一步法复合检测烟草普通花叶病毒与马铃薯Y病毒的方法及其引物

摘要

一步法复合检测烟草普通花叶病毒与马铃薯Y病毒的方法，其特征是：该方法包括甄别比对病毒基因组中保守区域，人工筛选合成适用于两种病毒病复合RT-PCR特异性引物；分析获得TMV、PVY复合侵染烟叶样本，整合反转录和PCR反应所需酶和缓冲液，通过反应条件优化，建立基于一步法RT-PCR复合检测烟叶感染TMV、PVY的方法。其优点为：1、使TMV、PVY病原的检测更简便，减少了试验污染和反应中的影响因素，检测时间大大缩短。2、提供的TMV、PVY特异性引物，具有非常高的病毒病原特异性，能够有效单一或复合识别TMV、PVY，保证检测结果的准确性。3、使用起来省时、省力，对样品材料要求不高、受实验条件的限制少。

说明书

技术领域

本发明属于植物病害检测防治领域，是一种一步法复合检测烟草普通花叶病毒病（Tobacco mosaic virus，TMV）和烟草马铃薯Y病毒（Potato Y virus，PVY）的方法，具体涉及针对两种病毒特异性核苷酸引物序列的合成和该检测方法的有效建立。

背景技术

烟草病毒病是烟草农业生产中的主要病害，发生危害将对烟叶产量造成重大损失，同时导致烟叶品质严重下降。病毒病在烟草上发生普遍且危害严重，据统计，2008年我国病毒病造成的烟叶产值损失占病虫害总损失的23.4%，病毒病已成为危害最严重的烟草病害（刘国顺, 刘建利. 中国烟草生产实用技术指南[M]. 北京: 农业出版社, 2007）。我国烟草病毒病原主要有烟草普通花叶病毒(Tobacco mosaic virus, TMV)、马铃薯Y病毒 (Potato virus Y, PVY)、黄瓜花叶病毒（Cucumber mosaic virus, CMV）等（朱贤朝, 王彦亭, 王智发. 中国烟草病害[M]. 北京: 中国农业出版社, 2002）。上述三种病毒均属于正单链RNA病毒，都具有相当广的寄主范围，可侵染多种重要作物。PVY在我国各烟区均有发生，是90年代东北烟区、黄淮烟区危害最严重的病害，也是北方烟区迅速萎缩的重要原因之一（李义强, 刘金亮, 王凤龙. 山东、河南烟草病毒病发生种类、发病规律研究[J]. 中国烟草学报, 2004, 10(3): 7-13）。近年来，TMV、PVY和CMV的发生呈愈加严重的趋势，侵染危害逐年上升，共同成为侵染烟草的优势病毒病原种群（钱玉梅, 王凤龙, 王劲波等. 山东省烟草病毒病种群发生动态及防治对策[J]. 烟草科技, 2001, 2: 43-46）。鉴于烟草病毒病的发生危害逐年上升，在烟草农业生产中快速、准确地检测出侵染烟叶病毒病原，对于及时采取相应的病毒病防治措施显得尤为重要。

目前大田作物病毒病鉴定的方法主要有常规生物学检测、免疫学及分子生物学方法。常规生物学检测是植物病毒研究工作的基本环节，主要包括寄主范围测定、鉴别寄主反应、病毒汁液饨化温度、稀释限点、体外存活期等离体性状测定和传播途径测定等，但较费时、费力（梁训生, 谢联辉. 植物病毒学[M]. 北京: 中国农业出版社, 1994）。新发展起来的检测方法包括血清学方法、免疫电镜技术(ISEM)、核酸分子杂交技术（探针检测技术），在植物病毒鉴定和检测中显示出巨大的作用，但都存在一些共性的问题，就是对制备病毒样品材料要求较高、受实验条件的限制以及费用昂贵，进而限制了这些技术的广泛应用。常规两步法逆转录-聚合酶链式反应（reverse transcription-PCR, RT-PCR）检测方法能够使极微量的病毒核酸呈指数扩增，检测灵敏度显著高于血清学方法，且整个检测过程时间短，所需仪器与试剂易于获得（Walsh, K., North, J., Barker, I. et al. Detection of different strains of Potato virus Y and their mixed infections using competitive fluorescent RT-PCR[J]. Journal of virological methods, 2001, 91(2): 167-173）。针对病毒基因组特异区域，根据扩增产物的特异性可鉴别出不同的病毒种类，故而RT-PCR技术被越来越多地运用于植物RNA病毒的检测。但常规两步法RT-PCR技术在应用过程中，是分为两个操作步骤和阶段来进行的，首先对目的病毒核酸进行反转录（RT），然后以此阶段合成的反转录产物（cDNA）为聚合酶链式反应（PCR）的模板，指数扩增获得相应病毒病原鉴定信息。两个反应步骤和阶段对应两个不同的反应体系，整个试验的影响因素较多，同时也加大了试验污染和人工误操作的几率。

