通过组织培养获得黄花苜蓿再生植株的方法及其培养基

摘要

本发明公开了通过组织培养获得黄花苜蓿再生植株的方法及其培养基。本发明所提供的获得黄花苜蓿愈伤组织的培养基，由下述质量份的营养成分组成：大量元素以硝酸钾计2830份、微量元素以硫酸锰计1份、铁盐以乙二胺四乙酸钠计6.97份、有机成分以尼克酸计10份、肌醇100份、2，4-二氯苯氧乙酸1份-2份、N6-呋喃甲基腺嘌呤1份-2份。本发明为黄花苜蓿育种提供了一种方便、快捷和有效的方法，具有一定的社会效益和经济效益，对我国草业的可持续发展有一定的贡献。

说明书

技术领域

本发明涉及通过组织培养获得黄花苜蓿再生植株的方法及其培养基。

背景技术

黄花苜蓿(Medicago falcata L.)是豆科苜蓿属中很重要的多年生野生豆科牧草，主要分布在中国、蒙古、俄罗斯、巴基斯坦、印度、土耳其等国家。我国的黄花苜蓿品种资源丰富，主要分布在我国的东北、华北、西北地区。与其它种比较，黄花苜蓿具有抗逆性强、耐寒、耐旱、耐瘠薄和寿命长等突出特点，适宜在干旱、寒冷的地区种植，是我国北方建设高产优质人工草地的首选。

黄花苜蓿的倍型多见二倍体(2n＝2x＝16)和四倍体(2n＝4x＝32)2个染色体倍性水平。一般来说，四倍体和二倍体相比，具有植株高大，生长繁茂，叶片增大等特征。倍性影响着植物内部基因的表达和调控，进而影响到植物的形态和功能。

多年以来黄花苜蓿的组培十分困难，导致黄花苜蓿的分子生物学和遗传学改良工作停滞不前。生物育种的关键是建立一个高效的组织培养再生体系，以提供改良目标的基因受体系统和遗传转化后受体细胞的培养系统。

黄花苜蓿的组培开始研究较早，1985年Daniel Brown和Atanas Atanassov年试验了67种苜蓿的子叶和下胚轴，用三步法做组织培养，选出一些具有高再生能力的品种。Tony H.H.Chen于1987年试验了17种黄花苜蓿，说明叶片也和子叶下胚轴一样有能力形成愈伤组织。Gilmour于1987年用黄花苜蓿的原生质体培养进行了组培再生体系。国内马海燕于2005年用新疆野生黄花苜蓿的下胚轴进行培养，但是分化率较低(20-30％)。

发明内容

本发明的一个目的是提供一种获得黄花苜蓿愈伤组织的培养基。

本发明所提供的获得黄花苜蓿愈伤组织的培养基，由下述质量份的营养成分组成：

大量元素以硝酸钾计2830份、微量元素以硫酸锰计1份、铁盐以乙二胺四乙酸钠计6.97份、有机成分以尼克酸计10份、肌醇100份、2，4-二氯苯氧乙酸1份-2份或1份或2份、N6-呋喃甲基腺嘌呤1份-2份或1份或2份；

所述大量元素由下述质量份的物质组成：

硝酸钾2830份、硫酸铵463份、磷酸二氢钾400份、七水硫酸镁185份和二水氯化钙166份；

所述微量元素由下述质量份的物质组成：

硫酸锰1份、硼酸0.5份、七水硫酸锌0.1份、碘化钾0.1份、二水钼酸钠0.01份、五水硫酸铜0.02份和六水氯化钴0.01份；

所述铁盐由下述质量份的物质组成：

乙二胺四乙酸钠6.97份；

所述有机成分由下述质量份的物质组成：

尼克酸10份、盐酸硫胺素10份和盐酸吡哆醇10份。

所述培养基由所述营养成分和水组成；

所述营养成分中所述大量元素、微量元素、铁盐、有机成分、肌醇、2，4-二氯苯氧乙酸和N6-呋喃甲基腺嘌呤均独立包装。

所述培养基由以下成分组成：

硝酸钾、硫酸铵、磷酸二氢钾、七水硫酸镁、二水氯化钙、硫酸锰、硼酸、七水硫酸锌、碘化钾、二水钼酸钠、五水硫酸铜、六水氯化钴、乙二胺四乙酸钠、尼克酸、盐酸硫胺素、盐酸吡哆醇、肌醇、2，4-二氯苯氧乙酸和N6-呋喃甲基腺嘌呤和水；

