基于减毒痘苗病毒天坛株为载体的禽流感疫苗

摘要

本发明涉及一种表达禽流感病毒H5N1亚型血凝素(HA)蛋白的重组痘苗病毒，其可用作禽流感疫苗。具体地，所述禽流感疫苗基于减毒痘苗病毒天坛株(CCTCC：V200416)而构建。本发明提供了用于构建所述禽流感疫苗的载体。本发明还涉及使用所述禽流感疫苗的免疫接种方案。

说明书

技术领域

本发明涉及生物技术领域，更具体的说涉及基于高度减毒痘苗病毒天坛株(CCTCC：V200416)为载体的禽流感疫苗及其制备方法和用途。

背景技术

禽流感(Avian Influenza，AI)是由正粘病毒科流感病毒属的A型流感病毒引起的一类人畜禽共患传染性疾病或疾病综合症。1878年，Perroncito首次报道意大利鸡群暴发了禽流感，当时称之为鸡瘟。1901年，Centannic和Sarunozzi认为此病由“可滤过”病原引起。直到1955年，才由Schafer证实鸡瘟病毒实际上就是A型禽流感病毒。禽流感病毒现已广泛分布于世界范围内的许多家禽(包括火鸡、鸡、珍珠鸡、鹌鹑、鹧鸪、鸵鸟、雉、鹅和鸭等)和野禽(野鸭、天鹅、燕鸥、鹭、海鸠、海鹦和海鸥等)。禽流感病毒可以感染人、猪、马、海洋哺乳动物及多种禽类，其中对火鸡和鸡的危害最为严重。该病是世界动物卫生组织(OIE)规定的A类传染病，我国也列为一类动物传染病。研究发现，A型流感病毒所有的H亚型和N亚型都存在于水禽及海鸟中，因此水禽和海鸟被称为A型流感病毒的天然储存库。已有的研究表明，所有哺乳动物流感病毒均来自于禽流感病毒。在20世纪的4次人类流感大流行中(1918年西班牙流感，1957年亚洲流感，1968年香港流感和1977年的前苏联流感)，所分离到的人流感病毒均具有禽流感病毒的遗传学特性。

根据致病性的不同，禽流感可分为高致病性禽流感(Highly Pathogenic Avian Influenza，HPAI)、低致病性禽流感(Low Pathogenic Avian Influenza Virus，LPAI)和非致病性禽流感(None-Pathogenic Avian Influenza Virus，NPAI)三大类。其中高致病性禽流感引起的危害最大。近年来，频繁暴发的H5N1高致病性禽流感不但给世界养禽业带来了严重的经济损失，而且 对人的生命健康也造成了严重的威胁，高致病性禽流感病毒感染人甚至致人死亡的病例时有发生。1997年，在我国香港特别行政区首次出现了禽流感病毒直接感染人的病例，一名3岁男童被确诊感染H5N1亚型AIV，之后共18人感染发病，6人死亡。其后，人感染禽流感一直在亚洲地区零星爆发。自2003年12月开始，禽流感在东南亚地区，主要在越南、泰国和印尼等国严重暴发，造成多名病人死亡，并迅速蔓延我国。目前，禽流感已在世界上许多个国家暴发，截止至2009年8月31日(2003年始)，世界卫生组织(WHO)报告高致病性人禽流感(H5N1)确诊病例达440例(15个国家)，死亡262例，死亡率达59.5％。尽管目前还没有证据表明，高致病性禽流感H5N1病毒可以在人与人之间传播，但H5N1病毒的宿主可变性与广泛传播的特点表明了该病毒通过重组导致在人群之间传播的巨大可能性。WHO认为该疾病可能是对人类潜在威胁最大的疾病之一，要求世界各国做好应对流感大流行的防控准备。

