基孔肯雅病毒荧光定量PCR检测新方法及基孔肯雅病毒检测PCR体系

摘要

本发明公开了一种基孔肯雅病毒荧光定量PCR检测新方法及基孔肯雅病毒检测PCR体系，由引物和探针、Premix Ex Taq反应液、灭菌Tris水组成，该引物和探针检测特异性好，灵敏度高，非常适用于基孔肯雅病毒，与登革热病毒等无交叉反应。

说明书

技术领域

本发明属于生物检测领域，具体涉及基孔肯雅病毒的快速定性和定量检测方法及基孔肯雅病毒检测PCR体系，提供一对特异性引物和探针。

背景技术

基孔肯雅热是由基孔肯雅病毒(Chikungunya virus)引起的一种急性自然疫源性传染病，属披膜病毒，蚊虫为传染媒介。该病传播途径主要是受感染的动物(非洲绿猴、狒狒、黑猩猩、牛、马、猪、兔等)和病人通过埃及伊蚊、非洲曼蚊、非洲伊蚊、棕翅曼蚊等吸血传播，也可经呼吸道传播。基孔肯雅热多次发生于非洲以及亚洲的印尼、菲律宾、泰国、越南、缅甸和印度等地。由于国内外人口的流动，基孔肯雅热也逐步传入中国，1987年云南西双版纳曾发现基孔肯雅病例，并从其血液中分离出该病毒。目前用于基孔肯雅病毒的检测方法已经有ELISA、免疫层析、免疫荧光抗体测定(IFA)、病毒分离、RT-PCR和Real-time PCR等核酸扩增法，荧光定量PCR核酸检测的方法不失为公认的一种更直观、更快速的一种适合早期诊断的检测标准。

发明内容

本发明的目的在于提供一种基孔肯雅病毒荧光定量PCR检测新方法及基孔肯雅病毒检测PCR体系，该方法能够快速定性和定量检测基孔肯雅病毒，包括一对特异性更高、灵敏度高、重复性好的引物和探针。

为实现上述目的，本发明基孔肯雅病毒荧光定量PCR检测新方法，该方法中设计采用的引物探针为：

  Name   Sequence   Position   Tm℃   Modification   FP   GAACACGTAACAGTGATCCCG  9999-10019   57.8    RP   GTAATCAAGCGATAGCGTTGG  10114-10134   58.0    Probe   TGGGAGTACCGTATAAGACTCTAGTCAACAGA  10028-10059   67.0   CY5/lowa Black

进一步，所述的基孔肯雅病毒荧光定量PCR检测新方法，具体为：

1)设计引物探针；

2)根据仪器选择荧光素；

3)合成引物和探针；

4)制备阳性质粒标准品；

5)运行PCR；

6)数据分析；

7)提取病毒RNA进行体系验证。

进一步，所述步骤2)中荧光素的供选择的荧光发射基团有6-FAM、TET、HEX、JOE、CY3、CY5、TAMRA、Texas Red，荧光淬灭基团有BHQ-1、BHQ-2、Lowa Black^TM RQ、Lowa Black^TM FQ、Dabcyl。

进一步，所述步骤4)中采取基因合成方式制作阳性质粒CBG230-29作为阳性样品：将引物设计过程中筛选出的高保守区域bp9999-bp10134前后分别延长30～50bp进行基因合成，然后将其克隆至pMD19-T载体中，即为所述阳性质粒样品，编号CBG230-29。

