中期因子表达量的实时荧光定量RT-PCR检测试剂盒

摘要

本发明涉及细胞及组织中中期因子(MK)表达量的实时荧光定量PCR检测试剂盒及检测方法。所述中期因子表达量的实时荧光检测试剂盒，主要包括中期因子DNA标准品、特异性引物、PCR缓冲液、脱氧核糖核苷酸混合物(dNTP)、DNA聚合酶和DNA荧光染料，所述特异性引物序列如下：上游引物MK up：5’-ctc cgc ggt cgc caa aaa gaa aga-3’；下游引物MK down：5’-ccc cca tcacac gca ccc cag tt-3’；本发明具有灵敏度高和准确性好的优点，是一个潜在的药物研究检测手段。

说明书

(一)技术领域

本发明涉及一种检测组织或细胞内中期因子(MK)的两步实时荧光定量RT-PCR试剂盒，属于生物技术领域。该试剂盒可以用于直接检测组织或细胞内的中期因子的mRNA含量，从而对中期因子相关疾病，尤其是癌症的诊断起到指导和参考的作用。

(二)背景技术

中期因子(midkine，MK)是一个新发现的促血管生成因子，它是经过研究所选定的靶向序列。MK蛋是一种具有促细胞转化、促有丝分裂作用、促肿瘤血管生成、抗细胞凋亡和增强纤维蛋白溶解等肿瘤形成相关活性的碱性肝素结合性蛋白质。MK基因主要在胚胎期表达，随着发育的进展表达组织逐渐局限，成年期仅在小肠黏膜、甲状腺、肺、肾、脾组织中微量表达，而且(增添)表达量逐渐减少(移动)。研究证实，MK能调节细胞生长、存活和分化，在许多不同类型的肿瘤中表达增强，包括食管癌、胃癌、结直肠癌、胰腺癌、胆囊癌、肺癌、甲状腺、乳腺、膀胱、子宫、卵巢、前列腺和肝癌、神经细胞瘤、恶性胶质瘤，阳性表达率介于45％～90％之间。MK在肿瘤早期、潜伏期和癌前病变阶段也呈高水平表达。最新研究也发现肝细胞癌(Hepatocellular Carcinoma，HCC)高表达MK，可能参与肝内侵袭、转移，并与肝癌的发生、浸润转移，血管生成及预后密切相关。

这表明MK在许多类型的肿瘤发生和生物学行为起重要作用。Friedrich等通过实验证实了MK在肿瘤发生中的作用，在体内MK促进肿瘤细胞的生长，这种生长与肿瘤血管密度的增加有关，同时证实MK有促进肿瘤血管生成的作用。Ruan等研究证实人口腔癌中MK的表达与肿瘤血管生成相关。血管生成是肿瘤生长和转移的基础，肿瘤细胞生长超过2～3mm就需要有新生血管的生成。生理情况下，血管的生成是由内皮细胞生长因子和内皮细胞抑制因子共同调节的，而肿瘤血管的生成正是这种平衡被破坏，内皮细胞刺激因子过度表达或内皮细胞抑制因子的低表达都可以引起肿瘤血管的生成。MK在肿瘤组织中的过度表达促进了肿瘤血管的形成，促进了肿瘤的生长和浸润。

多项有关MK功能的研究证实其参与肿瘤的生长、分化及肿瘤血管生成等过程，表明MK在肿瘤演化过程中可能具有直接作用。由于MK特异表达于多种肿瘤组织，因而MK成为肿瘤治疗的新靶点，如利用MK抗体能抑制肿瘤细胞的生长。一些针对MK的基因治疗也有显著的抗肿瘤作用。根据MK与肝癌相关研究，MK可能是抗血管生成治疗肝癌的理想靶位。

本发明采用实时荧光定量PCR检测组织或细胞中的MK mRNA表达情况，与Western blotting等蛋白水平上的检测方法相比，本发明具有灵敏度高和准确性好的优点，是药物研究领域中的一个强有力的检测手段。

(三)发明内容

本发明的目的旨在提供一种简便和灵敏度较高的用于检测组织或细胞内的中期因子表达量的试剂盒。

本发明采用的技术方案如下：

一种中期因子表达量的实时荧光定量RT-PCR检测试剂盒，主要包括中期因子DNA标准品、特异性引物、PCR缓冲液、脱氧核糖核苷酸混合物(dNTP)、DNA聚合酶和DNA荧光染料，