预防与控制流感可能大规模流行的最好办法是疫苗。现行有效的预防流感的疫苗主要分为两种：用鸡胚培养的常规灭活疫苗及减毒流感疫苗。前者又分为整病毒，部分产物亚单位表面抗原疫苗。整病毒疫苗因伴随许多副作用，已很少采用，绝大部分疫苗为纯化疫苗，即用去垢剂处理纯化的病毒，然后经过离心等步骤进一步纯化血凝素及神经氨酸酶蛋白，制备表面抗原疫苗。将三种不同病毒株的抗原合并还可制成三联疫苗。灭活疫苗安全性和免疫原性都不错，不存在毒力返强的危险。但是灭活疫苗也有一定的缺点。首先，流感病毒的生产依赖于SPF鸡胚，限制了其大批量生产；其次，用鸡胚生产的灭活疫苗对部分人群会有局部和全身的不良反应。此外，如果以高致病性流感病毒为疫苗株，还需要特定的BSL-3生物安全生产车间，这样更加限制了疫苗的生产。另外一种则为温度敏感型减毒活疫苗，将WHO当年推荐的流感病毒株的血凝素基因与神经氨酸酶基因与六种其它温度敏感型减毒株基因重组，通过鸡胚培养，制成减毒活疫苗。减毒活疫苗接种后，在机体内具有有限的繁殖能力，可使机体发生接近隐性感染或轻度感染的反应，但不产生显著临床症状，免疫效果强而持久，一般只需接种一次，且接种剂量小，具有刺激机体产生体液免疫和细胞免疫保护。该疫苗的缺点就是有效期短，须在低温条件下储存和运输，安全性 存在隐患，而且最大的缺点就是可能会因发生基因突变而在人体内恢复毒力。

由于H5N1的强毒性，难于在鸡胚中生长和由高致病带来的安全与规则方面的问题，限制了使用常规方法来研制生产H5N1疫苗。为了克服这一因难，目前研制有效的H5N1疫苗主要策略是：

1.选用抗原类似的非致病性流感病毒株。

自1997年香港H5N1暴发以来，已在人群中试用两种疫苗。使用非致病流感株A/duck/Singapore/3/97制备的H5N1亚单位疫苗临床试验表明，该疫苗虽然经过多次免疫仅产生很弱的抗体反应。虽然使用MF59佐剂可改善该备选疫苗的免疫原性，但其保护性有待进一步证明(Stephenson I，et al，The Journal of Infectious Diseases，2005(191)：1210-1215)。

2.使用昆虫表达系统表达H5N1表面抗原。

使用高效表达蛋白的昆虫系统表达H5血凝素，可保护鸡抵抗H5N1致死剂量的攻击。临床试验结果则显示非常弱的免疫原性。即使经过两次90ug高剂量的免疫，只有52％的试验显示产生中和抗体。昆虫系统表达的H5血凝素弱的免疫原性可能由不同的糖基化所致，或H5蛋白在人体的弱免疫原性(Treanor JJ，et al，Vaccine，2001(19)：1732-1737)。

3.使用反向遗传法构建减毒流感病毒。

反向遗传基本原理是使用常规流感减毒株H1N1除血凝素外的所有编码蛋白质粒加上来自高致病H5N1经突变的表达H5血凝素的质粒共转染细胞，获得新的重组流感病毒。该病毒由突变H5蛋白加上减毒H1N1其他组份组成。该减毒疫苗经鸡胚培养放大之后，可按常规流感病毒疫苗办法制备抗H5N1的人用疫苗。虽然反向遗传改造的流感减毒株在动物试验中显示出有效的保护作用。但能否在人体试验也具有良好的免疫保护效果尚不得而知。一种很大的可能是与H5表达蛋白一样，减毒株的弱免疫原性，难于在人体内刺激产生有效的中和抗体。另外，反向遗传技术难以在短时间内提供大量的疫苗。因此，目前的疫苗研究在近期内制出在人类有效的抗H5N1疫苗不容乐观。必须使用新的研究方法解决发生H5N1在人类大规模流的威胁。

活病毒载体疫苗是将编码病毒蛋白的基因插入其他病毒基因组中并用 之感染动物或人体，产生对基因产物及载体的免疫反应。这种基于重组有机体的疫苗具有潜在的免疫原性，而无原病毒引起的病理反应。因此成为HIV、SARS等疫苗的重要研究领域。其中以痘苗病毒载体的活载体疫苗研究的最为深入和广泛，目前已成功表达了多种来源于动物和人类病毒的基因，如牛流行热病毒的G蛋白基因，乙型肝炎病毒SS1蛋白基因，麻疹病毒HA与F蛋白基因，狂犬病毒G蛋白和N蛋白基因，获得性免疫缺陷综合症病毒的GAG和POL蛋白基因等。