以上成分在所述培养基中浓度分别为：

硝酸钾2.830g/L、硫酸铵0.463g/L、磷酸二氢钾0.400g/L、七水硫酸镁0.185g/L、二水氯化钙0.166g/L、硫酸锰1mg/L、硼酸0.5mg/L、七水硫酸锌0.1mg/L、碘化钾0.1mg/L、二水钼酸钠0.01mg/L、五水硫酸铜0.02mg/L、六水氯化钴0.01mg/L、乙二胺四乙酸钠6.97mg/L、尼克酸10mg/L、盐酸硫胺素10mg/L、盐酸吡哆醇10mg/L、肌醇100mg/L、2，4-二氯苯氧乙酸1mg/L-2mg/L和N6-呋喃甲基腺嘌呤1mg/L-2mg/L，其余为水。

本发明的另一个目的是提供一种获得黄花苜蓿愈伤组织的固体培养基，由凝固剂和上述获得黄花苜蓿愈伤组织的培养基配成固体培养基。

所述凝固剂的用量使上述获得黄花苜蓿愈伤组织的培养基形成固体即可；

所述凝固剂在所述固体培养基中的浓度为8g/L；

所述凝固剂为琼脂。

所述固体培养基为如下1)或2)所示：

1)所述固体培养基中2，4-二氯苯氧乙酸的浓度为2mg/L和N6-呋喃甲基腺嘌呤的浓度为1mg/L；

2)所述固体培养基中2，4-二氯苯氧乙酸的浓度为1mg/L和N6-呋喃甲基腺嘌呤的浓度为2mg/L。

所述培养基的pH值为5.8；

所述黄花苜蓿为四倍体黄花苜蓿或二倍体黄花苜蓿。

本发明的又一个目的是提供一种获得黄花苜蓿愈伤组织的方法。

本发明所提供的获得黄花苜蓿愈伤组织的方法，包括如下步骤：用上述1)所示的培养基诱导培养黄花苜蓿外植体，得到黄花苜蓿愈伤组织。

所述方法还包括用上述2)所示的培养基增殖培养黄花苜蓿愈伤组织的步骤；

所述黄花苜蓿外植体为切成块的幼嫩叶片；

所述黄花苜蓿为四倍体黄花苜蓿或二倍体黄花苜蓿。

本发明的又一个目的是提供一种获得黄花苜蓿再生植株的方法。

本发明所提供的获得黄花苜蓿再生植株的方法，包括以下步骤：将上述方法得到的黄花苜蓿愈伤组织接种到分化培养基上进行分化培养得到芽，即得到黄花苜蓿再生植株。

所述分化培养基由以下成分组成：

硝酸钾、硫酸铵、磷酸二氢钾、七水硫酸镁、二水氯化钙、硫酸锰、硼酸、七水硫酸锌、碘化钾、二水钼酸钠、五水硫酸铜、六水氯化钴、乙二胺四乙酸钠、尼克酸、盐酸硫胺素、盐酸吡哆醇、肌醇、N6-呋喃甲基腺嘌呤和水；

以上成分在所述分化培养基中浓度分别为：

硝酸钾2.830g/L、硫酸铵0.463g/L、磷酸二氢钾0.400g/L、七水硫酸镁0.185g/L、二水氯化钙0.166g/L、硫酸锰1mg/L、硼酸0.5mg/L、七水硫酸锌0.1mg/L、碘化钾0.1mg/L、二水钼酸钠0.01mg/L、五水硫酸铜0.02mg/L、六水氯化钴0.01mg/L、乙二胺四乙酸钠6.97mg/L、尼克酸10mg/L、盐酸硫胺素10mg/L、盐酸吡哆醇10mg/L、肌醇100mg/L和N6-呋喃甲基腺嘌呤0.4mg/L，其余为水。

所述分化培养基的pH值为5.8；

所述方法在所述分化培养之后，还包括将得到的芽接种到生根培养基上进行培养的步骤；

所述生根培养基由以下成分组成：

硝酸钾、硫酸铵、磷酸二氢钾、七水硫酸镁、二水氯化钙、硫酸锰、硼酸、七水硫酸锌、碘化钾、二水钼酸钠、五水硫酸铜、六水氯化钴、乙二胺四乙酸钠、尼克酸、盐酸硫胺素、盐酸吡哆醇和水；