与传统意义上的两步法RT-PCR相比，一步法RT-PCR和多重PCR技术的发展使多种植物RNA病毒病原的检测更加简便，在检测过程中尽可能地减少了试验污染，且大大缩短了检测时间。一步法RT-PCR不需要在cDNA合成后再加入PCR反应体系，而是将反转录酶与DNA聚合酶系统整合为统一的酶混合体系，能够减少污染和反应中的影响因素，也加快了整个反应过程。

发明内容

本发明的目的正是基于上述现有技术而提供的一步法复合检测烟草普通花叶病毒与马铃薯Y病毒的方法，根据TMV、PVY基因组序列保守区域分别设计合成一对特异性引物，整合反转录和PCR反应所需酶和缓冲液，通过反应条件优化，成功建立了基于一步法RT-PCR检测烟叶感染TMV、PVY的方法。该技术方法的建立将为烟草农业生产过程中TMV、PVY的准确检测提供一种快捷准确的方法。

本发明的目的是通过以下技术方案来实现的：一步法复合检测烟草普通花叶病毒与马铃薯Y病毒的方法，该方法包括甄别比对病毒基因组中保守区域，人工筛选合成适用于两种病毒病复合RT-PCR特异性引物；分析获得TMV、PVY复合侵染烟叶样本，整合反转录和PCR反应所需酶和缓冲液，通过反应条件优化，建立基于一步法RT-PCR复合检测烟叶感染TMV、PVY的方法。

具体步骤如下：

（1）使用DNAMAN6.0对GenBank中收录的TMV和PVY病毒各株系、各区域分离物全基因组序列做比对，确定病毒序列中的相对保守区域，在选定的保守区域内使用Primer Premier软件设计引物，并用BLAST工具（http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi）分析确保引物特异性。PVY和TMV由此分别得到多对引物。由于多重PCR要求各引物及引物对的退火温度尽量接近，同时扩增子的大小也应在琼脂糖凝胶电泳能够显著区分的情况下尽量相近，故最终选定两对引物：PVY：上游引物(PF) 5’-GGATCAATGCATCCTGTCATAC-3’ ；下游引物(PR) 5’-GCYTTGTCAGACCAATCTTTCC-3’ ；TMV：上游引物(TF) 5’-CGGAGATCTCGACAGTCATGTG-3’ ；下游引物(TR) 5’-TACAGGCGTAAACATCGACGG-3’ ；用去RNase水溶解至工作浓度20Μm；

（2）检测分析大田烟区采集的病毒烟叶样品，找到TMV、PVY侵染的烟叶样品；

（3）烟叶总RNA的提取；

（4）一步法复合RT-PCR反应条件的建立

本实验RT-PCR使用TaKaRa公司的PrimeScript One Step RT-PCR Kit Ver.2，经过优化的反应体系：Enzyme Mix 1.5μl；1 Step Buffer 12.5μl；PVY上、下游引物各0.4μl，TMV上、下游引物各0.25μl；RNA 2μl；去RNase水7.7μl，反应条件：50℃反转录30min，94℃热失活2min；94℃变性30sec，56℃退火30sec，72℃延伸1.5min，30个循环；72℃补充延伸10min，扩增产物取5~10μl在1%琼脂糖凝胶中电泳检测。

