“禾韵”蓝莓组培种苗快速生根繁育的方法

摘要

本发明公开了一种“禾韵”蓝莓组培种苗快速生根繁育的方法。该方法包括如下步骤：将蓝莓的组培苗蘸生根剂后进行扦插生根培养，得到生根苗。与常规组培育苗方法相比，可以使蓝莓种苗“禾韵1号和2号”新苗成活率由50％上升到90％以上，育苗周期由12个月缩短到6个月，同时新苗质量也有了显著提高。

说明书

技术领域

本发明涉及蓝莓种苗良种快速生根繁育的方法，属于植物的无性繁殖技术领域。

背景技术

蓝莓学名越橘，属于杜鹃花科(Ericaceae)越橘属(Vaccinium spp.)植物，果实甜酸香爽，风味独特，具有丰富的营养价值和多重保健功效，被誉为“黄金浆果”，是联合国粮农组织(FAO)重点推荐的人类五大健康食品之一。蓝莓不仅用于鲜食，而且也开发出多种产品，使其营养价值能够给消费者带来更大的效用。

人工栽培蓝莓最早始于美国，至今已有百年历史。上世纪八十年代起，我国从国外引进了大量的栽培品种，并开始了相关推广工作。但因发展迅速，蓝莓苗木供应极度紧张已成为吉林省乃至全国发展蓝莓产业的技术瓶颈。蓝莓具有耐酸性土壤环境、耐低温、耐瘠薄、较强的抗旱能力和抗病虫害能力；不耐化肥(嫌钙、嫌氯、嫌钠)、除草剂等生物学特征，具备优先发展的独有优势。同时，随着生活和消费水平的提高，人们对食品的安全和品质要求越来越高，蓝莓苗木的市场前景更为广阔。吉林吉康公司认证的“禾韵1号(蓝丰)”蓝莓种苗属高丛、大果型、中晚熟越橘品种；“禾韵2号(埃利奥特)”蓝莓种苗属半高丛、中果型、极晚熟越橘品种，二者抗逆性均很强，适合在我国北方适宜区域进行大面积栽培推广。

当前，利用植物组织培养方法可以在短期内快速繁殖多种植物，不仅繁殖率高，且因为其是无性繁殖，可以保持原繁殖母株的优良性状，近年来在生产上应用越来越广。同时，扦插作为苗木繁育的重要手段，因经济、方便也得到广泛重视。绿枝扦插由于存在插条取材与结果用枝相互竞争的矛盾而不宜在商品果栽培园中推广。

发明内容

本发明的目的在于提供一种蓝莓组培种苗快繁的方法，为蓝莓种苗提供一种操作简单、节省时间、成本低廉、稳定高效的快速繁育方法。

本发明提供的蓝莓组培种苗快繁的方法，其特征在于，包括如下步骤：将蓝莓的组培苗蘸生根剂后进行扦插生根培养，得到生根苗。

上述生根剂是如下a)或b)：

a)萘乙酸与吲哚乙酸组成的溶液：1L所述生根剂的配制方法如下：将1000mg萘乙酸与1000mg吲哚乙酸溶于水中，定容至1L；

b)生根粉ABT配制的溶液：1L所述生根剂的配制方法如下：生根粉ABT 0.05g加5ml酒精溶解后，再加水定溶至1L。该酒精可以是70％(体积百分比)的乙醇水溶液。

上述组培苗蘸生根剂的时间可为3-10秒，优选是5秒。

上述扦插生根培养时组培苗的株距为2-5cm，优选是3cm；行距为3-8cm，优选为5cm；扦插深度为1-1.5cm。

上述扦插生根培养的条件为：温度25-35℃，相对湿度为50-60％，遮阴透光率为45％-65％。

进一步讲，上述方法还包括所述组培苗在蘸生根剂之前的初步炼苗；

所述初步炼苗的时间为7-8天；温度是25-35℃；相对湿度为50％-60％；光照强度为2500-3500LX，优选是3000LX。

更近一步讲，上述方法还包括所述得到生根苗之后的温室炼苗和大田炼苗；所述温室炼苗和大田炼苗包括如下步骤：将所述生根苗在温室大棚炼苗40-60天，温室大棚炼苗的条件是度25～35℃之间，相对湿度以50％-60％为宜，遮阴透光率为45％～65％；然后进行大田炼苗的时间为150-180天。