鉴于当前禽流感疫苗研制存在的困难，本发明将H5N1高致病性禽流感病毒的HA基因插入痘苗病毒天坛株基因组中，制备了基于减毒痘苗病毒天坛株为载体的禽流感疫苗。它具有以下优点：痘苗病毒天坛株是中国特有的痘苗病毒毒株，曾作为预防天花流行的疫苗株在我国大量人群中长期使用过，具有相对毒力较弱、使用安全的特点，是研制适用于中国应用的基因工程活病毒载体疫苗的理想毒株；痘苗病毒在感染宿主细胞的胞浆中复制，无致癌性；插入外源基因容量大，可发展联合疫苗；能准确表达外源蛋白，并对其加工提呈、刺激机体产生细胞免疫和体液免疫、特别是能够诱导产生特异性CTL应答；比灭活的禽流感病毒疫苗更加安全，比反向遗传技术生产的疫苗更适合工业生产。因此将能及时为疫苗的交叉保护作用研究提供不同来源的疫苗。

发明内容

本发明的目的之一是克服现有技术的不足，提供一种禽流感减毒痘苗病毒重组毒株(CGMCC：3429)，由该毒株制备的减毒活疫苗具有良好的安全性和免疫原性。

本发明提供了一种表达AIV抗原的活病毒载体禽流感疫苗，其包含痘苗病毒天坛株作为载体，其中所述痘苗病毒基因组的血凝素基因插入了至少一种编码H5N1亚型AIV抗原(如血凝素)的多核苷酸。

在本发明的禽流感疫苗中，所述至少一种编码H5N1亚型AIV抗原的多核苷酸来源于H5N1亚型禽流感病毒青海分离株(A/Bar-headed Goose/Qinghai/1/05)。

本发明的目的通过以下方法来实现：从H5N1亚型禽流感病毒青海分 离株中克隆具有良好生物学性状和免疫效果的HA基因，将AIV HA基因亚克隆入痘苗病毒天坛株转移载体中，构建能够将AIV HA基因转入重组痘苗病毒同一区域高效表达的重组质粒，将该重组质粒与痘苗病毒天坛株重组，通过对重组病毒进行筛选，纯化，获得能够高效，稳定表达H5N1亚型禽流感病毒HA基因的安全，有效的重组痘苗病毒疫苗毒株。

更具体地，本发明提供以下各项：

1.一种表达H5N1亚型禽流感病毒抗原的重组痘苗病毒，其以减毒痘苗病毒作为载体，其中在所述减毒痘苗病毒的基因组中插入了至少一种编码H5N1亚型禽流感病毒抗原的基因。

2.根据以上1所述的重组痘苗病毒，其中所述H5N1亚型禽流感病毒抗原是禽流感病毒H5N1亚型血凝素(HA)蛋白，优选所述HA蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示(参见后附序列表)。

3.根据以上2所述的重组痘苗病毒，其中在所述痘苗病毒基因组的血凝素(HA)基因编码区中插入所述禽流感病毒H5N1亚型血凝素(HA)蛋白的编码基因，优选所述HA蛋白的编码基因的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示(参见后附序列表)。

4.根据以上2所述的重组痘苗病毒，其中编码所述禽流感病毒H5N1亚型血凝素(HA)蛋白的基因来源于H5N1亚型禽流感病毒青海分离株(A/Bar-headed Goose/Qinghai/1/05)。

