞：细胞融合的信息。更重要的是，不能容易地将在合胞体形成期间GFP信号的稀释与GFP产生受到抑制相区分。为了解决这一点，发明人开发了测定15个描述符的算法。

为了能够定量HIV感染，发明人测量了在siRNA斑点内和在围绕该斑点的边界上的细胞。这通过使用这样的算法来达到，所述算法随机测量在比斑点大的图像中的像素以确定最佳的可能斑点位置(图3A，白色正方形)，这在具有预测的斑点尺寸的情况下进行。通过二维高斯形状的模板匹配(template matching)来检测核中心，所述二维高斯形状粗略地建立了关于图像中的经染色的发荧光的核的模型。在位于那些核中心上的小圆盘之上测量GFP和核染色。该测量相对于背景或细胞形状变化来说是强有力的。为了测量合胞体形成和细胞分散，从所有核中心的集来计算德洛内三角剖分(Delaunay triangulation)¹⁶以建立独特的邻域图(neighborhood map)。测定关于每个独特的核：核连接的最小GFP值，并且德洛内三角剖分给出沃罗诺伊图形(Voronoi diagram)¹⁷，其被用于分开密集地挤在一起的核。所述算法在150ms内为每个实验/斑点产生15-维的向量(cellNumber、linkMinGFPAvg、linkMinGFPSdtdev、linkLengthAvg、linkLengthSdtdev、inTotalGFP、inIntNucleiAvg、inIntNucleiSdtdev、inIntGFPAvg、inIntGFPSdtdev、outTotalGFP、outIntNucleiAvg、outIntNucleiSdtdev、outIntGFPAvg、outIntGFPSdtdev)。图3B显示了将所述算法应用于CD4斑点和SCRAMBLED斑点的目视结果。

鉴于细胞培养中的变化，在全部阵列范围内将感染的测量值进行标准化。由于在整个其表面上的不完美的细胞密度，因而所述阵列是具有低频率空间变化的大实验。在图4A中显示了阵列图像，其代表了关于整个单个阵列的结果向量的每个维度。使用具有3个斑点的半径大小(其被定义为使对照类别之间的分开最大化的半径，见下面)的中部滤波器(median filter)来过滤结果阵列。该标准化产生了与在全部7个基因组范围内的所有测量值相当的相对值。

发明人的意图是鉴定出在抑制早期阶段HIV感染中与对照CD4一样有效的基因。因此，他们从215个独个CD4实验和3896个SCRAMBLED实验的两个对照分布建立了两类别分类器(two class classifier)。由于它们都是15-变量高斯分布，因而他们设定了简单而强有力的分类器并且计算出了最具区别性的投影，如图4B-E中所显示的。对于所有190,510个数据点，发明人计算了相对于CD4和SCRAMBLED类别的15-维的马哈拉诺比斯距离。马哈拉诺比斯距离是1936年由P.C.Mahalanobis所介绍的一种距离量度。它基于变量之间的相关性，通过其可以鉴别和分析不同的图式(patterns)。它与欧几里得距离(Euclidean distance)的不同在于，它考虑数据集的相关性。发明人仅将更接近于CD4而非SCRAMBLED并同时具有小于由卡方(chi-squared)(具有15个自由度)确定的给定g的平方根的距CD4类别中心的距离的点选择为相应于被选定为至少0.99的门控概率(gating probability)(即点必须以0.99的概率在CD4类别中，不包括畸形的和不相关的、然而更接近于CD4而非SCRAMBLED的实验)。这将1680个实验(0.8％)鉴定为可能与CD4相似。发明人计算了在这两个类别中的基于实验密度的得分比。对于每一个基因，计算CD4类别之内的实验对CD4类别之外的实验的百得分之间的比率。所有得分低于1的基因被认为具有异常高的在CD4类别中的显现，并且得分越低，那个显现越强。例如，CD4具有0.043的值，这意味着，它在CD4类别之中的密度为在CD4类别之外的23倍(1/0.043)。鉴定了44个具有低于0.1的比率(这表明其在CD4类别中过显现)的基因(表1，图4)。低于0.1的得分意味着在CD4类别之内的密度为在CD4类别之外的至少十倍(图4)。

就它们在HIV感染中的牵涉而言，在这44个基因中，36个被鉴定为是新的(参见表2)。其余的八个基因先前已显示直接或间接地参与HIV感染。最近，由Brass等人¹⁸进行的功能基因组筛选将MED28、CSPP1和ERP27揭示为编码HIV感染所需的蛋白质的几个宿主基因中的三个。在此之前，已将MED28(magicin)鉴定为FYN(其为已知的HIV相互作用伙伴)的相互作用伙伴¹⁹。Ku70由于其与逆转录病毒复制中间体和预整合复合物的相互作用而为众所周知的逆转录病毒感染早期步骤的介体²⁰。PKN1(也称为Pak1)已显示与HIV辅助因子Nef相互作用，并且PKN1的耗竭强烈地抑制多细胞体系中的HIV感染²¹。FDA-批准的靶向PTGIS的药物苯基丁氮酮(phenylbutazone)已作为潜在的用于人和动物的抗病毒(包括HIV)剂而被授予了专利权²²。CCL2/MCP-1编码在HIV感染过程中由HIV基质蛋白p17诱导的促炎趋化因子^23，24。此外，先前报道过，UNG2被包装进HIV病毒颗粒中，并且与病毒的逆转录酶在物理上相结合²⁵。超过20％的鉴定出的基因是已知的HIV感染的效应子这一事实验证了本文中所呈现的总体结果。令人感兴趣的是，RNASEH2A中的突变已显示导致艾-古综合征(Aicardi-Goutières syndrome，AGS)这一神经病学病症²⁶。

