一种采用透明带溶洞法去除小鼠卵母细胞核的方法

摘要

一种采用透明带溶洞法去除小鼠卵母细胞核的方法，在塑料皿中做中心微滴和周边微滴，显微镜下用酸性台氏溶液与透明带反应，在1—6秒后使透明带上溶解出一个孔洞，至透明带变薄变软，胞质向外凸时止，吸出第1极体及周围胞质，释放卵母细胞，去核后用台盼蓝染色观察完整性，去核成功率大于99.1%。本发明的制备方法所用设备简易，在显微操作仪下即可完成去核操作；试剂成份简单，配置简单，成本低廉，操作难度低，易掌握，去核操作轻柔，机械损伤小，去核快，效率高：平均每个卵母细胞去核所用时间为1—6秒，卵母细胞的去核后存活率均在97％以上，去核成功率在99％以上；本方法适用于无Piezo实验室的小鼠核移植研究及其胚胎发育相关的早期事件研究。

说明书

技术领域

本发明涉及一种去除小鼠卵母细胞核的方法，具体的说是一种采用透明带溶洞法去除小鼠卵母细胞核的方法。

背景技术

随着生物技术的发展，哺乳动物体细胞核移植技术作为生产转基因动物、制作乳腺生物反应器、治疗性克隆等前沿领域的一个不可替代的技术平台，虽然在绵羊、牛、猪和小鼠上取得了巨大进展，但由于体细胞核移植的整个技术体系涉及众多环节，而且各个环节效率低下，最终导致体细胞克隆技术的总体效率较低，还未超过10％。通过显微操作构建重组胚是核移植研究中普遍采用的经典方法，其中卵母细胞的去核是细胞核移植中的重要步骤之一，也是能否成功完成核移植的一个重要限制因素，直接关系到核移植实验的成败。一种快速、准确的去核方法将无疑会提高核移植技术的整体效率。小鼠作为是最为常用的实验动物，然而，小鼠卵母细胞的特性与家畜(牛、羊和猪)差异很大。小鼠卵母细胞的直径相对较小，透明带薄而软，这种特性使小鼠卵母细胞在显微操作去核时难度增大。

传统的核移植技术中，主要是通过显微操作机械性去除卵母细胞中的染色质而获得受体胞质，但存在耗费时间长、对细胞损伤大等缺点，而且第1极体与核的相对位置易变动，以致去核率较低。目前，小鼠卵母细胞去核多借助Piezo装置，去核率高达99%，但这种方法需要昂贵的仪器设备，同时对研究员有很高的技术要求，大多数实验室不易实现。而且，所用针管也不能吸出极体，极体的存在将影响供体细胞和细胞质体的电融合。另外，还有化学去核法，透明带穿孔挤压去核法，透明带磨口换平口针两步去核法等。不同的去核方法有各自的优缺点，在操作时间、去核成功率、成本花费及损伤程度上有所不同。两步法操作步骤繁琐，耗费时间长，对卵母细胞产生不利影响。穿孔挤压法极易导致细胞变形，胞质散掉。而且有的去核方法技术要求很高，方法不易掌握，不利推广。

发明内容

本发明主要针对上述问题，而提供一种操作简便，消耗时间少，对细胞膜造成的损伤小，成本低廉，去核成功率高的方法。

本发明为解决上述问题，所采用的技术方案为：

步骤一：选取基础酸性台氏溶液，备用；

步骤二：酸性台氏溶液的改良：利用浓度为36%的HCl调节酸性台氏溶液的pH值，后用0.22μm的微孔滤器进行过滤，于-20℃冻存，备用；

步骤三：损伤微滴制备：在规格为35mm的塑料皿中，将皿底均等划分为四个区域，在每个区域内制作1个30μl的显微操作液微滴，称中心微滴；在每个中心微滴外周滴加2个20μl的显微操作液和1个酸性台氏溶液微滴，形成周边微滴，后上面覆盖一层矿物油；

步骤四：卵母细胞置于微滴中：取性成熟的小鼠MⅡ期的卵母细胞置于塑料皿的周边显微操作液微滴中，在体视显微镜下用吸卵针洗涤5次，放入覆盖有矿物油的中心微滴，使每个中心微滴中至少含有15个含第1极体的卵母细胞；

步骤五：调整显微操作针：将塑料皿置于倒置相差荧光显微镜的显微操作台上，将固定管和平口针安装在显微操作仪的固定杆上，调解螺旋，在倒置显微镜的视野中，观察到卵母细胞、固定管和平口针处于同一水平线的位置；

步骤六：去核：在视野中找到卵母细胞、固定管和平口针，将卵母细胞置于固定管前端，利用平口针吸取酸性台氏溶液，后将平口针移至含有卵母细胞的中心微滴中，利用平口针调整第1极体的位置，使平口针的针口位于第1极体透明带前端，使固定管、卵母细胞第一极体、平口针针口处于同一水平线位置，吹出平口针管内的酸性台氏溶液与透明带反应，至透明带变薄变软，胞质向外凸时止，打开显微镜的荧光以指示细胞核位置，回旋平口针注射器，使其产生负压，吸出第1极体及其周围的胞质，去核结束；

