含内参的登革病毒与基孔肯雅病毒3重荧光定量PCR检测方法的建立与评估

摘要

目的:
　　登革热与基孔肯雅热分别由登革病毒和基孔肯雅病毒感染致病。登革病毒属于黄病毒科，黄病毒属，基因组为单股正链RNA，长约11Kb。基孔肯雅病毒(chikungunya virus，CHIKV)属于披膜病毒科(Togaviridae)中的甲病毒属西门利克森林病毒复合群（Semliki Forest Virus complex，SFV复合群）。基因组长约1.18 kb，共编码约12000个核苷酸的多聚蛋白。登革热和基孔肯雅热均属虫媒传播性疾病，传播媒介相同，主要为白纹伊蚊和埃及伊蚊。白纹伊蚊和埃及伊蚊主要分布在气温较高，雨水较多的地区，因此两种疾病的流行与暴发主要发生在热带和亚热带地区。2013年Brady和他的同事应用制图方法评估登革热的感染人数接近4亿，超过WHO估计总数的两倍多[1]，现已有超过125个国家出现过登革热病毒的感染。基孔肯雅热自从1952年在坦桑尼亚南部尼瓦拉州首次暴发后，现已有60多个国家出现过基孔肯雅热疫情的流行。两种病毒感染后临床症状相似，主要表现为发热、出疹、全身酸痛、头痛、肌肉及关节痛等症状，严重情况可出现出血及休克症状，危机生命。目前尚未研制出预防登革病毒和基孔肯雅病毒感染的疫苗，因此早期诊断对防止疾病进一步进展尤为重要。
　　目前存在的虫媒疾病诊断方法主要是病毒分离、血清学检测和分子生物学检测。病毒分离是登革与基孔肯雅病毒实验室诊断的金标准。常用的病毒分离方法有成年蚊虫胸腔接种分离法、乳鼠脑内接种分离法、敏感细胞系培养分离法等，但是病毒分离对实验要求较高，并且实验周期较长，不适用于病毒的快速检测。血清学检测包括血凝抑制试验和IgM/IgG抗体ELISA检测。血凝抑制试验操作简单，重复性好，但是特异性低，容易发生交叉反应，已逐渐被其它实验所代替。IgM/IgG抗体ELISA检测由于存在交叉反应，特异性较低。目前随着分子生物学技术的发展，普通RT-PCR可快速对病毒进行检测和分型，但由于此方法容易造成样本间的交叉污染，因此并不被推崇。现阶段，实时荧光定量RT-PCR检测技术被广泛应用于病毒快速诊断与分型，它是通过在普通RT-PCR技术基础上，加入荧光标记物，通过检测荧光标记物荧光信号强度来对病毒进行定量。荧光标记物分为染料法和探针法，染料法是在普通PCR反应体系中，加入过量的SYBR荧光染料，其非特异性地掺入分子DNA双链后结合于小沟中，并且发射出荧光信号，而其中不掺入分子DNA双链中的SYBR染料分子则不会发射任何荧光信号，因此保证了荧光信号与PCR产物的量成正比同步。探针法是在PCR扩增时同时加入一对特异性引物和一个特异性的荧光探针，探针两端分别标记一个荧光报告基团和一个荧光淬灭基团。当探针完整时，报告基团发射的荧光信号被淬灭基因吸收;PCR扩增时，Taq酶的5'-3'外切酶活性将探针酶切降解，使报告荧光基团和淬灭荧光基团分离，从而荧光监测系统可接收到荧光信号，即每扩增一条DNA链，就有一个荧光分子形成，实现了荧光信号的累积与PCR产物形成完全同步。本实验就根据此原理进行探针设计，进行登革病毒和基孔肯亚病毒的检测和定量。
　　方法:
　　1.登革病毒检测方法比较:2014年广东佛山登革热暴发期间，收集到432份登革疑似病例血清样本。根据病例发病后的采样日期对样本进行分类，分别使用NS1快速免疫层析法、NS1酶联免疫法、IgM/IgG酶联免疫法及实时荧光定量PCR分别对每份样本进行检测，进行统计分析，比较发病后不同采样日期，各种实验室检测方法阳性率。
　　2.引物、探针设计及标准品的制备:从GenBank中尽可能多的收集登革病毒（1-4型）及基孔肯雅病毒的基因序列，使用BioEdit6.12软件进行基因序列比对，分析病毒的保守序列，使用Primer Express3.0进行引物与探针设计。使用模板扩增引物分别扩增登革病毒和基孔肯雅病毒的基因保守片段，对扩增后目的基因进行纯化，连接至T-Vecter，转化至感受态细胞中，在含有Ampicillin的LB琼脂平板上涂板，培养，挑菌后，进一步测序证实插入片段正确。采用Droplet Digital PCR方法确定质粒浓度。人工合成一段基因作为内参，并对其设计引物与探针。
　　3.实时荧光定量RT-PCR特异度和灵敏度检测:将质粒标准品进行10倍系列连续稀释，使用多重荧光定量PCR检测方法进行检测，制作标准曲线，评估登革病毒与基孔肯雅病毒3重实时荧光定量PCR方法检测的检出限。选用日本脑炎病毒、西尼罗病毒、黄热病毒、辛德毕斯病毒各一株进行检测，评估此检测方法特异性。
　　4.实时荧光定量RT-PCR检测临床样本:294份登革热疑似病例血清样本及33份基孔肯雅病毒疑似样本，每份样本均进行基因测序和多重实时荧光定量RT-PCR两种方法的检测，以基因测序作为病毒检测的金标准，统计学方法计算分析实时定量RT-PCR方法的灵敏度、特异度、阴阳性符合率等指标。
　　结果:
　　1、参与评估不同发病日期不同检测方法阳性率的所有血清样样本采集时间为0-19天，其中男性有212人(49.0％)，女性有221人(51.0％).病人平均年龄为40.69(1-89)岁。
　　2、实时荧光定量PCR检测所有病例总阳性病例数为321，阳性率为74.13％，快速免疫层析法和NS1酶联免疫检测阳性病例数（阳性率）分别为350(80.8％)和350(80.8％)。这三种检测方法在登革热发病急性期检测结果均呈现较高的阳性率，特别是在发病后3-9天（三种检测方法发病日检测阳性率均超过80％）。而病毒IgG和IgM总阳性率较低（低于50％），发病日第九天之后，登革病毒IgG酶联免疫检测开始呈上身趋势。
　　3、登革病毒3'端非结构蛋白编码区和基孔肯雅病毒CDS区完成引物和探针设计。T-A克隆方法成功构建出带有基孔肯雅病毒和登革病毒目的基因片段的质粒标准品。
　　4、标准曲线与检出限:质粒浓度为9.2×105copies/ul和4.3×105copies/ul，质粒标准品稀释后CT值与浓度之间均具有良好的线性关系。登革病毒标准曲线为Y=39.66-3.601×lgX， R2=0.997。基孔肯雅病毒标准曲线为Y=40.22-3.464lgX，R2=0.999。登革病毒最低检测限为9.2×103copies/ml，基孔肯雅病毒最低检测限为4.3×103copies/ml。
　　5、重复性与特异度:登革病毒检测重复性试验结果显示，不同浓度质粒标准品检测的CT值的变异系数在1.59％-3.80％之间，不同浓度标准品间的CT值差异具有统计学意义(F=354.212，P＜0.0001)，相同浓度标准品间CT值差异无统计学意义(F=0.007，P＞0.05)。基孔肯雅病毒检测重复性试验结果显示，不同浓度质粒标准品检测的CT值的变异系数在1.59％-3.80％之间，不同浓度标准品间的CT值差异具有统计学意义(F=958.625，P＜0.0001)，相同浓度标准品间测CT值差异无统计学意义(F=0.002，P＞0.05)。检测日本脑炎病毒、西尼罗病毒、黄热病毒、辛德毕斯病毒各一株，均为阴性，特异度为100％。
　　6、临床样本评估:登革病毒检测灵敏度为100％，特异度为89.3％，阳性预测值为92.1％，阴性预测值为100％。基孔肯雅病毒检测灵敏度，特异度，阴、阳性预测值结果均为100％。
　　结论:
　　本实验首先根据发病后不同采血日期对市面上登革病毒检测方法进行评估，指导实验室选择最优方法进行登革病毒检测。接着，针对登革和疾控肯雅病毒建立了含内参的三重荧光定量RT-PCR方法，具有快速诊断、灵敏度、特异度高、重复性好的特点，并且可对病毒进行定量。