5.根据以上1-4中任一项所述的重组痘苗病毒，其中作为载体的所述减毒痘苗病毒是痘苗病毒天坛株(CCTCC：V200416)。

6.根据以上5所述的重组痘苗病毒，其保藏号为CGMCC No.3429。

7.根据以上1-6中任何一项的重组痘苗病毒在制备禽流感疫苗中的应用。

8.根据以上7所述的应用，其中所述禽流感疫苗是通过肌肉注射、滴鼻、或口服施用的。

9.禽流感疫苗试剂盒，其包含以上1-6中任何一项的重组痘苗病毒。

附图说明

图1：pZCxz(图1(A))和pZCxz-HA(图1(B))的质粒图谱；

图2：rVTT-HA的构建过程；

图3：重组痘苗病毒rVTT-HA的荧光鉴定(A.感染rVTT-HA的细胞；B.对照)；

图4：重组痘苗病毒rVTT-HA的免疫染色试验(A.感染rVTT-HA的细胞；B.对照)；

图5：攻毒后四个不同组别的小鼠体重变化情况(PBS表示对照；i.m.表示为肌肉注射；i.n.表示为滴鼻；p.o表示为口服)；

图6：攻毒后四个不同组别的小鼠存活情况(PBS表示对照；i.m.表示为肌肉注射；i.n.表示为滴鼻；p.o表示为口服)；

图7：H5N1亚型禽流感病毒A/Bar-headed Goose/Qinghai/1/05株攻毒后免疫及对照组小鼠每天的存活率(PBS表示对照；i.m.表示为肌肉注射；i.n.表示为滴鼻；p.o表示为口服)；

图8：H5N1亚型禽流感病毒A/Vietnam/1194/04株攻毒后免疫及对照组小鼠每天的存活率(PBS表示对照；i.m.表示为肌肉注射；i.n.表示为滴鼻；p.o表示为口服)。

具体实施方式

下文将参考实施例详细描述本发明，所述实施例仅是意图举例说明本发明，而不是意图限制本发明的范围。本发明的范围由后附的权利要求具体限定。

实施例1：表达禽流感病毒HA基因的重组痘苗病毒转移载体的构建

以H5N1亚型禽流感病毒A/Bar-headed Goose/Qinghai/1/05株(Jinhua Liu#，et al.Highly pathogenic H5N1 influenza virus infection in migra-tory birds.Science，2005，309：1206)的RNA为模板，运用合成引物(引物1：5‘TTGGATCCATGGAGAAAATAGTGCT3’；引物2：5‘GGCTCGAGTTAAATGCAAATTCTGC3’；其中引物1序列5‘端加入BamH I酶切位点，引物2序列5‘端加入XhoI酶切位点)，通过RT-PCR进行HA基因扩增，扩增的HA基因包括HA基因的完整阅读框架。

将扩增的HA基因通过BamH I和Xho I酶切位点亚克隆入同样用BamH I和Xho I酶切的pZCXZ穿梭载体中(Huang，X.，B.Lu，W.Yu，Q.Fang，L.Liu，K.Zhuang，T.Shen，H.Wang，P.Tian，L.Zhang，and Z.Chen.2009.A novel replication-competent vaccinia vector MVTT is superior to MVA for inducing high levels of neutralizing antibody via mucosal vaccination.PLoS ONE 4：e4180)，该载体含有痘苗病毒特异的双向启动子pSYN和pH5，可对外源基因进行高效表达。我们插入的流感病毒HA基因置于痘苗病毒早/晚期启动子pSYN下游，由该启动子启动表达。而筛选标记基因绿色荧光蛋白(GFP)则由痘苗病毒早/晚期启动子pH5启动子控制表达。插入的外源基因和GFP基因表达盒的两侧为痘苗病毒HA基因ORF的编码序列，将得到得痘苗病毒重组转移质粒载体命名为pZCXZ-HA(质粒图谱见图1(B))。 

实施例2：表达禽流感病毒HA基因的重组痘苗病毒的构建

用制备好的鸡胚成纤维细胞接种六孔板，待细胞80％长满单层后，接种痘苗病毒天坛株(CCTCC：V200416)，每孔接种量为0.5MOI。37℃感作2小时，倒掉感染液，用无抗生素和犊牛血清的DMEM培养液漂洗细胞三次；然后根据脂质体Lipofectamin^TM 2000(购自Invitrogen公司)说明书，使用脂质体法将4μg纯化的重组转移质粒pZC_XZ-HA转染已感染痘苗病毒天坛株的鸡胚成纤维细胞，37℃感作1小时，倒掉转染液，加入含5％犊牛血清的DMEM培养液(DMEM和犊牛血清均购自Invitrogen公司)，37℃，5％CO₂温箱培养48小时，待细胞出现典型病变，收获该细胞培养物反复冻融三次作为转染种毒。