步骤七：去核后卵母细胞活性鉴定：将去过核的卵母细胞置于0.3%台盼蓝染色液中，染色3—4分钟，后用M₂液洗涤4—6次，在体视显微镜下查检染色情况，蓝染者判定为死亡，不着色者判定为存活。

所述的酸性台氏溶液由NaCl、KCl、CaCl₂·H₂O、MgCl₂·H₂O、葡萄糖、聚乙烯基吡咯烷酮和超纯水组成，各成份的重量百分比为NaCl 0.8％、KCl 0.02% 、CaCl₂·H₂O 0.024% 、MgCl₂·H₂O 0.01%、葡萄糖 0.1%、聚乙烯基吡咯烷酮0.4%，余量为超纯水。

所述的超纯水为去除水中的导电介质、不离解的胶体物质、气体及有机物，其电阻率大于18MΩ*cm。

所述的M₂液的主要成分为：在10ml的超纯水中加入0.5533g的NaCl, 0.0356g的KCl, 0.4969g的4-羟乙基哌嗪乙磺酸, 0.0036g的丙酮酸钠，0.261g的乳酸钠, 0.4g的牛血清白蛋白，余量为超纯水。

所述的0.3%台盼蓝染色液为称取0.03g 台盼蓝，将其溶于10ml的 M₂液中，0.22μm的微孔滤器过滤除菌，-20℃冻存备用。

所述的显微操作液为基础的M₂液添加5μg/ml的细胞松弛素B、5μg/ml Hoechst 33342、10％的胎牛血清、0.01％的聚乙烯醇。

胎牛血清应取自剖腹产的胎牛，是细胞培养中用量最大的天然培养基，含有各种血浆蛋白、多肽、脂肪、碳水化合物、生长因子、激素、无机物等细胞生长必须的营养成份，对动物细胞体外生长发育具有极为重要。

Hoechst 33342是一种可以穿透细胞膜的蓝色荧光染料，对细胞的毒性较低，常用于细胞凋亡检测，染色后用荧光显微镜观察或流式细胞仪检测。

本发明的有益效果

1. 设备简易：无需昂贵的Piezo装置，在显微操作仪下即可完成去核操作；

2. 试剂（酸性台氏溶液）成份简单：绝大部分为无机试剂，易于购买，配置简单，成本低廉；

3. 操作难度低，易掌握：只需将去核针口对准透明带，轻轻释放少许酸性台氏溶液，将其溶解出一个小孔洞，再将去核针顺势插入这个孔洞吸出极体及细胞核即可，操作难度比其它去核方法小得多，初学者就能很快掌握；

4. 去核操作轻柔，机械损伤小：在卵母细胞相对安静状态下既能完成去核损伤，克服了其它去核方法将卵母细胞挤压变形去核时对细胞骨架及细胞膜所带来的机械损伤；

5. 去核快，效率高：平均每个卵母细胞去核所用时间为1—6秒，卵母细胞的去核后存活率均在97％以上，去核成功率在99％以上；

6. 去核液细胞毒性小，缓冲能力强：去核操作在M₂液中进行，不需加入专用的去核试剂，细胞毒性小；另外，M₂液里面的缓冲成分能中和酸性台氏溶液中多余的H⁺，稳定去核过程中操作液的pH值不发生剧烈变化，从而保护卵母细胞活性免受酸碱度变化的侵害。

附图说明

图1显微操作微滴图；

图2透明带溶洞前卵母细胞图；

图3透明带溶洞后卵母细胞图；

图4去核卵母细胞图；

图5去核卵母细胞台盼蓝染色图。

具体实施方式

实施例一

步骤一：选取基础酸性台氏溶液，备用；

步骤二：酸性台氏溶液的改良：利用浓度为36%的HCl调节酸性台氏溶液的pH值为1.5，后用0.22μm的微孔滤器进行过滤，于-20℃冻存，备用；

步骤三：损伤微滴制备：在规格为35mm的塑料皿中，将皿底均等划分为四个区域，在每个区域内制作1个30μl的显微操作液微滴，称中心微滴；在每个中心微滴外周滴加2个20μl的显微操作液和1个酸性台氏溶液微滴，形成周边微滴，后上面覆盖一层矿物油；

步骤四：卵母细胞置于微滴中：取性成熟的小鼠MⅡ期的卵母细胞置于塑料皿的周边显微操作液微滴中，在体视显微镜下用吸卵针洗涤5次，放入覆盖有矿物油的中心微滴，使每个中心微滴中含有17个含第1极体的卵母细胞；

步骤五：调整显微操作针：将塑料皿置于倒置相差荧光显微镜的显微操作台上，将固定管和平口针安装在显微操作仪的固定杆上，调解螺旋，在倒置显微镜的视野中，观察到卵母细胞、固定管和平口针处于同一水平线的位置；