在本发明中，步骤（2）中使用Agdia公司TMV、PVY诊断试剂盒PathoScreen                                                TMV、 PathoScreenPVY检测分析大田烟区采集的病毒烟叶样品，通过血清学方法找到TMV、PVY侵染的烟叶样品。

步骤（3）中，采用异硫氰酸胍方法提取RNA，使用Bio Basic公司的Ez Spin Column Plant Isolation Kit提取总RNA。

两种病毒特异性核苷酸引物为：PVY：上游引物(PF) 5’-GGATCAATGCATCCTGTCATAC-3’ ；下游引物(PR) 5’-GCYTTGTCAGACCAATCTTTCC-3’ ；TMV：上游引物(TF) 5’-CGGAGATCTCGACAGTCATGTG-3’ ；下游引物(TR) 5’-TACAGGCGTAAACATCGACGG-3’ 。

本发明与现有TMV、PVY的检测方法相比，其优点为：（1）本发明方法使TMV、PVY病原的检测更加简便，在检测过程中尽可能地减少了试验污染和反应中的影响因素，且大大缩短了检测时间。（2）本发明提供的TMV、PVY特异性引物，具有非常高的病毒病原特异性，能够有效单一或复合识别TMV、PVY，保证检测结果的准确性。（3）本发明方法使用起来省时、省力，对制备病毒样品材料要求不高、受实验条件的限制少，在烟草农业生产过程中TMV、PVY的准确检测具备广泛应用的基础和条件。

附图说明

图1 一步法复合RT-PCR反应体系的PVY和TMV病毒样品的电泳检测结果

其中：1-5 PVY和TMV上下游引物量分别为0.5+0.25、0.4+0.25、0.35+0.25、0.3+0.25、0.25+0.5μl

具体实施方式

本发明以下将结合实施例做进一步描述，但并不限制本发明。

实施例1：

（1）使用DNAMAN6.0对GenBank中收录的TMV和PVY病毒各株系、各区域分离物全基因组序列做比对，确定病毒序列中的相对保守区域。在选定的保守区域内使用Primer Premier软件设计引物，并用BLAST工具（http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi）分析确保引物特异性。最终选定两对引物。PVY：上游引物(PF) 5’-GGATCAATGCATCCTGTCATAC-3’ ；下游引物(PR) 5’-GCYTTGTCAGACCAATCTTTCC-3’。TMV：上游引物(TF) 5’-CGGAGATCTCGACAGTCATGTG-3’ ；下游引物(TR) 5’-TACAGGCGTAAACATCGACGG-3’。引物由上海生工生物工程有限公司合成，按照合成说明书用去RNase水溶解至工作浓度20Μm；

（2）使用Agdia公司TMV、PVY诊断试剂盒（PathoScreenTMV、 PathoScreenPVY）检测分析大田烟区采集的病毒烟叶样品，通过血清学方法找到TMV、PVY复合侵染的烟叶样品；

（3）烟叶总RNA的提取

使用Bio Basic公司的Ez Spin Column Plant Isolation Kit提取总RNA做为一步法复合RT-PCR的病毒核酸模版。推荐采用异硫氰酸胍方法提取RNA，这样确保RNA质量较好，利于RT-PCR的成功。

（4）一步法复合RT-PCR反应条件的建立

本实验RT-PCR使用TaKaRa公司的PrimeScript One Step RT-PCR Kit Ver.2。经过优化的反应体系：Enzyme Mix 1.5μl；1 Step Buffer 12.5μl；PVY上、下游引物各0.4μl，TMV上、下游引物各0.25μl；RNA 2μl；去RNase水7.7μl。反应条件：50℃反转录30min，94℃热失活2min；94℃变性30sec，56℃退火30sec，72℃延伸1.5min，30个循环；72℃补充延伸10min。扩增产物取5~10μl在1%琼脂糖凝胶中电泳检测。

