一种利用LAMP快速检测中国番木瓜曲叶病毒的方法

摘要

本发明提供了一种快速检测中国番木瓜曲叶病毒的方法，属植物保护领域。根据中国番木瓜曲叶病毒核苷酸序列设计LAMP引物(P_F3，P_B3，P_FIP，P_BIP)。样品提取总DNA后，进行LAMP反应，反应产物经电泳或者荧光染料的方法实现中国番木瓜曲叶病毒的检测。该方法操作简单，无需PCR仪等特殊仪器，同时又克服克服了传统的生物学、血清学等方法上存在的问题，是一种简捷、快速、灵敏而经济的检测方法。

说明书

技术领域

本发明涉及一种快速检测中国番木瓜曲叶病毒的方法，属植物保护领域。

背景技术

中国番木瓜曲叶病毒(Papaya leaf curl china virus，PaLCCNV)是一种重要的植物病毒，属于双生病毒科菜豆金色花叶病毒属，传播介体为烟粉虱。该病毒最早是在我国广西的番木瓜上检测到的，所以称为中国番木瓜曲叶病毒，除危害番木瓜外，该病毒也危害番茄等作物，主要表现叶片变小，上卷，叶缘及叶脉之间黄化，植株矮化等症状，对番茄的产量和质量影响严重。2007年该病在河南番茄上大面积发生危害，仅开封市开封县就有2000个日光温室受到毁灭性的危害，直接经济损失近2000万元。2009年在江苏等地作物上也有检测到，显示该病毒也有蔓延扩散的迹象，是一个潜在的威胁。

环介导恒温核酸扩增技术(loop-mediated isothermal amplification，LAMP)最早是由Notomi T等在2000年发明的，是一种基于高灵敏链置换技术的恒温核酸扩增方法，其工作原理为：针对靶基因的6个区域设计了4个特异引物，利用一种链置换DNA聚合酶——Bst(Bacillus stearothermophilus)DNA polymerase在恒温(65℃)的条件下反应1小时即可完成核酸扩增反应，反应产物既可通过电泳紫外观察，亦可通过荧光染色直接目测。该方法操作简便，无需特殊仪器(PCR仪)，而检测结果准确，是一种快捷而有效的检测方法。目前已广泛应用于人类和动植物各种病毒、细菌、寄生虫等引起的疾病检测和快速诊断。

目前在中国番术瓜曲叶病毒的检测上，较常用的方法有两种，一种是分子生物学检测方法，其中以PCR最为常见，但是PCR需要30-35个循环反应(较费时)及特殊的仪器(PCR仪)；另一种是血清学检测方法，常见的有ELISA及DIBA等，血清学检测方法除了在灵敏度上存在不足外，其检测的特异性也受到限制(菜豆金色花叶病毒属成员间的核苷酸同源性相对较高)。而LAMP方法很好的克服了当前这两类方法的不足(反应时间短，无需特殊仪器，检测灵敏度高，特异性好)，目前尚未见到使用该方法检测中国番木瓜曲叶病毒的方法。LAMP方法既保证了检测的灵敏性和特异性，同时又简化了操作，节省了成本，为今后该病害的调查提供了一种简单而有效的方法。

发明内容

本发明克服了现有技术中的缺点，为中国番木瓜曲叶病毒的检测提供了一种快速、简便、灵敏的方法。

1、引物设计：

根据NCBI上已报道的中国番木瓜曲叶病毒核酸序列设计引物，引物序列如下：

P-F3：5`-CAAACTTCCCTATGCAATCG-3`

P-B3：5`-GATTTGAATTAAATAGGCTTTGAGG-3`

P-FIP：5`GCCGCTTTTGGATTTTGAATTTTGA-ATGGGTCCTTATTTATATGTGAG-3`

P-BIP：5`-TCCGTATAATATTACCGGATGGCC-GTTTTAAATGGAGGACATTTCTTTG-3`

2、总DNA提取：

取10mg番茄病叶于1.5mL离心管，加100μL 0.5mol/LNaOH，匀浆后5000rpm离心5min，上清液用0.1mol/L Tris-HCl(pH8.0)稀释100倍，取1μL作为模板进行PCR扩增。