将上述转染种毒按10^-1、10^-2、10^-3稀释度接种80％长满单层的鸡胚成纤维细胞。37℃感作2小时，倒掉感染液，洗涤细胞，覆盖含1％低熔点琼脂糖的DMEM营养琼脂培养至蚀斑出现。挑取绿色荧光蚀斑，放入DMEM培养液中反复冻融三次，进行新一轮的重组病毒蚀斑筛选纯化。如此重复筛选6次后，即得到纯化的重组痘苗病毒rVTT-HA(构建过程见图2)。根据布达佩斯条约，该重组痘苗病毒rVTT-HA于2009年11月10日保藏在中国北京的中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC，中国北京市朝阳区北辰西路1号院3号，邮政编码：100101)，保藏号为CGMCC No.3429。

取筛选纯化的重组病毒rVTT-HA接种鸡胚成纤维细胞，37℃，5％CO₂ 温箱培养48小时，待出现典型病变后，置荧光显微镜下观察，可见感染病毒的细胞发出绿色荧光，而未接种重组病毒的细胞看不到绿色荧光(见图3)。为了检测HA的表达情况，将筛选纯化的重组病毒rVTT-HA接种鸡胚成纤维细胞，37℃，5％CO₂温箱培养48小时。待出现典型病变后，倒掉培养液，用DMEM将细胞清洗三次，然后加入1∶1的甲醇/丙酮溶液对细胞进行固定。五分钟后弃去固定液，漂洗后加入PBS稀释的H5特异性单克隆抗体(购自Santa公司)，室温孵育1小时，漂洗后加入1∶5000稀释的辣根过氧化物酶标记的抗鼠二抗(购自北京中杉生物技术有限公司)室温孵育1小时，漂洗后加入底物溶液进行显色。结果表明，HA在感染细胞中得到了较好的表达并且表达产物具有较好的免疫原性(见图4)。

实施例3：重组天坛痘苗病毒禽流感疫苗在动物体内诱导AIV特异性免疫的效力

1.疫苗不同免疫途径的保护性研究

1)疫苗产生抗体水平测定

以肌注、滴鼻和口服的方式对6周龄SPF Balb/c小鼠(购自北京实验动物中心)进行免疫，剂量为每只3.0×10⁶PFU(plaque forming unit，蚀斑形成单位)，共免疫两次，间隔为31天。分别于首次免疫后的0天、28天和45天采血，根据世界动物卫生组织推荐的方法测定血清中抗H5N1病毒的血凝抑制抗体(HI)水平和微量中和抗体水平(http://www.oie.int/Eng/Normes/Mmanual/A_00037.htm)。结果发现小鼠的本底血清(即免疫前0天采集的血清)HI和中和抗体均为阴性。首免(首次免疫)后28天，肌注和滴鼻疫苗免疫组H5的抗体水平增高，且很均一；而口服疫苗组抗体水平也有升高，但不均一，有2只小鼠HI抗体为0。在首免后45天及二免后14天，肌注和滴鼻疫苗组H5抗体水平增高，HI的平均值均达到了2⁷，中和抗体的平均值分别为623.25和1112.5，而口服组HI则在0-2⁸之间，中和抗体在0-1778之间(见表1)。

表1.首免后不同时段HI抗体和中和抗体水平的检测结果

注：HI表示血凝抑制抗体；NA表示微量中和抗体

2)攻毒后小鼠体重变化及存活情况

在小鼠二免后22天用H5N1亚型禽流感病毒A/Bar-headed Goose/Qinghai/1/05株(Jinhua Liu^#，et al.Highly pathogenic H5N1 influenza virus infection in migra-tory birds.Science，2005，309：1206)进行攻毒，攻毒剂量为6000MLD₅₀(小鼠半数致死量)，从攻毒后3天开始，每天称小鼠体重，发现攻毒后前5天疫苗组小鼠体重有所下降，随后相对平稳，对照组小鼠体重下降明显(见图5)。对照组小鼠在攻毒后4天开始死亡，第5天全部死亡。口服组于攻毒后第4天、5天分别死1只，其后保持稳定，没有死亡(见图6)。