所述特异性引物序列如下：

上游引物MK up：5’-ctc cgc ggt cgc caa aaa gaa aga-3’；

下游引物MK down：5’-ccc cca tca cac gca ccc cag tt-3’

为达到定量检测的要求，本发明试剂盒中还可包括中期因子DNA标准品，所述中期因子DNA标准品序列如下：

5’- ctccgcggtcgccaaaaagaaagataaggtgaagaagggcggcccggggagcgagtgcgctgagtgggcctgggggccctgcacccccagcagcaaggat tgcggcgtgggtttccgcgagggcacctgcggggcccagacccagcgcatccggtgcagggtgccctgcaactggaagaaggagtttggagccgactgca

所述试剂盒中还可包括内参引物GAPDH作为对照，所述内参基因的引物序列如下：

上游引物GAPDH up：5’-gga gcc aaa agg gtc atc atc t-3’

下游引物GAPDH down：5’-agg ggc cat cca cag tct tct-3’

所述GAPDH基因DNA标准品序列如下：

5’-ggagccaaaagggtcatcatctctgccccctctgctgatgcccccatgttcgtcatgggtgtgaaccatgagaagtatgacaacagcctcaagatcatcagcaatgcctcctgcaccaccaactgcttagcacccctggccaaggtcatccatgacaactttggtatcgtggaaggactcatgaccacagtccatgccatcactgccacccagaagactgtggatggcccct-3’。

本发明在对人中期因子mRNA序列分析和NCBI的blast验证基础上，设计出一对特异性引物，采用Takara PrimeScriprt^TM RT-PCR kit进行检测。本发明关键在于特异性引物的设计，试剂盒中其他组分比如缓冲液、dNTP、DNA聚合酶和DNA荧光染料的选择及其用量，可按本领域常规方法选择。也可采用已将上述辅助组分按比例配制好的试剂盒，比如Takara公司的SYBR Premix Ex TaqTM(Perfect Real Time)试剂盒等。

所述试剂盒应用于实时检测中期因子表达量时，可按本领域常规方法进行，具体的方法如下：

提取样品组织或细胞RNA，进行逆转录，逆转录产物与特异性引物、PCR缓冲液、脱氧核糖核苷酸混合物、DNA聚合酶和DNA荧光染料配成PCR反应体系，进行荧光PCR扩增反应，扩增产物置于定量荧光PCR仪进行荧光检测；根据测得的样品Ct值，获得样品中的中期因子mRNA的相对表达量。

为达到定量检测的要求，所述方法也可包括：配制梯度浓度的中期因子DNA标准品溶液，中期因子DNA标准品溶液、特异性引物、PCR缓冲液、脱氧核糖核苷酸混合物、DNA聚合酶和DNA荧光染料配成PCR反应体系，进行荧光PCR扩增反应，扩增产物置于定量荧光PCR仪进行荧光检测；根据Ct值与DNA标准品溶液浓度对数值关系，绘制标准曲线；根据测得的样品Ct值，对照制标准曲线，获得样品细胞中的中期因子表达量。

所述方法也可同时以内参基因GAPDH的引物和内参基因DNA标准品进行PCR扩增反应，根据获得得出待测样品中期因子的Ct值，与内参基因GAPDH的Ct值相比较，计算出校正后的中期因子mRNA相对数量。

所述PCR反应条件为本领域常规反应条件。所述步骤中，PCR反应条件如下：

95℃，2min；95℃，20s；56℃，20s；72℃，40s

40个循环；

在延伸阶段收集荧光。

本发明具有灵敏度高和准确性好的优点，是一个潜在的药物研究检测手段。使用本发明设计的引物，可对组织或细胞中提取的人中期因子mRNA进行RT-PCR扩增，灵敏度极高地检测到表达的mRNA。

(四)附图说明

图1为内参基因GAPDH实时荧光定量PCR的标准曲线图。

图2为中期因子MK实时荧光定量PCR的标准曲线图。

图3为实时荧光定量PCR扩增对数图。

图4为MK基因表达情况。从左至右依次为：空纳米组，0.1uM MK反义寡核苷酸+纳米组(0.1uM ASON+nano)，0.2uM MK反义寡核苷酸+纳米组(0.2uMASON+nano)，0.4uM MK反义寡核苷酸+纳米组(0.4uM ASON+nano)，0.8uMMK反义寡核苷酸+纳米组(0.8uM ASON+nano)，0.8uM MK反义寡核苷酸+脂质体组(0.8uM ASON+lipo)。