以上成分在所述生根培养基中浓度分别为：

硝酸钾1.415g/L、硫酸铵0.2315g/L、磷酸二氢钾0.200g/L、七水硫酸镁0.0925g/L、二水氯化钙0.083g/L、硫酸锰1mg/L、硼酸0.5mg/L、七水硫酸锌0.1mg/L、碘化钾0.1mg/L、二水钼酸钠0.01mg/L、五水硫酸铜0.02mg/L、六水氯化钴0.01mg/L、乙二胺四乙酸钠6.97mg/L、尼克酸10mg/L、盐酸硫胺素10mg/L、盐酸吡哆醇10mg/L，其余为水。

所述生根培养基的pH值为5.8；

所述黄花苜蓿外植体为切成块的幼嫩叶片；

所述黄花苜蓿为四倍体黄花苜蓿或二倍体黄花苜蓿。

本发明是从一批来自于新疆的四倍体黄花苜蓿和来自于俄罗斯的二倍体黄花苜蓿中进行组织培养实验，从中筛选出最高效的组培品种，以及建立起一套高效的再生体系，愈伤组织诱导率达到90％以上，分化率达到60％-70％，成苗率达到40％-50％，完成全部再生体系仅需10周左右，随后可以利用转基因等生物技术高效、快速地对作物品种和性状进行遗传改良。由于我国的黄花苜蓿主要生长在内蒙古和新疆，这些地方比较干旱寒冷，对黄花苜蓿进行抗寒抗旱的改良十分必要，本发明为黄花苜蓿育种提供了一种方便、快捷和有效的方法，具有一定的社会效益和经济效益，对我国草业的可持续发展有一定的贡献。

附图说明

图1为愈伤组织在诱导培养基上的生长状态。

图2为愈伤组织在增殖培养基中形成体细胞胚并有芽生成。

图3为愈伤组织在分化培养基上再生芽继续生长并有根生成。

图4为在生根培养基中，胚性愈伤组织长成再生苗。

图5为黄花苜蓿再生苗移到花盆中生长。

具体实施方式

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

无机盐购自国药集团化学试剂有限公司和北京化学试剂公司；2，4-二氯苯氧乙酸(2，4-D)、N6-呋喃甲基腺嘌呤(KT)和维生素购自SIGMA公司；肌醇购自国药集团化学试剂有限公司；蔗糖购自北京北化精细化学品有限责任公司，琼脂购自北京振泰科技创新发展中心。

实施例1、通过组织培养获得四倍体黄花苜蓿再生植株

本实验新疆四倍体野生黄花苜蓿(公众可从中国农业大学获得，记载过该材料的非专利文献是：王红梅，王俊杰等，二倍体和四倍体野生黄花苜蓿形态特征比较研究，草地学报，Vol.17 No.4，Jul 2009)为材料，采自新疆伊犁地区。

实验步骤如下：

1、种子处理和无菌苗的培育

选取籽粒饱满的新疆野生黄花苜蓿种子80粒，用浓硫酸处理8分钟左右，待种皮上有黑点出现，吸出浓硫酸用无菌水洗5遍。然后在超净台中用5％次氯酸钠水溶液中浸泡15分钟，再用无菌水洗5遍；然后将其接种于在1/2 MS培养基上(超净台内操作)。置于组培室中，培养条件为：培养温度是室温(25℃)；光周期是光照16小时/黑暗8小时，光照强度为5000Lux。

2、外植体的选择

选取3周左右的黄花苜蓿无菌苗的幼嫩叶片作为外植体。

3、愈伤组织的诱导和保持

在超净台中，将作为外植体的黄花苜蓿无菌苗的幼嫩叶片用灭过菌的刀片切成约3mm²的小块，接种到愈伤诱导培养基上进行培养。约两周愈伤生成(图1)，将愈伤组织转接到愈伤增殖培养基上进行培养。愈伤诱导培养基和愈伤增殖培养基都在灭菌前将pH调到5.8，灭菌条件是121℃下20分钟。培养条件和步骤1相同。

实验设三次重复，结果取平均值，每个重复设50个外植体。

愈伤组织诱导率(％)＝实际形成愈伤组织数/接种外植体数×100％。

结果：愈伤组织诱导率为90.7％。

愈伤诱导培养基由以下成分组成：

硝酸钾、硫酸铵、磷酸二氢钾、七水硫酸镁、二水氯化钙、硫酸锰、硼酸、七水硫酸锌、碘化钾、二水钼酸钠、五水硫酸铜、六水氯化钴、乙二胺四乙酸钠、尼克酸、盐酸硫胺素、盐酸吡哆醇、肌醇、2，4-二氯苯氧乙酸和N6-呋喃甲基腺嘌呤和水；