为了证实这些筛选结果的重要意义，必要的是证明，最终，LTR-GFPHeLa细胞中候选基因的耗竭以与通过CD4敲减所看到的相似的方式阻断HIV复制。为了测试这一点，我们选择了RNASEH2A、MED28和JMY，并且使用CD4作为对照。将细胞用各自的siRNA转染24小时，并用HIV感染48小时。通过监测表达GFP和P24的细胞的出现来测量病毒复制¹⁴。细胞中RNASEH2A、MED28和JMY敲减阻断了HIV感染(图5A)。使用GFP强度和P24表达来进行这些图像的定量(图5B，5C)。RNASEH2A敲减导致相比于用杂乱的siRNA转染的群体而言HIV感染几乎降低了80％(图5B，5C)。MED28和JMY敲减也导致HIV感染降低了大约50％(图5B，5C)。通过以RT-PCR测量它们的表达，我们还证实了，所靶向的mRNA被下调(图5D)。因此，RNAseH2A、MED28和JMY对于HIV感染过程来说是必需的。

为了进一步证实这些筛选结果的重要意义，在对于HIV感染而言更具代表性的细胞类型中将RNASEH2A用作用于敲减的代表基因。为了进行有效的基因沉默，将各自的RNASEH2A #1和#2 siRNA转染到Jurkat细胞(T淋巴细胞)中。通过以定性(图6C)和定量(图6D)方式的RT-PCR，证实了通过其表达而下调了所靶向的mRNA。大约50％的RNASEH2A被沉默。以两个不同的MOI用HIV感染经RNASEH2A siRNA转染的细胞，并且通过P24 ELISA来测量病毒复制(图6A，B)。总之，RNASEH2A的敲减取消了Jurkat细胞中WT HIV1病毒的复制。这些观察结果确认了先前的发现，即RNASEH2A对于HIV感染过程来说是必需的。

材料和方法

化学药品

所有精细化学药品均购自Sigma-Aldrich。DRAQ5来自BioStatus(Shepshed，UK)。所有siRNA双链体均购自Dharmacon(USA)。siRNA文库包括1.0nM的Dharmacon siARRAY全人基因组siRNA文库(Thermofisher，West Lafayette，CO)，该siRNA文库包含84,508个siRNAs，其相应于四个独特的siRNA双链体，它们靶向21,127个独特的人基因中的每一个。一抗来自Santa Cruz Biotechnology，并且所有发荧光的二抗来自Molecular Probes/Invitrogen(Carlsbad，CA)。转染试剂来自商业来源。

细胞系和细胞培养

如所描述的¹⁴那样来制备LTR-GFP HeLa细胞(A.Boese，Institut Pasteur Korea)。在补充有110mg/mL丙酮酸钠、10％胎牛血清(Gibco，USA)和1％青霉素-链霉素(Invitrogen；Carlsbad，USA)的高葡萄糖glutamax Dulbecco改良的Eagle培养基(Invitrogen；Carlsbad，USA)中培养野生型HeLa(ATCC)和表达GFP-扭转蛋白(torsin)的HeLa(R.Grailhe，Institut Pasteur Korea)。将稳定的细胞系在补充有选择标记的培养基中进行维持。将细胞系在阵列上培养12至72小时，以便对反向转染进行定量。关于HIV感染，每阵列(24×60mm)接种650,000个细胞，并且在补充有5％胎牛血清(Gibco，USA)和1％青霉素-链霉素(Invitrogen；Carlsbad，USA))的Opti-MEM(Invitrogen；Carlsbad，USA)中培养28小时。以0.14的MOI用HIV-1毒株IIIB(Daymoon industries；Cerritos，USA)对细胞接种过夜。次日，添加补充有5％胎牛血清(Gibco，USA)和1％青霉素-链霉素(Invitrogen；Carlsbad，USA)的新鲜Opti-MEM(Invitrogen；Carlsbad，USA)。将细胞再培养45小时，随后在处于Dulbecco磷酸盐缓冲盐水中的1％(w/v)低聚甲醛之中进行固定，并且在成像之前用2.5μM Draq5(BioStatus，UK)对核进行染色。将Jurkat克隆E6-1(ATTCC)在补充有10％胎牛血清(Gibco，USA)、1％青霉素-链霉素(Invitrogen；Carlsbad，USA)、1mM丙酮酸钠(Gibco，USA)、10mM HEPES的RPMI培养基1640(Invitrogen；Carlsbad，USA)中进行培养。