上述蓝莓的组培苗的获得步骤如下：将蓝莓的外植体置于初代培养基上进行诱导分化培养，得到初代组培苗；所述外植体优选是带腋芽的茎段；

所述初代培养基，是在基本培养液中添加如下物质得到的固体培养基：玉米素、NAA、碳源和凝胶剂；所述初代培养基中玉米素的终浓度是2-5mg/L，NAA的终浓度是0.01-0.12mg/L；所述基本培养液的溶剂是水、溶质如表1所示；光照强度控制在4000～4500LX之间；每天光照培养时间为15h，黑暗培养时间为9h；光照培养时温度控制在20-24℃，黑暗培养时温度控制在16-20℃；湿度控制在60％-75％之间。

上述初代培养基中玉米素和NAA的终浓度为如下1)-3)中任一所述：1)玉米素的终浓度是3-4mg/L，NAA的终浓度是0.05-0.1mg/L；2)玉米素的终浓度是3mg/L或4mg/L，NAA的终浓度是0.05-0.1mg/L；3)玉米素的终浓度是3-4mg/L，NAA的终浓度是0.05mg/L或0.1mg/L。

上述蓝莓的组培苗的获得步骤还可包括继代培养，所述继代培养包括如下步骤：将上述初代组培苗置于继代培养基中进行继代培养，得到所述蓝莓的组培苗；

所述继代培养基是在基本培养液中添加如下物质得到的固体培养基：玉米素、NAA、IBA、碳源和凝胶剂；所述继代培养基中玉米素的终浓度是1.5-4mg/L，NAA的终浓度是0.04-0.1mg/L，IBA的终浓度是0.1-0.5mg/L；所述基本培养液的溶剂是水、溶质如表1所示。继代培养条件：光照强度为2500-3500LX左右；每天光照培养时间为15h，黑暗培养时间为9h；继代光照培养时温度控制在20-24℃，黑暗培养时温度控制在18-22℃；湿度控制在60％-75％之间.

所述继代培养基中玉米素、NAA和IBA的终浓度如1)-3)中任一所述：1)玉米素的终浓度是2-3mg/L，NAA的终浓度是0.06-0.08mg/L，IBA的终浓度是0.2-0.3mg/L；2)玉米素的终浓度是2mg/L，NAA的终浓度是0.08mg/L，IBA的终浓度是0.2mg/L；3)玉米素的终浓度是3mg/L，NAA的终浓度是0.06mg/L，IBA的终浓度是0.3mg/L。

上述初代培养基和所述继代培养基中的凝胶剂均是琼脂、卡拉胶或Gelrite，优选均是琼脂；所述碳源均是葡萄糖、麦芽糖或蔗糖，优选均为蔗糖；所述琼脂在所述初代培养基和所述继代培养基的强度均是1300mg/cm²；所述琼脂在所述初代培养基和所述继代培养基中的终浓度均是4-5g/L，优选为4.5g/L；所述蔗糖在所述初代培养基和所述继代培养基中的终浓度均是25-35g/L，优选均为30g/L。