以上成分在所述愈伤诱导培养基中浓度分别为：

硝酸钾2.830g/L、硫酸铵0.463g/L、磷酸二氢钾0.400g/L、七水硫酸镁0.185g/L、二水氯化钙0.166g/L、硫酸锰1mg/L、硼酸0.5mg/L、七水硫酸锌0.1mg/L、碘化钾0.1mg/L、二水钼酸钠：0.01mg/L、五水硫酸铜0.02mg/L、六水氯化钴0.01mg/L、乙二胺四乙酸钠6.97mg/L、尼克酸10mg/L、盐酸硫胺素10mg/L、盐酸吡哆醇10mg/L、肌醇100mg/L、2，4-二氯苯氧乙酸2mg/L和N6-呋喃甲基腺嘌呤1mg/L，其余为水。

愈伤诱导培养基的pH值为5.8。

愈伤增殖培养基由以下成分组成：

硝酸钾、硫酸铵、磷酸二氢钾、七水硫酸镁、二水氯化钙、硫酸锰、硼酸、七水硫酸锌、碘化钾、二水钼酸钠、五水硫酸铜、六水氯化钴、乙二胺四乙酸钠、尼克酸、盐酸硫胺素、盐酸吡哆醇、肌醇、2，4-二氯苯氧乙酸和N6-呋喃甲基腺嘌呤和水；

以上成分在所述愈伤增殖培养基中浓度分别为：

硝酸钾2.830g/L、硫酸铵0.463g/L、磷酸二氢钾0.400g/L、七水硫酸镁0.185g/L、二水氯化钙0.166g/L、硫酸锰1mg/L、硼酸0.5mg/L、七水硫酸锌0.1mg/L、碘化钾0.1mg/L、二水钼酸钠：0.01mg/L、五水硫酸铜0.02mg/L、六水氯化钴0.01mg/L、乙二胺四乙酸钠6.97mg/L、尼克酸10mg/L、盐酸硫胺素10mg/L、盐酸吡哆醇10mg/L、肌醇100mg/L、2，4-二氯苯氧乙酸1mg/L和N6-呋喃甲基腺嘌呤2mg/L，其余为水。

愈伤增殖培养基的pH值为5.8。

4、体细胞胚的诱导和分化

经过一次继代培养，再经过3周的生长，有些愈伤出现胚性愈伤(图2)；将出现胚性愈伤的愈伤组织分成3mm²的小块，转接到分化培养基上进行诱导，培养条件与上述步骤1相同；约20天后，体细胞胚分化出芽和根(图3)。

实验设三次重复，结果取平均值，每个重复设30个胚性愈伤。

愈伤组织分化率(％)＝分化成芽的愈伤组织/接种愈伤组织数×100％。

结果：愈伤组织分化率为68.9％。

分化培养基由以下成分组成：

硝酸钾、硫酸铵、磷酸二氢钾、七水硫酸镁、二水氯化钙、硫酸锰、硼酸、七水硫酸锌、碘化钾、二水钼酸钠、五水硫酸铜、六水氯化钴、乙二胺四乙酸钠、尼克酸、盐酸硫胺素、盐酸吡哆醇、肌醇、N6-呋喃甲基腺嘌呤和水；

以上成分在所述分化培养基中浓度分别为：

硝酸钾2.830g/L、硫酸铵0.463g/L、磷酸二氢钾0.400g/L、七水硫酸镁0.185g/L、二水氯化钙0.166g/L、硫酸锰1mg/L、硼酸0.5mg/L、七水硫酸锌0.1mg/L、碘化钾0.1mg/L、二水钼酸钠：0.01mg/L、五水硫酸铜0.02mg/L、六水氯化钴0.01mg/L、乙二胺四乙酸钠6.97mg/L、尼克酸10mg/L、盐酸硫胺素10mg/L、盐酸吡哆醇10mg/L、肌醇100mg/L和N6-呋喃甲基腺嘌呤0.4mg/L，其余为水；

所述分化培养基的pH值为5.8。

5、再生芽的生根和移栽

黄花苜蓿再生芽在分化的同时一般都有根的形成。当根长到约1cm时将其转到生根培养基(即1/2 SH培养基)上培养到根长到约5cm，此时可进行再生苗(图4)的移栽。再生苗移栽的方法为：将蒸馏水加到刚没过培养基，封口膜半开口置于组培室条件(即培养温度是室温(25℃)；光周期是光照16小时/黑暗8小时；培养物表面的光照强度为5000Lux)3天，然后全开封口膜放置3天，再小心地在水龙头下将培养基冲洗干净，然后将再生苗移栽到花盆中在同样条件下培养(图5)，完成整个黄花苜蓿再生的过程。