实施例2：

（1）人工合成两对病毒特异性引物。PVY：上游引物(PF) 5’-GGATCAATGCATCCTGTCATAC-3’；下游引物(PR) 5’-GCYTTGTCAGACCAATCTTTCC-3’。TMV：上游引物(TF) 5’-CGGAGATCTCGACAGTCATGTG-3’；下游引物(TR) 5’-TACAGGCGTAAACATCGACGG-3’。按照合成说明书用去RNase水溶解至工作浓度20Μm；

（2）使用Agdia公司TMV、PVY诊断试剂盒（PathoScreenTMV、 PathoScreenPVY）检测分析大田烟区采集的病毒烟叶样品，通过血清学方法找到TMV、PVY单一侵染的烟叶样品；

（3）烟叶总RNA的提取

使用Bio Basic公司的Ez Spin Column Plant Isolation Kit分别提取TMV、PVY总RNA。

（4）一步法复合RT-PCR反应条件的建立

本实验RT-PCR使用TaKaRa公司的PrimeScript One Step RT-PCR Kit Ver.2。经过优化的反应体系：Enzyme Mix 1.5μl；1 Step Buffer 12.5μl；PVY上、下游引物各0.4μl，TMV上、下游引物各0.25μl；PVY-RNA 1μl，TMV-RNA 1μl；去RNase水7.7μl。反应条件：50℃反转录30min，94℃热失活2min；94℃变性30sec，56℃退火30sec，72℃延伸1.5min，30个循环；72℃补充延伸10min。扩增产物取5~10μl在1%琼脂糖凝胶中电泳检测。

实施例3：

（1）人工合成两对病毒特异性引物。PVY：上游引物(PF) 5’-GGATCAATGCATCCTGTCATAC-3’；下游引物(PR) 5’-GCYTTGTCAGACCAATCTTTCC-3’。TMV：上游引物(TF) 5’-CGGAGATCTCGACAGTCATGTG-3’；下游引物(TR) 5’-TACAGGCGTAAACATCGACGG-3’。按照合成说明书用去RNase水溶解至工作浓度20Μm；

（2）使用Agdia公司TMV、PVY诊断试剂盒（PathoScreenTMV、 PathoScreenPVY）检测分析大田烟区采集的病毒烟叶样品，通过血清学方法找到TMV、PVY单一侵染的烟叶样品；

（3）烟叶总RNA的提取

使用Bio Basic公司的Ez Spin Column Plant Isolation Kit分别提取TMV、PVY总RNA，等量混合后做为一步法复合RT-PCR的病毒核酸模版。

（4）一步法复合RT-PCR反应条件的建立

本实验RT-PCR使用TaKaRa公司的PrimeScript One Step RT-PCR Kit Ver.2。经过优化的反应体系：Enzyme Mix 1.5μl；1 Step Buffer 12.5μl；PVY上、下游引物各0.4μl，TMV上、下游引物各0.25μl；混合RNA 2μl；去RNase水7.7μl。反应条件：50℃反转录30min，94℃热失活2min；94℃变性30sec，56℃退火30sec，72℃延伸1.5min，30个循环；72℃补充延伸10min。扩增产物取5~10μl在1%琼脂糖凝胶中电泳检测。

序列表

 

<110>中国烟草总公司郑州烟草研究院

<120>一步法复合检测烟草普通花叶病毒与马铃薯Y病毒的方法

<160>4

<210>1

<211>22

<212>DNA

<213>人工序列

<222>（1）..(22)

<400>1 

ggatcaatgc  atcctgtcat  ac

 

<210>2

<211>22

<212>DNA

<213>人工序列

<222>（1）..(22)

<400>2

gcyttgtcag  accaatcttt  cc

 

<210>3

<211>22

<212>DNA

<213>人工序列

<222>（1）..(22)

<400>3

cggagatctc  gacagtcatg  tg

 

<210>4

<211>21

<212>DNA

<213>人工序列

<222>（1）..(21)

<400>4

tacaggcgta  aacatcgacg  g