3、PCR扩增：

反应体系：总体系为25μL，其中DNA 2μL，Bst DNA聚合酶(8U/μL)1μL，其它组分终浓度分别为P-F3和P-B30.2μmol/L；P-FIP和P-BIP 1.6μmol/L；Betaine 0.8mol/L；dNTPs 1.4mmol/L，1倍的Thermopolbuffer(含MgSO42mmol/L)；MgCl₂8mmol/L。

反应条件：65℃恒温水浴锅60min；80℃5min。

4、检测：

电泳检测：取10μL产物经1％琼脂糖凝胶在0.5×TBE缓冲液和120V电压条件下电泳40min，在0.5μg/mL的溴化乙锭(EB)中染色10min，染色后于凝胶成像系统中观察，在感染中国番木瓜曲叶病毒的样品中可以观察到明亮的呈弥散状的核酸泳带。

荧光染料：LAMP反应结束后，向其产物中加入SYBR Greenl(1∶1000)2μl，1-5min后察结果，感染中国番木瓜曲叶病毒的样品变成绿色，而未感染样品及空白对照保持染料的橙色。

其中所述的65℃的反应温度，也可以是63-65℃

本发明的有益效果是根据中国番木瓜曲叶病毒核苷酸序列设计LAMP引物，通过摸索优化条件实现了该病毒的快速检测，为该病害的调查提供了一种简便有效的方法。

附图说明

附图1是电泳检测中国番木瓜曲叶病毒的结果(M：标准分子量；1：阴性对照；2：中国番木瓜曲叶病毒)，附图2是荧光染色检测中国番木瓜曲叶病毒的结果(CK：阴性对照；2：中国番木瓜曲叶病毒)

具体实施方式

实例一：

以感染中国番木瓜曲叶病毒的番茄样品为检测对象，以健康番茄样品为阴性对照。

1、引物设计：

根据NCBI上已报道的中国番木瓜曲叶病毒核酸序列设计引物，引物序列如下：

P-F3：5`-CAAACTTCCCTATGCAATCG-3`

P-B3：5`-GATTTGAATTAAATAGGCTTTGAGG-3`

P-FIP：5`-GCCGCTTTTGGATTTTGAATTTTGA-ATGGGTCCTTATTTATATGTGAG-3`

P-BIP：5`TCCGTATAATATTACCGGATGGCC-GTTTTAAATGGAGGACATTTCTTTG-3`

2、总DNA提取：

取10mg番茄病叶于1.5mL离心管，加100μL 0.5mol/LNaOH，匀浆后5000rpm离心5min，上清液用0.1mol/LTris-HCl(pH8.0)稀释100倍，取1μL作为模板进行PCR扩增。

3、PCR扩增：

反应体系：总体系为25μL，其中DNA 2μL，Bst DNA聚合酶(8U/μL)1μL，其它组分终浓度分别为P-F3和P-B30.2μmol/L；P-FIP和P-BIP 1.6μmol/L；Betaine 0.8mol/L；dNTPs 1.4mmol/L，1倍的Thermopolbuffer(含MgSO42mmol/L)；MgCl₂8mmol/L。

反应条件：65℃恒温水浴锅60min；80℃5min。

4、检测：

电泳检测：取10μL产物经1％琼脂糖凝胶在0.5×TBE缓冲液和120V电压条件下电泳40min，在0.5μg/mL的溴化乙锭(EB)中染色10min，染色后于凝胶成像系统中观察。

荧光染料：LAMP反应结束后，向其产物中加入SYBR Greenl(1∶1000)2μl，1-5min后察结果。

5、结果分析：

电泳检测：在感染中国番木瓜曲叶病毒的样品中可以观察到明亮的呈弥散状的核酸泳带；

荧光染色：感染中国番木瓜曲叶病毒的样品变成绿色，而未感染样品及空白对照保持染料的橙色。