进一步，所述步骤5)中Real-Time PCR反应适用于所有荧光定量PCR反应仪。

进一步，所述荧光定量反应仪器包括SmartCyclerII，ABI实时PCR系统、BioRad实时PCR检测系统、Stratagene定量多聚酶链反应仪。

进一步，所述步骤5)中最佳扩增条件为：

一种基孔肯雅病毒检测PCR体系，其特征在于，该体系包括引物或者其他能与基孔肯雅全长序列特异性结合并扩增的等同引物，其相似同源性不能超过90％，引物序列如下：

一种基孔肯雅病毒检测PCR体系，其特征在于，该体系包括引物及能与基孔肯雅全长序列特异性探针，探针序列如下：

能与基孔肯雅全长序列特异性结合并扩增的等同探针，其位点区域的覆盖率不能超过50％，其同源性不能超过70％。

本发明的设计一对新的引物探针，结合SmartCyclerII建立一种快 速、敏感、特异的荧光定量PCR方法检测基孔肯雅病毒。通过序列比对的方式挑选出基孔肯雅病毒基因组中高度保守的序列，在此序列上设计一对引物及一条Taqman探针，建立实时荧光定量PCR反应体系，并进行优化，检测该方法的灵敏度和特异性。

附图说明

图1为扩增曲线的二维显示图；

图2引物探针浓度筛选图；

图3、图4为灵敏度检测示意图；

图5为重复性检测示意图；

图6为标准曲线图。

具体实施方式

本发明基孔肯雅病毒荧光定量PCR检测新方法的工作原理即是利用荧光信号的变化定性分析，实时检测PCR扩增反应中每一个循环扩增产物量的变化，通过Ct值和标准曲线的关系对起始模板进行定量分析。本发明还涉及上述检测体系所包含的所有内容。

该方法包括以下步骤：

1)设计引物探针；

2)根据仪器选择荧光素；

3)合成引物和探针；

4)制备阳性质粒标准品；

5)运行PCR；

6)数据分析；

7)提取病毒RNA进行体系验证。

1、引物探针的设计

根据拟研究基因名称基孔肯雅病毒(Chikungunya virus)，在genebank中找到相应的全基因序列(www.ncbi.nlm.nih.gov)，运用DNASTAR软件进行同源性分析和blast序列分析，筛出高度保守区域bp88-bp209作为目标序列，采用引物设计软件Primer Premier 5进行引物探针的设计，序列见表1。

表1荧光定量PCR检测基孔肯雅病毒的引物和探针

  Name   Sequence  Position  Tm℃   Modification  FP   GAACACGTAACAGTGATCCCG  9999-10019  57.8    RP   GTAATCAAGCGATAGCGTTGG  10114-10134  58.0    Probe   TGGGAGTACCGTATAAGACTCTAGTCAACAGA  10028-10059  67.0   CY5/lowa Black

2、荧光素的选择

使用仪器为美国Cepheid公司的SmartCyclerII，荧光发射基团采用特性最为稳定的CY5基团，荧光淬灭基团采用lowa Black。

3、引物及探针的合成交予宝生物工程(大连)有限公司完成。

4、本发明采取基因合成方式制作阳性质粒作为阳性样品。将引物设计过程中筛选出的高保守区域bp88-bp209前后分别延长30～50bp进行基因合成，然后将其克隆至pMD19-T载体中，即为我们的阳性质粒样品，编号CBG230-29。

5、质粒标准品的制备

由委托公司合成并提取的阳性质粒样品原液，通过超微量紫外分光光度计测得浓度为670ng/μl，根据单链DNA的拷贝数计算公式“拷贝数浓度(copies/μl)＝DNA浓度(ng/μl)×6.02×1023(copies/mol)/324×2×(载体碱基数+目的基因碱基数)”计算得知质粒原液的DNA拷贝数浓度约为2.1×10¹¹copies/μl。使用EASY Dilution(一种专门用于标准品稀释使用的液体，由大连宝生物公司生产)进行梯度稀释最终得到1×10⁰～1×10¹⁰copies/μl的质粒标准品。