图5为MK基因的抑制情况。从左至右依次为：空纳米组，0.1uM MK反义寡核苷酸+纳米组(0.1uM ASON+nano)，0.2uM MK反义寡核苷酸+纳米组(0.2uMASON+nano)，0.4uM MK反义寡核苷酸+纳米组(0.4uM ASON+nano)，0.8uMMK反义寡核苷酸+纳米组(0.8uM ASON+nano)，0.8uM MK反义寡核苷酸+脂质体组(0.8uM ASON+lipo)。

图6为实时荧光定量PCR产物琼脂糖凝胶电泳图；空纳米组，0.1uM MK反义寡核苷酸+纳米组(0.1uM ASON+nano)，0.2uM MK反义寡核苷酸+纳米组(0.2uM ASON+nano)，0.4uM MK反义寡核苷酸+纳米组(0.4uM ASON+nano)，0.8uM MK反义寡核苷酸+纳米组(0.8uM ASON+nano)，0.8uM MK反义寡核苷酸+脂质体组(0.8uM ASON+lipo)。

(五)具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此：

实施例1：转染细胞中期因子表达量实时荧光检测

1、中期因子(MK)的两步实时荧光定量试剂盒组成：

一对特异性引物和内参引物、Takara SYBR Premix Ex TaqTM(Perfect RealTime)试剂盒、中期因子DNA标准品。

2、中期因子(MK)的特异引物和内参引物

MK up：5’-ctc cgc ggt cgc caa aaa gaa aga-3’和MK down：5’-ccc cca tca cacgca ccc cag tt-3’。

另外，内参引物GAPDH up：5’-gga gcc aaa agg gtc atc atc t-3’GAPDH down：5’-agg ggc cat cca cag tct tct-3’。

两对引物均由Takara公司合成。

3、试验材料和试验仪器

HepG2(肝癌细胞)，ASODN(反义寡核苷酸：5，-CCCCGGGCCGCCCTTCTTCA-3’)和纳米制剂(酰氯胆固醇溶于无水氯仿，滴加N’，N’-二甲基乙二胺，滴加完毕后，减压蒸发，无水乙醇重结晶、洗涤，真空干燥，制得DC-Chol。将10mg的DC-Chol与8mg的DOPE用10ml的无水氯仿溶解，置旋转蒸发仪上于氮气氛围中、40℃减压蒸发去除氯仿，直至形成均匀类脂薄膜，加入5％(w/v)葡萄糖水溶液10mL，水浴超声波处理得到初脂质体混悬液，混悬液通过高压匀质机挤压通过0.1μm的膜，反复6次，得到200nm左右的纳米脂制剂，浓度1.86mM。)均由浙江大学分子医学生物技术实验室提供。1640培养基，10％小牛血清，购自promega。lipofectin2000购自invitrogen。试验仪器是荧光定量PCR仪7300购自ABI；Biorad分光光度计。

4、转染试剂配制

150μM反义寡核苷酸与纳米制剂(1.86mM)体积比为1∶1.8，设置实验组如下：

空白nano组：1.44μL纳米制剂，150μL 1640培养基；

0.1uMASODN+nano组：0.1μLASODN+0.18μL纳米制剂，150μL 1640培养基；

0.2uM ASODN+nano组：0.2μLASODN+0.36μL纳米制剂，150μL 1640培养基；

0.4uMASODN+nano组：0.4μLASODN+0.72μL纳米制剂，150μL 1640培养基；

0.8uMASODN+nano组：0.8μLASODN+1.44μL纳米制剂，150μL 1640培养基；

0.8uM ASODN+lipo组：0.4μLASODN+0.25μL lipofectin2000，150μL 1640培养基；

5、细胞转染及收集

肝癌细胞(HepG2)在37℃，5％CO₂条件下培养至对数生长中期，接种6孔板，每孔细胞数为10⁴个，培养基为2mL，培养24h后，转染，培养4～6h换用含10％小牛血清的1640培养基继续培养24h，收集细胞。