2.疫苗的交叉保护性研究

1)同源及异源抗体水平

以肌注和滴鼻两种途径，将疫苗rVTT-HA、rVTT-S(Huang，X.，B.Lu，W.Yu，Q.Fang，L.Liu，K.Zhuang，T.Shen，H.Wang，P.Tian，L.Zhang，and Z.Chen.2009.A novel replication-competent vaccinia vector MVTT is superior to MVA for inducing high levels of neutralizing antibody via mucosal vaccination.PLoS ONE 4：e4180)及PBS对照以1.5×10⁶PFU/只的量对6周 龄BALB/c小鼠进行两次免疫，并于二免后2周收集小鼠血清，测定同源及异源H5亚型流感病毒的HI抗体及微量中和抗体的滴度，发现滴鼻和肌注疫苗组同源(A/Bar-headed Goose/Qinghai/1/05)HI抗体分别为2⁶和2⁷，微量中和抗体平均值分别为501.5和819.6，异源(A/Vietnam/1194/04)抗体水平相对于同源的稍微低些，HI低1个滴度，中和抗体低1/4-2之间(见表2)。

表2：二次免疫2周后小鼠异源及同源H5亚型流感病毒抗体的水平

注：i.n表示滴鼻；i.m.表示肌肉注射；GMTs为：“Geometric mean antibody titers”的缩写

2)攻毒后小鼠死亡情况

二免后3周，进行攻毒，A/Bar-headed Goose/Qinghai/1/05和A/Vietnam/1194/04(由美国疾病预防控制中心提供)攻毒用剂量为100MLD₅₀(小鼠半数致死量)。A/Bar-headed Goose/Qinghai/1/05攻毒组，PBS对照组和rVTT-S对照组全部死亡，而rVTT-HA免疫的两组全部存活，小鼠每日存活情况统计见图7。A/Vietnam/1194/04攻毒后，PBS和rVTT-S对照组没有全部死亡，但是免疫组全部存活(见图8)，保护率为100％。采取攻毒后仍然存活的PBS和rVTT-S对照组小鼠的血清，测定抗A/Vietnam/1194/04的HI抗体，发现HI抗体呈阳性。

3)攻毒后小鼠体内病毒重分离

分别于攻毒后的第3天、6天采集免疫小组及对照小组中小鼠的脑、肝和肺组织，称取重量，研磨后加入9倍体积(v/w)含2000IU青霉素和链霉素(购自华北制药股份有限公司)的DMEM培养液，将研磨物从研钵中吸出，冻融两次后离心，3000r/m，5min。吸取上清液接种9日龄SPF鸡胚(购自北京实验动物中心)，0.1ml/枚。鸡胚死亡后采集尿囊液测定HA活性，以此判定病毒的重分离情况(见表3)。

表3：攻毒后不同时段病毒重分离结果

从病毒分离结果来看，rVTT-HA能有效降低同源及异源病毒在小鼠体内的复制。免疫组小鼠在同源及异源攻毒后的第3天和第6天所采得肝、肺及脑组织中，很难用鸡胚重分离到病毒，可能是病毒滴度太低的原因，而PBS和rVTT-S对照组都能分离到。

总之，上述所有实验结果表明：1.重组病毒rVTT-HA经肌注、滴鼻和口服三种不同免疫途径接种小鼠后，均能够诱导小鼠产生HI抗体和中和抗体，但肌注和滴鼻组免疫效果相对较好，产生的抗体较均一，可以提供100％的同源保护，而口服途径产生的抗体不均一。综合分析，滴鼻可作为临床应用的最佳选择，可将疫苗制成喷雾剂的形式直接喷入鼻子，既简单又方便。2.重组疫苗rVTT-HA能为小鼠提供同源及异源性的保护，并能有效地降低病毒在小鼠体内的复制。