玻璃化冷冻对小鼠卵母细胞透明带的影响

摘要

为了探索玻璃化冷冻对卵母细胞透明带物理特性及生化特性的影响，从中探寻玻璃化冷冻复苏后卵母细胞受精率降低的影响因素，从而为改进玻璃化冷冻方法，提高玻璃化冷冻复苏后卵母细胞受精率提供研究思路和理论依据。因此本研究选择四组应用最广泛的玻璃化冷冻保护液对小鼠卵母细胞发育进行观察，选取对卵母细胞发育能力损伤最小的玻璃化冷冻方法，观察玻璃化冷冻前后透明带物理特性及生化特性的变化，采用荧光免疫组化观察跨膜蛋白CD9在玻璃化冷冻后的损伤情况及恢复效果。结果发现:
　　1、四组冷冻保护液对小鼠卵母细胞均有低毒性作用，各组复苏存活率、受精率均显著低于对照组（P＜0.05）。此外，3组卵裂率与对照组差异显著（P＜0.05），4组囊胚率与对照组差异显著(P＜0.05)。综合各项指标，选取对卵母细胞发育能力损伤最小的1组，即配方为:HM+7.5％(DMSO+EG)，HM+15％(DMSO+EG)+0.5mol· L-1 Su，作为冷冻保护液来进行下一步的实验研究。
　　2、在显微镜下，通过Hoffman系统观察记录冷冻组、暴露组和对照组中卵母细胞各观测点透明带厚度数值，并根据公式计算出各组卵母细胞透明带厚度和厚度变量。经统计分析发现，冷冻组透明带厚度（6.05μm）显著高于对照组（5.77μm）(P＜0.05)，其余各组间无显著性差异;透明带厚度变量各组间差异不显著。结果表明，玻璃化冷冻对卵母细胞透明带厚度有影响，对卵母细胞透明带厚度变量影响不大。
　　3、在偏振光显微镜下，通过OCTAX Polar AIDE系统得到各组实时显示的双折射分值。经统计分析得知，冷冻组双折射分值(0.3)和对照组(1.22)相比差异显著(P＜0.05)、与暴露组(2.02)之间差异显著(P＜0.05)，暴露组和对照组无显著差异。结果表明，玻璃化冷冻显著降低了卵母细胞透明带双折射分值。
　　4、对透明带厚度、厚度变量和双折射分值间相关性进行分析，结果表明，透明带厚度和双折射分值间显著相关。因此，在条件不足的情况下，可通过测量透明带厚度体现双折射分值所指示的结果。
　　5、对相同数量冷冻组、暴露组和对照组卵母细胞透明带提取物进行蛋白质浓度（BCA法）及可溶性糖浓度（硫酸-苯酚法）测定。冷冻组蛋白浓度为0.218mg·mL-1与对照组(0.239mg·mL-1)相比、与暴露组(0.223mg·mL-1)相比差异都不显著。冷冻组可溶性糖含量为0.041mg·mL-1，显著高于对照组(0.008mg·mL-1)和暴露组(0.018mg·mL-1)（P＜0.05）。结果显示，玻璃化冷冻对卵母细胞透明带中蛋白质含量影响不大;玻璃化冷冻对透明带中可溶性糖含量有显著影响。
　　6、通过荧光免疫组化，观察冷冻组、暴露组和对照组卵母细胞跨膜蛋白CD9表达情况。结果发现，冷冻组Ⅰ级细胞数明显减少，并且出现Ⅳ级细胞。玻璃化冷冻会显著减少卵母细胞表面CD9蛋白的表达（P＜0.05）。在加了IBMX培养基中延长培养（恢复组）中CD9表达情况，与冷冻组相比，培养对照组和恢复组中Ⅰ级细胞数均明显增多，各组间均有显著差异（P＜0.05）。可见，卵母细胞玻璃化冷冻复苏后，可通过延长培养使得CD9表达有所恢复，而经过添加IBMX的培养基延长培养CD9表达恢复效果更为显著。

目录

声明

摘要

缩写表Abbreviations

第一章 透明带及卵母细胞玻璃化冷冻研究概况

1 透明带的相关研究

1．1 透明带的结构

1．2 透明带的功能

1．3 与胚胎发育潜力相关的透明带特性

2 卵母细胞的冷冻保存

2．1 玻璃化冷冻的原理

2．2 玻璃化冷冻保护剂

2．3 玻璃化冷冻载体

2．4 玻璃化冷冻对卵母细胞的影响

3 四次跨膜蛋白CD9

3．1 四次跨膜蛋白家族

3．2 CD9和精卵融合

4 本研究的意义和目的

第二章 不同玻璃化冷冻保护液对冷冻卵母细胞的影响

1 材料与方法

1．1 试验材料

1．2 试验方法

1．3 试验设计

1．4 数据分析

2 结果

3 讨论

第三章 玻璃化冷冻对卵母细胞透明带厚度和双折射分值的影响

1 材料与方法

1．1 试验材料

1．2 试验方法

1．3 试验设计

1．4 数据分析

2 结果

2．1 玻璃化冷冻对卵母细胞透明带厚度和厚度变量的影响

2．2 玻璃化冷冻对卵母细胞透明带双折射分值的影响

2．3 卵母细胞透明带厚度、厚度变量和双折射分值之间的相关性

3 讨论

第四章 玻璃化冷冻对卵母细胞透明带蛋白和糖含量的影响

1 材料与方法

1．1 试验材料

1．2 试验方法

1．3 试验设计

1．4 数据分析

2 结果

2．1 玻璃化冷冻对卵母细胞透明带提取物蛋白浓度的影响

2．2 玻璃化冷冻对卵母细胞透明带提取物可溶性糖浓度的影响

3 讨论

第五章 玻璃化冷冻对卵母细胞跨膜蛋白CD9的影响及恢复

1 材料与方法

1．1 试验材料

1．2 试验方法

1．3 试验设计

1．4 数据分析

2 结果

2．1 玻璃化冷冻对卵母细胞跨膜蛋白CD9的影响

2．2 玻璃化冷冻卵母细胞跨膜蛋白CD9表达恢复

3 讨论

第六章 结论

参考文献

图片与说明

致谢

作者简介

攻读学位期间发表论文情况