6、RNA抽提

每孔收集的细胞加入1mL Trizol液裂解。室温放置5min，然后以每1mLTrizol液加入0.2mL的比例加入氯仿，盖紧离心管，用手剧烈摇荡离心管15s。室温放置15min，4℃下12000g离心10min。取上层水相于一新的离心管，按每mL Trizol液加0.5ml异丙醇的比例加入异丙醇，室温放置10min，12000g离心10min。弃去上清液，按每mL Trizol液加入至少1mL的比例加入75％乙醇，涡旋混匀，4℃下7500g离心5min。小心弃去上清液，然后室温干燥5～10min。然后将RNA溶于水中。Biorad分光光度计定量RNA浓度。

7、逆转录及实时荧光定量PCR扩增

Biorad分光光度计定量RNA浓度，定量后稀释浓度到250ng/μl，取500ng(2μL)做逆转录。逆转录操作按照Takara PrimeScriprt^TM RT-PCR kit操作手则进行。

a)实时荧光定量PCR

将逆转录产物终体积调整至15μl，取2ul做PCR模板，按照Takara SYBRPremix Ex TaqTM(Perfect Real Time)试剂盒操作手册进行荧光定量PCR。以GAPDH作为内参照基因。PCR条件如下：

95℃，2min；95℃，20s；56℃，20s；72℃，40s。40个循环。

在延伸阶段收集荧光。

另外，内参基因GAPDH和中期因子标准品分别按照Takara SYBR Premix ExTaqTM(Perfect Real Time)试剂盒操作手册进行荧光定量PCR，根据Ct值与DNA标准品溶液浓度对数值关系，绘制标准曲线。内参基因GAPDH实时荧光定量PCR的标准曲线图见图1。中期因子MK实时荧光定量PCR的标准曲线图见图2。图3为中期因子MK标准品实时荧光定量PCR扩增对数图。

b)检测

本发明使用ABI Prism 7300实时荧光定量PCR仪进行检测，图6为实时荧光定量PCR产物琼脂糖凝胶电泳图。

c)结果判断

定性分析荧光强度和转染细胞的中期因子表达量的关系(见图4～图5)，表1为图4的定量分析结果。

表1：定量分析结果

  Group  Y值(MK/GAPDH)  相对表达量  抑制率  Nano-control  0  1  0  Nano-ASODN-0.1uM  -0.2  83％  17％  Nano-ASODN-0.2uM  -0.8  68.5％  31.5％  Nano-ASODN-0.4uM  -0.95  51.2％  48.8％  Nano-ASODN-0.8uM  -1.22  27.7％  72.3％  Lipo-ASODN-0.8uM  -0.94  17％  63％

结果显示：该试剂盒可以灵敏的检测经翻译寡核苷酸抑制后的MK含量，且反义寡核苷酸的浓度越大，MK表达量越低。

SEQUENCE LISTING

<110>湖州市中心医院

<120>中期因子表达量的实时荧光定量RT-PCR检测试剂盒

<130>

<160>6

<170>PatentIn version 3.4

<210>1

<211>24

<212>DNA

<213>Unknown

<220>

<223>人工序列

<400>1

ctccgcggtc gccaaaaaga aaga    24

<210>2

<211>23

<212>DNA

<213>Unknown

<220>

<223>人工序列

<400>2

cccccatcac acgcacccca gtt    23

<210>3

<211>237

<212>DNA

<213>Unknown

<220>

<223>人工序列

<400>3

ctccgcggtc gccaaaaaga aagataaggt gaagaagggc ggcccgggga gcgagtgcgc     60

tgagtgggcc tgggggccct gcacccccag cagcaaggat tgcggcgtgg gtttccgcga    120

gggcacctgc ggggcccaga cccagcgcat ccggtgcagg gtgccctgca actggaagaa    180

ggagtttgga gccgactgca agtacaagtt tgagaactgg ggtgcgtgtg atggggg       237

<210>4

<211>22

<212>DNA

<213>Unknown

<220>

<223>人工序列

<400>4

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<210>5

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<212>DNA

<213>Unknown

<220>

<223>人工序列

<400>5

aggggccatc cacagtcttc t    21

<210>6

<211>232

<212>DNA

<213>Unknown

<220>

<223>人工序列

<400>6

ggagccaaaa gggtcatcat ctctgccccc tctgctgatg cccccatgtt cgtcatgggt     60

gtgaaccatg agaagtatga caacagcctc aagatcatca gcaatgcctc ctgcaccacc    120

aactgcttag cacccctggc caaggtcatc catgacaact ttggtatcgt ggaaggactc    180

atgaccacag tccatgccat cactgccacc cagaagactg tggatggccc ct            232