实验设三次重复，结果取平均值，每个重复设50个再生芽。

成苗率(％)＝长成再生苗的芽/接种的再生芽数×100％。

结果：成苗率为46.7％。

所述生根培养基由以下成分组成：

硝酸钾、硫酸铵、磷酸二氢钾、七水硫酸镁、二水氯化钙、硫酸锰、硼酸、七水硫酸锌、碘化钾、二水钼酸钠、五水硫酸铜、六水氯化钴、乙二胺四乙酸钠、尼克酸、盐酸硫胺素、盐酸吡哆醇；

以上成分在所述生根培养基中浓度分别为：

硝酸钾1.415g/L、硫酸铵0.2315g/L、磷酸二氢钾0.200g/L、七水硫酸镁0.0925g/L、二水氯化钙0.083g/L、硫酸锰1mg/L、硼酸0.5mg/L、七水硫酸锌0.1mg/L、碘化钾0.1mg/L、二水钼酸钠：0.01mg/L、五水硫酸铜0.02mg/L、六水氯化钴0.01mg/L、乙二胺四乙酸钠6.97mg/L、尼克酸10mg/L、盐酸硫胺素10mg/L、盐酸吡哆醇10mg/L，其余为水。

所述生根培养基的pH值为5.8。

实施例2、通过组织培养获得二倍体俄罗斯黄花苜蓿再生植株

二倍体俄罗斯黄花苜蓿PI502449来源于美国USDA-ARS Plant GermplasmQuarantine Center。

1、种子处理和无菌苗的培育

选取籽粒饱满的俄罗斯黄花苜蓿PI502449种子80粒，用浓硫酸处理8分钟左右，待种皮上有黑点出现，吸出浓硫酸用无菌水洗5遍。然后在超净台中用5％次氯酸钠水溶液中浸泡15分钟，再用无菌水洗5遍；然后将其接种于在1/2 MS培养基上(超净台内操作)。置于组培室中，培养条件为：培养温度是室温(25℃)；光周期是光照16小时/黑暗8小时，光照强度为5000Lux。

2、外植体的选择

选取3周左右的黄花苜蓿无菌苗的幼嫩叶片作为外植体。

3、愈伤组织的诱导和保持

在超净台中，将作为外植体的黄花苜蓿无菌苗的幼嫩叶片用灭过菌的刀片切成约3mm2的小块，接种到愈伤诱导培养基上进行培养。约两周愈伤生成，将愈伤组织转接到愈伤增殖培养基上进行培养。愈伤诱导培养基和愈伤增殖培养基都在灭菌前将pH调到5.8，灭菌条件是121℃下20分钟。培养条件和步骤1相同。

实验设三次重复，结果取平均值，每个重复设50个外植体。

愈伤组织诱导率(％)＝实际形成愈伤组织数/接种外植体数×100％。

结果：愈伤组织诱导率为89.3％。

愈伤诱导培养基的组成及各成分的浓度与实施例1中相同；愈伤诱导培养基的pH值与实施例1中相同。

愈伤增殖培养基的组成及各成分的浓度与实施例1中相同；愈伤增殖培养基的pH值与实施例1中相同。

4、体细胞胚的诱导和分化

经过一次继代培养，再经过3周的生长，有些愈伤出现胚性愈伤；将出现胚性愈伤的愈伤组织分成3mm²的小块，转接到分化培养基上进行诱导，培养条件与上述步骤2相同；约20天后，体细胞胚分化出芽和根。

实验设三次重复，结果取平均值，每个重复设50个胚性愈伤。

愈伤组织分化率(％)＝分化成芽的愈伤组织/接种愈伤组织数×100％。

结果：愈伤组织分化率为37.8％。

分化培养基的组成及各成分的浓度与实施例1中相同；分化培养基的pH值与实施例1中相同。

5、再生芽的生根和移栽

黄花苜蓿再生芽在分化的同时一般都有根的形成。当根长到约1cm时将其转到生根培养基(即1/2 SH培养基)上培养到根长到约5cm，此时可进行再生苗的移栽。再生苗移栽的方法为：与实施例1中相同。

实验设三次重复，结果取平均值，每个重复设30个再生芽。

成苗率(％)＝长成再生苗的芽/接种的再生芽数×100％。

结果：成苗率为21.1％。

生根培养基的组成及各成分的浓度与实施例1中相同；生根培养基的pH值与实施例1中相同。