目录

摘要

第一章 前言

1．1 登革热、基孔肯雅热流行病学特征

1．11 登革热流行病学特征

1．12 基孔肯雅热流行病学特征

1．2 登革、基孔肯雅病毒病原学特征

1．21 登革病毒病原学特征

1．22 基孔肯雅病毒病原学特征

1．3 临床表现

1．4 虫媒病毒实验室检测方法

1．5 研究目的与意义

第二章 登革病毒不同诊断方法评估

2．1 材料

2．2 主要试剂和仪器

2．3 方法

2．3．1 登革病毒NS1抗原免疫层析法检测

2．3．2 登革病毒NS1抗原酶联免疫法检测

2．3．3 登革病毒IgM／IgG抗体酶联免疫法检测

2．3．4 实时荧光定量PCR检测

2．4 结果

2．4．1 样本统计学描述

2．4．2 疾病不同时期几种检测方法阳性率的比较

2．4．3 统计分析

2．5 讨论

2．6 小结

第三章 引物、探针设计及制备标准品

3．1 材料

3．1．1 病毒来源

3．1．2 试剂

3．1．3 主要溶液的配制

3．1．4 主要仪器设备

3．2 方法

3．2．1 引物和探针设计

3．2．2 标准品及内参的制备

3．3 结果

3．3．1 引物与探针序列

3．3．2 模板引物序列

3．3．3 登革和基孔肯雅病毒目的基因扩增电泳图

3．3．4 连接后单菌落培养

3．3．5 测序结果

3．4 结论

第四章 灵敏度、特异度及临床样本的评估

4．1 材料

4．1．2 样本来源

4．1．3 试剂与设备

4．2 方法

4．2．1 提取病毒RNA

4．2．2 逆转录成cDNA

4．2．3 数字PCR检测拷贝数

4．2．4 临床样本评估

4．3 结果

4．3．1 标准曲线与检出限

4．3．2 重复性和特异度检测

4．3．3 临床样本评估

4．4 讨论

4．5 结论

参考文献

攻读学位期间发表论文

致谢

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