微阵列印刷

基本上如所描述的²⁷那样来制备siRNA转染溶液，并且在封闭在定制的洁净室(其提供无菌的经HEPA过滤的气氛)中的情况下，在22-25℃和55-65％RH下，使用stealth针(telechem，USA)和高通量微阵列印刷机(Genomic Solutions，USA)，在1号盖玻片上将其印刷为3,888斑点阵列(108×36个斑点)。将阵列贮存在干燥器中，在印刷后1周至8个月没有显著的性能改变。7个载玻片覆盖了基因组，并且包含16％的对照siRNA斑点。

微阵列获取和分析

用点扫描共聚焦阅读器(Imageexpress Ultra，Molecular Devices，USA)，将阵列获取为直接写至外部数据库的16比特TIFF文件。从所述数据库中直接读取图像，以便使用为此目的而设计的软件来进行分析。应用适合的网格适配以鉴定整个阵列中的siRNA斑点，使这些斑点大小合适，并修剪它们，然后提取图像以进行分析、注释和结果输出。

RNA分离和RT-PCR

用Trizol法(Invitrogen，USA)从经siRNA转染的LTR-GFP HeLa和/或Jurkat细胞中分离出总RNA。在37℃下，在60分钟期间，在50pmololigo(dT)引物和20μM dNTP混合物存在下，在25μl反应混合物中使用1μg总RNA和MMLV-逆转录酶(Promega)来制备cDNA。关于PCR扩增，在25μL反应混合物中，将特异的寡核苷酸引物对(各0.2pmol)与200ng cDNA、1个单位的LA Tag聚合酶(Takara)、1×LA PCR缓冲液2(2.5mM MgCl₂)和100μM dNTP一起进行温育。所使用的引物的序列如下：

RNASEH2A有义引物5’-GACCCTATTGGAGAGCGAGC-3’和RNASEH2A反义引物5’-GTCTCTGGCATCCCTACGGT-3’；

JMY有义引物5’-GCAACTCTGGTTAGGAGCCC-3’和JMY反义引物5’-TATCTCCTCGGAGACCGTCC-3’；

MED28有义引物5’-GGACTATGTCAATGGCACCG-3’和MED28反义引物5’-TTGTGCTGCACGTTGATGTC-3’；

CD4有义引物5’-GGATAGTGGCACCTGGACAT-3’和CD4反义引物5’-CTTGCCCATCTGGAGCTTAG-3’；和

GAPDH有义引物5’-TGATGACATCAAGAAGGTGGTGAAG-3’和GAPDH反义引物5’-TCCTTGGAGGCCATGTGGGCCAT-3’。

PCR条件为95℃30秒，54℃30秒，和72℃3分钟，总共40个循环。将PCR产物施加到1％琼脂糖凝胶上，并用溴化乙锭来可视化。

正向siRNA转染和病毒感染

在24-孔平板中，用1μM针对所选择的独个RNASEH2A#1、#2的Acell siRNA(Dharmacon，USA)或者杂乱的siRNA转染Jurkat细胞(40,000个细胞/孔)，然后温育72小时。以0.5、0.01的MOI用HIV-1毒株IIIB(Daymoon industries；Cerritos，USA)感染细胞，并接种3小时。在移除病毒上清液后，将细胞在补充有10％胎牛血清(Gibco，USA)、1％青霉素-链霉素(Invitrogen；Carlsbad，USA)、1mM丙酮酸钠(Gibco，USA)和10mM HEPES的RPMI培养基1640(Invitrogen；Carlsbad，USA)中培养96小时。通过用P24ELISA(Perkin-Elmer)检测无细胞上清液中的p24 HIV-1病毒核心抗原来确定病毒复制。

在96-孔平板中，用50nM所选择的siRNA(Dharmacon，USA)转染LTR-GFP HeLa细胞(5,000个细胞/孔)，随后温育24小时。用HIV-1毒株IIIB(Daymoon industries；Cerritos，USA)感染细胞，并接种3小时。在移除病毒上清液后，将细胞在生长培养基中进行培养。将细胞在处于Dulbecco磷酸盐缓冲盐水中的4％(w/v)低聚甲醛之中进行固定，用抗-P24抗体(Abcam，USA)进行染色，并用2.5μM Draq5(Biostatus，UK)进行染色，然后进行成像。

P24免疫荧光检测

将细胞用磷酸盐缓冲盐水(PBS)洗涤两次，用在PBS中的4％(w/v)低聚甲醛固定10分钟，然后用PBS进行洗涤。关于透化，将细胞在处于PBS中的0.1％Triton-X 100之中温育10分钟，随后在PBS中进行洗涤。然后，在4℃下，与在处于PBS中的10％山羊血清之中的小鼠抗-P24抗体的1∶200稀释物一起温育2小时。在轨道式旋转器上，将平板用PBS洗涤3次，10分钟。在室温下，将Alexa 532山羊抗小鼠二抗(1∶1000)与所述细胞一起温育1小时，然后在轨道式摇动器上用PBS洗涤细胞3次(10分钟)，然后在室温下添加在PBS中的5μM DraQ510分钟。

参考文献

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