6、引物和探针溶解稀释至所需浓度并避光保存。

引物一般稀释到10μm/L，探针稀释到5μm/L，密封并避光保存到-20℃冰箱。稀释所用水为灭菌Tris水(Ph7.0～8.0)。

7、Real-Time PCR扩增

选用的扩增试剂盒为Premix Ex Taq试剂盒，购自宝生物工程(大连)有限公司。反应体系组分及其体积见表2。

表2

扩增条件如下

8、数据分析

9、提取病毒RNA，进行反转录，所得cDNA使用灭菌水梯度稀释，取代阳性样品进行检测验证。

阈值的选择

荧光定量PCR各种参数优化的过程中，Ct值为最关键的参考因素。计算Ct值的方法有结合交点法与二次曲线峰值法两种。我们将反应扩增曲线图中呈现的阈值线进行上下拖移，结合扩增速度变化率的抛物线来观察，当阈值线与扩增曲线的交点所对应的Ct值恰好通过二次曲线的峰值时，此时的阈值即为最佳阈值，Ct值也为最准确的Ct值。参考图1，确定本体系最佳阈值为30。

引物探针浓度的优化

1.首先稀释引物探针至低浓度备用，引物稀释到10μm/L，探针到5μm/L；

2.分别向各体系加入0.5μL、1μL已稀释上下游引物(10μm/L)，0.5μL、1μL Taqman探针(5μm/L)，同时运行PCR，体系其他组分按表2配制；

3.比较法优选最佳反应浓度组合，结果如图2.所示：两组曲线分别为0.5μL引物探针，1μL引物探针组合下扩增曲线图，前者可检测到的荧光信号约在100左右，Ct值较大；后者荧光信号接近400，Ct值也小。根据荧光值高Ct值小的原则，我们确定体系中加入1μL上下游引物，1μL探针为最佳，即引物探针终浓度400×200nmol/L。

退火温度的选择

理想状态下，退火温度足够低，以保证引物同目的序列有效退火， 同时要足够高，以减少非特异性结合。在设置退火温度时如下进行：以低于设计引物时估算的Tm5℃作为起始的退火温度，以2℃为增量，逐步提高退火温度。初步设定5组温度：52℃，54℃，56℃，58℃，60℃。五组退火温度下均可检测出目的片段，证明该引物和探针性能较好，可适应的温度范围较宽。但荧光信号最强同时Ct值最小的温度为54℃，最终确定最佳退火温度为54℃。

灵敏度的测定

按照已优化的反应体系和反应程序检测梯度模板，图3.即为1e³、1e²、1e¹、1e⁰四个梯度模板的检测结果图，图4.为图3.中1e⁰copies/μl的DNA模板检测图，显然1e⁰copies/μl六个平行试验中只得到一条扩增曲线，认为最低检测限只能达到十位数级，1e¹copies/μl稀释度的DNA。

重复性检测

图5为1e⁸～1e⁴copies/μl五个浓度梯度的DNA模板荧光定量PCR，每个梯度均作了2到3个平行实验，图中各梯度模板所产生的扩增曲线都产生了极为接近的Ct值，重复性非常好。

特异性检验

用所建立的方法检测与基孔肯雅病毒有相似传播媒介及临床表现的登革病毒，结果为阴性。表明本次所设计的引物探针特异性很高。

标准曲线的建立

体系的优劣可通过扩增效率e来反映，e值越趋近于1，说明扩增效率越接近100％，反应体系越佳；e＜1，说明体系扩增效率较低，体系需要优化；e＞1，说明体系中含有抑制物，需要降低甚至排除抑制物的干扰。该领域内公认的扩增效率适宜范围在0.8-1.2之间。采用1e⁸～1e⁴copies/μl模板进行扩增，所得标准曲线为图6，扩增函数

Y＝-0.305X+13.561，扩增效率e＝10-k-1＝0.1018＝101.8％。(k＝-0.305)

本发明的目的就是设计一对新的引物探针，结合SmartCyclerII建立一种快速、敏感、特异的荧光定量PCR方法检测基孔肯雅病毒。通过序列比对的方式挑选出基孔肯雅病毒基因组中高度保守的序列，在此序列上设计一对引物及一条Taqman探针，建立实时荧光定量PCR反应体系，并进行优化，检测该方法的灵敏度和特异性。本发明检测方法非常适用于基孔肯雅病毒，与登革热病毒等无交叉反应。