本发明建立了一种蓝莓种苗快速生根繁育“组培——扦插——炼苗一体化”方法，包括外植体组织培养、组培苗温室扦插炼苗、温室新苗移栽大田炼苗等方法步骤，与常规组培育苗方法相比，可以使蓝莓种苗“禾韵1号和2号”新苗成活率由50％上升到90％以上，育苗周期由12个月缩短到6个月，同时新苗质量也有了显著提高。便于大规模工厂化繁育蓝莓种苗。本技术方案的优点是：“组培——扦插——炼苗一体化“方法在组培过程中不进行生根培育，直接将组培苗蘸生根剂扦插入土进行炼苗，这样平均可节省20～30天时间，缩短了育苗周期，此外，组培苗生根率可达85％以上，生根新苗成活率可达90％以上，而且新苗质量也有了显著提高。本方法具有快速，经济，简洁，高效的优点，大幅度提高了蓝莓种苗的繁殖速度和质量，从而为大规模商品化繁育蓝莓种苗提供保障。本发明提出的组培苗扦插，不仅可以节省育苗时间，而且也避免了绿枝扦插的不足，具有更为突出的优势，便于大规模工厂化繁育蓝莓种苗。

附图说明

图1为组培瓶开盖炼苗照片。

图2为温室苗床铺设照片。

图3为温室扦插组培苗照片。

图4为温室大棚炼苗初期照片。

图5为温室大棚炼苗后期照片。

图6为大田炼苗照片。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明作进一步说明，但本发明并不限于以下实施例。

下述实施例中，如无特殊说明，均为常规方法。

实施例1、

一、禾韵蓝莓种苗的组培繁育

针对“禾韵1号和2号”蓝莓种苗，采用组织培养方法进行快速繁育，本过程只进行外植体的繁育，省去了生根过程。蓝莓组织培养采取腋芽增殖方式。初代接种操作采用试管培养，一个试管接种1个带腋芽的茎段。继代接种操作采用组培瓶培养，每个组培瓶接种15棵。具体组培培养基混合物及操作方法参见专利：禾韵蓝莓种苗组培培养基及其组培方法。具体步骤如下：

(一)、“禾韵1号和2号”初代组培苗的制备及统计观察

1、外植体的获得及其预处理

1)外植体的选取

本实施例中蓝莓组织培养采取腋芽增殖的方式。每年的6至9月份，在“禾韵1号”、“禾韵2号”蓝莓(购自吉林吉康公司)种子资源圃中，挑选无病虫害，树形好，座果性状好，且丰产的蓝莓苗木取外植体。外植体选取当年新发的嫩枝，一个枝条上有6-10个芽。

2)外植体的预处理

将上述步骤1中采剪下来的2个品种的外植体放入盛满清水的烧杯里，滴入4-6滴洗洁剂，用软毛刷轻柔刷洗枝条的腋芽、茎条，然后将外植体的叶片朝下掰掉并放入另一烧杯，用清水冲洗15min，将冲洗干净的外植体及其他接种所需工具放入事先紫外杀菌的超净工作台内，用镊子将外植体夹入已灭菌的广口瓶中进行灭菌处理。

灭菌处理的具体步骤为向上述装入外植体的广口瓶中迅速倒入75％(体积百分比)的酒精，晃洗30秒，再用无菌水晃洗4遍，每遍2min，将杀菌完的外植体用无菌镊子夹入饭盒中，进行剪切操作，将外植体底部发黑茎段剪除，按一芽一段(即带腋芽的茎段)，且芽距下切口较长，距离上切口较短(视外植体叶间距而定)，顶芽可2-3个芽。即得到灭菌处理好的外植体。

2、初代组培苗的获得及统计观察

1)获得初代组培苗

按接种操作规程，将上述步骤一的步骤2中得到灭菌处理好的外植体的外植体接入装有初代培养基的无菌试管内，一个试管接种一个带腋芽的茎段，用双层封口膜封闭，进行诱导分化培养。诱导分化培养的培养条件为：光照强度控制在4000～4500LX之间；每天光照培养时间为15h，黑暗培养时间为9h；光照培养时温度控制在20-24℃，黑暗培养时温度控制在16-20℃；湿度控制在60％-75％之间。同时，可一个星期开紫外灯一次，每次30min，无风的雨天将培养室窗户打开30min换空气。初代培养的培养周期为60天-70天，即培养60天-70天便可获得初代组培苗，得到的初代组培苗可根据所需的组培苗的数量进行下一步的扩增转接。