步骤六：在视野中找到卵母细胞、固定管和平口针，将卵母细胞置于固定管前端，利用平口针吸取pH值为1.5的酸性台氏溶液，后将平口针移至含有卵母细胞的中心微滴中，利用平口针调整第1极体的位置，使平口针的针口位于第1极体透明带前端，使固定管、卵母细胞第一极体、平口针针口处于同一水平线位置，吹出平口针管内的酸性台氏溶液与透明带反应，至透明带变薄变软，胞质向外凸时止，打开显微镜的荧光以指示细胞核位置，回旋平口针注射器，使其产生负压，吸出第1极体及其周围的胞质，去核结束；

步骤七：去核后卵母细胞活性鉴定：将去过核的卵母细胞置于0.3%台盼蓝染色液中，染色4分钟，后用M₂液洗涤6次，在体视显微镜下查检染色情况，蓝染者判定为死亡，不着色者判定为存活，去核成功率为99.8%，去核后存活率为97.3%。

实施例二

步骤一：选取基础酸性台氏溶液，备用；

步骤二：酸性台氏溶液的改良：利用浓度为36%的HCl调节酸性台氏溶液的pH值为2.0，后用0.22μm的微孔滤器进行过滤，于-20℃冻存，备用；

步骤三：损伤微滴制备：在规格为35mm的塑料皿中，将皿底均等划分为四个区域，在每个区域内制作1个30μl的显微操作液微滴，称中心微滴；在每个中心微滴外周滴加2个20μl的显微操作液和1个酸性台氏溶液微滴，形成周边微滴，后上面覆盖一层矿物油；

步骤四：卵母细胞置于微滴中：取性成熟的小鼠MⅡ期的卵母细胞置于塑料皿的周边显微操作液微滴中，在体视显微镜下用吸卵针洗涤5次，放入覆盖有矿物油的中心微滴，使每个中心微滴中含有16个含第1极体的卵母细胞；

步骤五：调整显微操作针：将塑料皿置于倒置相差荧光显微镜的显微操作台上，将固定管和平口针安装在显微操作仪的固定杆上，调解螺旋，在倒置显微镜的视野中，观察到卵母细胞、固定管和平口针处于同一水平线的位置；

步骤六：在视野中找到卵母细胞、固定管和平口针，将卵母细胞置于固定管前端，利用平口针吸取pH值为2.0的酸性台氏溶液，后将平口针移至含有卵母细胞的中心微滴中，利用平口针调整第1极体的位置，使平口针的针口位于第1极体透明带前端，使固定管、卵母细胞第一极体、平口针针口处于同一水平线位置，吹出平口针管内的酸性台氏溶液与透明带反应，至透明带变薄变软，胞质向外凸时止，打开显微镜的荧光以指示细胞核位置，回旋平口针注射器，使其产生负压，吸出第1极体及其周围的胞质，去核结束；

步骤七：去核后卵母细胞活性鉴定：将去过核的卵母细胞置于0.3%台盼蓝染色液中，染色3.5分钟，后用M₂液洗涤5次，在体视显微镜下查检染色情况，蓝染者判定为死亡，不着色者判定为存活，去核成功率为99.3%，去核后存活率为97.4%。

实施例三

步骤一：选取基础酸性台氏溶液，备用；

步骤二：酸性台氏溶液的改良：利用浓度为36%的HCl调节酸性台氏溶液的pH值为2.5，后用0.22μm的微孔滤器进行过滤，于-20℃冻存，备用；

步骤三：损伤微滴制备：在规格为35mm的塑料皿中，将皿底均等划分为四个区域，在每个区域内制作1个30μl的显微操作液微滴，称中心微滴；在每个中心微滴外周滴加2个20μl的显微操作液和1个酸性台氏溶液微滴，形成周边微滴，后上面覆盖一层矿物油；

步骤四：卵母细胞置于微滴中：取性成熟的小鼠MⅡ期的卵母细胞置于塑料皿的周边显微操作液微滴中，在体视显微镜下用吸卵针洗涤5次，放入覆盖有矿物油的中心微滴，使每个中心微滴中含有15个含第1极体的卵母细胞；

步骤五：调整显微操作针：将塑料皿置于倒置相差荧光显微镜的显微操作台上，将固定管和平口针安装在显微操作仪的固定杆上，调解螺旋，在倒置显微镜的视野中，观察到卵母细胞、固定管和平口针处于同一水平线的位置；

步骤六：在视野中找到卵母细胞、固定管和平口针，将卵母细胞置于固定管前端，利用平口针吸取pH值为2.5的酸性台氏溶液，后将平口针移至含有卵母细胞的中心微滴中，利用平口针调整第1极体的位置，使平口针的针口位于第1极体透明带前端，使固定管、卵母细胞第一极体、平口针针口处于同一水平线位置，吹出平口针管内的酸性台氏溶液与透明带反应，至透明带变薄变软，胞质向外凸时止，打开显微镜的荧光以指示细胞核位置，回旋平口针注射器，使其产生负压，吸出第1极体及其周围的胞质，去核结束；

步骤七：去核后卵母细胞活性鉴定：将去过核的卵母细胞置于0.3%台盼蓝染色液中，染色3分钟，后用M₂液洗涤4次，在体视显微镜下查检染色情况，蓝染者判定为死亡，不着色者判定为存活，去核成功率为99.1%，去核后存活率为97.2%。