上述初代培养基是在基本培养液中添加了玉米素(ZT)、NAA、蔗糖和琼脂得到的固体培养基。其中玉米素在初代培养基中的终浓度为3mg/L，NAA的终浓度为0.05mg/L，蔗糖的终浓度为30g/L，琼脂采用强度是1300mg/cm²的琼脂，其琼脂的终浓度为4.5g/L；基本培养液的溶剂是水、溶质如表1所示，培养基的pH为5.2。

表1.基本培养液的溶质

  大量元素  培养基中浓度(mg·L^-1)  NH₄NO₃  400  K₂SO₄  990  MgSO₄·7H₂O  370  KH₂PO₄  170  Ca(NO₃)₂·4H₂O  556  CaCl₂  92  铁盐  培养基中浓度(mg·L^-1)  FeSO₄·7H₂O  27.8  Na₂EDTA  37.3  微量元素  培养基中浓度(mg·L^-1)  MnSO₄·4H₂O  22.4

  ZnSO₄·7H₂O  8.6  H₃BO₃  6.2  Na₂MoO₄·2H₂O  0.25  CuSO₄·5H₂O  0.25  有机成分  培养基中浓度(mg·L^-1)  盐酸硫胺素  1.0  盐酸吡哆醇  0.5  烟酸  0.5  甘氨酸  2.0  肌醇  100

为方便配制培养基，可将表1中的大量元素、微量元素、铁盐、有机物和所需的激素(即玉米素、NAA)配制成高浓度的母液，如浓缩100倍或50倍的母液，实际配制时再取母液按上述终浓度配制。

上述初代培养基的配制方法具体步骤为：

(1)按上述初代培养基中各物质的终浓度的用量取母液，加入所需溶剂的水，用0.1mol/L NaOH或0.1mol/L HCl，通过pH计对配制好的培养基进行酸度调节，使其pH值在5.2-5.3范围内。

(2)按上述初代培养基蔗糖的的终浓度的用量称取蔗糖加入熬制锅中开始加热，至培养基即将沸腾时，称取所需用量的琼脂粉加入锅中，并迅速用玻璃棒不断搅拌，煮沸1-2min以后，停止加热，待培养基温度降至45℃左右时补齐至1000ml，重新加热并搅拌，至50℃左右停止，在培养基尚未凝固时，趁热分装到所选用的培养容器中，可用18mm×180mm的培养试管，每管分装培养基12ml，封口，121℃灭菌15min，使培养基在室温下冷却，即得到配制好的初代培养基。

2)统计观察

上述步骤2的步骤1)中接种的蓝莓带腋芽的茎段培养55-65天，可以观察到诱导分化出的蓝莓嫩芽，实验重复3次，培养60天时进行统计观察上述步骤1)中腋芽的诱导情况，“禾韵1号”、“禾韵2号”芽的诱导率均可达到90％以上。

(二)、继代培养苗的制备及统计观察

1、继代培养苗的获得

选取无污染，长势好的可用于转接的上述步骤(一)中得到的初代组培苗或继代苗(即经过继代培养的继代培养苗)，按继代接种操作规程，夹至含滤纸的灭菌盒中，加灭菌水浸润滤纸以防失水，将种苗剪成1芽1段，转接到继代增殖培养基上，每组培瓶接种15棵，封口后移至组培室培养，污染率控制在1％以内。转接到继代增殖培养基的组培苗置于光照强度为3000LX左右；每天光照培养时间为15h，黑暗培养时间为9h；继代光照培养时温度控制在20-24℃，黑暗培养时温度控制在18-22℃；湿度控制在60％-75％之间。同时，一个星期开紫外灯一次，每次30min，无风的雨天将培养室窗户打开30min换空气。继代培养周期为60天左右便可转接。继代的次数根据所需的扩繁量而定。

上述继代培养基是在基本培养液中添加了玉米素、NAA、IBA、蔗糖和琼脂得到的固体培养基。其中玉米素在继代培养基中的终浓度为2mg/L，NAA的终浓度是0.08mg/L，IBA的终浓度是0.2mg/L，蔗糖的终浓度为30g/L，琼脂采用强度是1300mg/cm²的琼脂，其琼脂的终浓度为4.5g/L；基本培养液的溶剂是水、溶质如表1所示，培养基的pH为5.2。上述基本培养液的溶剂是水、溶质如表1所示，培养基的pH为5.2。

2、统计观察

上述步骤二的步骤1中接种的初代组培苗或继代苗培养55-65天，可以观察到诱导分化出的蓝莓嫩芽，实验重复3次，培养60天时进行统计观察上述步骤1中初代组培苗或继代苗的诱导情况，“禾韵1号”、“禾韵2号”继代培养的增殖系数均可达4。

二、禾韵蓝莓组培苗温室扦插炼苗

具体步骤如下：

(1)在上述2个品种的组培新苗下架之后，移至温室大棚中打开组培瓶盖炼苗7天(图1)，保持温度25～35℃，相对湿度50％～60％，光照强度3000LX左右。

(2)铺设苗床，底层先铺烂树皮或松针5cm(1.1m宽×50m长)，再铺一层苔藓(分成垄)，整个苗床约10cm厚，2cm宽，间隔5cm，床高4cm(图2)；

(3)准备扦插组培苗，用镊子将(1)中的炼苗后的蓝莓种苗夹出，用清水洗净附带的培养基，用剪刀去掉底部的黑色愈伤组织；

(4)将扦插苗在a)生根剂(将1000mg萘乙酸与1000mg吲哚乙酸溶于水中，定容至1L得到的溶液)或b)生根剂(生根粉ABT 0.05g先溶于5ml酒精中，再加水定容至1L得到的溶液)中蘸5s，按照株距3cm×行距5cm插在苗床上，深度插入1～1.5cm，每垄扦插组培苗约34株；

(5)用塑料布将棚盖好，一般跨整个苗床，高0.6m，并加盖一层黑色遮阳网(图3)。保持棚内温度25～35℃之间，相对湿度以50％-60％为宜，遮阴透光率为45％～65％；

(6)适时观察并进行表2的统计，挑除死苗、弱苗，选留健壮、虫害少的种苗，如图4、5所示，温室大棚炼苗40～60天(适时掀开遮阳网及塑料布)，温室大棚炼苗的温度、湿度与(5)中的一致。

表2.用a)生根剂后统计生根苗成活率

用b)生根剂的统计数据和a)生根剂的统计数据无显著性差异。

(7)越冬，第2年开春后，5月上旬将温室种苗移栽大田，进行大田炼苗过程。温室炼苗一般在每年5～9月份进行，10月份基本停止。

三、禾韵蓝莓新苗大田移栽炼苗(照片如图6所示)

具体步骤如下：

(1)改穴

每年秋天进行改穴，一般挖35cm×35cm×35cm的土穴，苗床70cm，作业道80cm，土穴体积的2/3先填充混合土(三皮土∶草炭＝2∶1)，另外1/3体积填充有机肥(草炭∶鸡粪或猪粪2∶1)，混匀形成穴改土，调整土壤pH值在4.5～5.5，有机质含量8～10％。采用黑塑料布进行地膜覆盖(地膜作用：保温、除草、保水)越冬。

(2)种苗移栽

第二年4月下旬至5月上旬，选取长势好、无病虫害的温室扦插苗进行种苗定植，定植深度根据不同品种而异，一般7～8cm，深的可达10～15cm，定植后浇一遍水(一般7天浇一遍水)，5月中下旬追一次有机肥，当年7月初追施豆饼发酵的乳肥。在大田炼苗中，要注意水肥管理，随时剔除病弱苗，并控制杂草生长。

(3)出苗

每年10月份左右，大田炼苗的蓝莓种苗即可移栽至小花盆，进行商品化出售。